资源描述
单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,整理版ppt,*,免疫球蛋白免疫球蛋白编码基因基因工程抗体,南京医科大学,微生物学与免疫学系,卢 春,1,整理版ppt,免疫球蛋白免疫球蛋白编码基因基因工程抗体南京医科大学1整,概述,1、免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)：,1968和1972年WHO和国际免疫学会决定，将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白称为免疫球蛋白。,2、抗体(antibody, Ab)：,B淋巴细胞在有效的抗原刺激下分化为浆细胞，产生具有与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白，这类免疫球蛋白称为抗体。,3、 Ig与Ab的区别和联系：,Ig是化学结构上的概念； Ab是生物学功能上的概念；所有的Ab都属于 Ig；并非所有的Ig 都具有Ab 的活性。,2,整理版ppt, 概述2整理版ppt,免疫球蛋白的基本结构,1、Ig的组成：,由4条肽链通过链间S-S双硫键连接而成，其中两条分子量较大的链称重链（Heavy chain，H链），两条分子量较小链的称轻链（Light chain，L链）。,2、H链：,据氨基酸（aa）组成及序列的差异（抗原性）将H链分为5,类，,、 、 、 、 ,链；,其分别对应于，IgA、IgD、IgE、IgG、IgM五类Ig。,第一节,免疫球蛋白的结构和功能,3,整理版ppt, 免疫球蛋白的基本结构1、Ig的组成：由4条肽链通过,C,H1,V,L,C,L,V,H,C,H2,C,H3,Hinge Region,Carbohydrate,Disulfide bond,Immunoglobulin Structure,4,整理版ppt,CH1VLCLVHCH2 CH3Hinge RegionCa,3、L链：,据aa组成及序列的差异将L链分为,2型，、型， ：为2：1（人）。,天然Ig单体中，两条,重链是同类的，,两条,轻链是同型的。,4、Ig的分区：,（1）可变区：,在Ig近N端,L链的1/2和H链的1/4（,、,）或1/5（,、,）范围内，因aa组成及序列变化较大，故称,可变区（Variable region，V区）。,（2）恒定区：,在Ig近C端,L链的1/2和H链的3/4（,、,）或4/5（,、,）范围内，因aa组成及序列变化相对稳定故称,恒定区（Constant region，C区）。,5,整理版ppt,3、L链：据aa组成及序列的差异将L链分为2型，、型，,C,H1,V,L,C,L,V,H,C,H2,C,H3,Hinge Region,Carbohydrate,Disulfide bond,Immunoglobulin Structure,6,整理版ppt,CH1VLCLVHCH2 CH3Hinge RegionCa,5、,Ig的结构域又称功能区(,Domain,)：,（1）VH、VL：,超变区,（HVR1、2 、,3）,、互补性决定区,（CDR1、CDR2、CDR3）,，又称Ig独特型决定簇,（Idiotype）;,7,整理版ppt,5、Ig的结构域又称功能区(Domain)：7整理版ppt,（2）CH1、CL：,是各类、亚类、型、亚型Ig遗传标记,所在部位;,（3）IgG的CH2：,补体C1q的结合位点； IgG 借助,CH2通过胎盘，发挥被动免疫作用；,（4）CH3：,IgG的CH3与中性粒、巨噬细胞表面表达的,Fc,R结合，完成免疫调理作用；,与NK细胞,表面表达的Fc,RIII结合，完成ADCC作用；,（5）,IgE的CH4：,IgE的,CH4与肥大和嗜碱性粒细胞表,面表达的Fc,R结合，完成I型超敏反,应；,（6）绞,链区（Hinge region）：,T,Y,8,整理版ppt,（2）CH1、CL：是各类、亚类、型、亚型Ig遗传标记8整理,C,H1,V,L,C,L,V,H,C,H2,C,H3,Hinge Region,Carbohydrate,Disulfide bond,Immunoglobulin Structure,9,整理版ppt,CH1VLCLVHCH2 CH3Hinge RegionCa,Fab（,Fragment of antigen-binding,）,Ag binding,Valence = 1,Specificity determined by VH and VL,Papain,Fc,Fab,Fc（,Crystalizable fragment,）,Effector functions,6、,Ig的水解片段,(木瓜蛋白酶),10,整理版ppt,Fab（Fragment of antigen-bindin,F(ab),2,Ag binding,Valence =2,pFc,No effector functions,Pepsin,pFc Peptides,F(ab),2,6、,Ig的水解片段,(胃蛋白酶),11,整理版ppt,F(ab)2PepsinpFc PeptidesF(ab,12,整理版ppt,12整理版ppt,7、,Ig的其他成分,（1）J链 ：（joining chain）,由浆细胞合成，功能是将,单体Ig分子连接为多聚体。如2个IgA单体形,成二聚体；5个IgM单体是形成五聚体。,13,整理版ppt,7、Ig的其他成分（1）J链 ：（joining chain,7、,Ig的其他成分,（2）分泌片 ：（secretory piece, SP）,由黏膜上皮细胞,合成和分泌，功能是保护分泌型IgA或,的 IgM铰链区免受蛋白酶的降解。,14,整理版ppt,7、Ig的其他成分（2）分泌片 ：（secretory pi, 五类Ig的特点,15,整理版ppt, 五类Ig的特点15整理版ppt, Ig的生物学活性,1、特异性结合抗原,2、激活补体,3、与细胞Fc受体结合发挥生物效应,（1）免疫调理作用,（2）ADCC,（3）介导,I型超敏反应,（4）人IgG的Fc段与SPA结合,4、选择性传递,16,整理版ppt, Ig的生物学活性1、特异性结合抗原16整理版ppt,17,整理版ppt,17整理版ppt,Ab的生物学活性,18,整理版ppt,Ab的生物学活性18整理版ppt,第二节,免疫球蛋白编码基因和抗体的多样性,概述,人类B淋巴细胞存在三个编码Ig的基因库，即重链H基因库及,轻链,、 基因库，它们分别,位于第14、,2及22号染色体上。,19,整理版ppt,第二节 免疫球蛋白编码基因和抗体的多样性 概述,一、胚系B细胞中Ig,轻链基因的结构,由3个基因所编码：V基因、J基因编码可变区；C基因编码恒定区，即V-J-C。,20,整理版ppt,一、胚系B细胞中Ig轻链基因的结构 由3个基因,（一） ,链基因结构,1、 V：,V基因节段有90个，呈簇状串联排列（V1Vn，n=90），其中含30个假基因（指无功能性表达或只表达无功能产物的缺陷基因，但它可通过突变、置换及重排形成新的功能性基因，为可变区的多样性提供后备基因）。V编码V区110aa中的196aa；,21,整理版ppt,（一） 链基因结构1、 V：V基因节段有90个，呈簇状,2、L序列：,每个,V,前都有一个,L,序列（,Leader,），编码产物为前导肽，对轻链蛋白合成至关重要；,3、J：,位于,V,下游，也呈串联排列，含,5,个基因节段，编码,V,区,110aa,中的,97,110aa,；,4、C ：,只含单个外显子，编码C区蛋白。,22,整理版ppt,2、L序列：每个V前都有一个L序列（Leader），编码产,（二） ,链基因结构,1、V：,V基因节段有60个，呈簇状串联排列（V 1Vn，n=60），其中含30个假基因 ；,2、L序列：,每个V前都有一个L序列（Leader），编码产物为前导肽，对轻链蛋白合成至关重要；,23,整理版ppt,（二） 链基因结构1、V：V基因节段有60个，呈簇状,3、J1C1，J2C2J7C7：,C1C7代表各个亚型链的基因节段，其中含4个功能基因节段和3个假基因。,24,整理版ppt,3、J1C1，J2C2J7C7：C,二、胚系B细胞中Ig重链基因的结构,由四个基因所编码：V基因、D基因、J基因编码可变区；C基因编码恒定区，即V-D-J-C。,25,整理版ppt,二、胚系B细胞中Ig重链基因的结构 由四个基,（一）,重链V区基因,1、VH：,VH基因节段有95个，成簇状串联排列（VH1VHn，n=95），其中含45个假基因。每个VH前都有一个L序列（Leader），其作用是在合成重链时将重链固定在粗面内质网膜上。LnVHn编码疏水前导肽和CDR1及CDR2；,C,DH(1-23),26,整理版ppt,（一）重链V区基因 1、VH：VH基因节段有95个，成簇状串,2、DH，JH：,DH有23个节段，成簇状串联排列；JH有9个节段，其中6个功能基因和3个伪基因。DHJH编码CDR3，JH编码可变区的骨架部分（Framework region）。,C,DH(1-23),27,整理版ppt,2、DH，JH：DH有23个节段，成簇状串联排列；JH有9个,（二）,重链C区基因,1、CH：,CH基因节段在染色体上的排列顺序与其编码的Ig在体内成熟的顺序相似，分别是CC C3C1C1C2C4CC2。除C 以外，其他CH基因节段都有一个转换区（Switch region，S区），其作用是控制Ig类型转换；,C,DH(1-23),28,整理版ppt,（二）重链C区基因 1、CH：CH基因节段在染色体上的排列顺,2、控制膜结合或分泌型Ig的基因：,每个CH基因节段后分别排列着S和M两基因，S即分泌型，M即膜结合型，如CSM、C S M 。,C,DH(1-23),29,整理版ppt,2、控制膜结合或分泌型Ig的基因：每个CH基因节段后分别排列,三、B细胞分化过程中的基因重排,1、基因重排定义：,在B细胞分化和发育过程中，一部分基因节段互相接近、重新排列，形成功能性的免疫球蛋白基因单位，此过程称,基因重排,（Gene Rearrangement）。功能性的免疫球蛋白基因单位进行转录，经转录后的加工，再表达为免疫球蛋白。,30,整理版ppt,三、B细胞分化过程中的基因重排 30整理版p,2、可变区的基因重排：,（1）重链可变区的基因重排：,选择一个DH与一个JH节段连接（DHJH），再选择一个VH与DHJH相连，一旦VHDHJH重排成功且得到功能性表达，其产物就会抑制另一条染色体上等位基因重排，此现象称为等位基因排除。其产物同时启动轻链可变区的基因重排；,C,DH(1-23),31,整理版ppt,2、可变区的基因重排：CDH(1-23)31整理版ppt,（2）轻链可变区的基因重排：,链基因优于链基因重排。选择一个V与一个J节段连接VJ，其产物就会发生等位基因排除，同时也会抑制链基因重排，称为同型排除。当两条染色体上的链基因重排都失败时，才会启动链基因重排。两条染色体上的VH基因都是无产物重排，或基因和基因都是无产物重排，细胞凋亡（Apoptosis）。,32,整理版ppt,32整理版ppt,（3） 可变区的基因重排12,23规律和重组酶的作用：,可变区的基因重排受基因节段侧面的重组信号序列（RSS）控制，遵循1223规律且与DNA损伤修复系统有关。,33,整理版ppt,（3） 可变区的基因重排1223规律和重组酶的作用：可变区,（4）重链类型转换,：,每个CH（C除外）前都含一个S区（短的串联重复序列），S区与重链类型转换有关。,在B细胞分化过程中,，V-D-J的重排及其与C的连接是不依赖抗原刺激，重排的V-D-J与C和C连接，经转录加工，此时在B细胞表面表达mIgM和/或mIgD。,成熟的B细胞在抗原刺激下,， B细胞在分泌IgM和/或IgD的同时，V-D-J从与C基因连接转换到与C或C或C的连接，完成了类型转换。,C,DH(1-23),34,整理版ppt,CDH(1-23)34整理版ppt,2、Ig的多样性：,（1） 组合性连接：,重链的V-D-J连接（95个V基因、23个D基因，9个J基因）；轻链的V-J-C（90个V基因、5个J基因、一个C基因；60个V基因、7个J基因和C基因）；,（2） 接合多样性：,发生在D-J、V-D-J、V-J连接时，1密码子错位；2框架（ORF）移位；3N-序列插入；,（3） 体细胞突变：,体细胞突变也可以产生Ig的多样性。,35,整理版ppt,2、Ig的多样性：35整理版ppt,3、重排过程,36,整理版ppt,3、重排过程36整理版ppt,第三节,基因工程抗体,（Genetic Engineering Antibody）,概述,单克隆抗体(McAb)在临床疾病诊断和治疗中已发挥了很大的作用，但以下几点限制了抗体的导向治疗：,（1）鼠源性McAb在人体内易诱导免疫应答；,（2）人的McAb制备甚为困难。,37,整理版ppt,第三节 基因工程抗体 概述 单克隆抗体(,一、嵌合抗体,（Chimeric Antibody）,原理：,保留鼠Ig可变区部分，将其恒定区用人Ig取代。,方法：,PCR克隆,鼠,可变区基因和,人,恒定区基因，,将两,基因连接，并插入原核或真核表达载体中，并,导入大肠杆菌或转染真核细胞，就可表达出嵌,合抗体分子。,优点：,亲和力保持良好。,缺点：,含鼠Ig可变区的异源性，仍,易诱导人免疫应答,。,38,整理版ppt,一、嵌合抗体（Chimeric Antibody）,原理：,仅保留鼠Ig可变区,CDR,部分，将Ig其它区域都,用人Ig取代。,方法：,CDR序列的获得通常采用PCR技术。,优点：,大大降低了鼠抗体的免疫原性。,缺点：,亲和力不佳。,二、CDR移植抗体,（CDR Grafting Antibody）,又称重构抗体或改形抗体（Reshaped Antibody）,39,整理版ppt,二、CDR移植抗体（CDR Graftin,原理：,将鼠Ig Fv中的VH和VL两肽链用不同的连接物,连接成一条多肽链，称为单链抗体（ScFv）；,将两个相同或不同特异性的ScFv连接在一个分,子上，就获得了双价ScFv。,方法：,DNA重组技术；共价或非共价交连。,优点：,亲和力保持良好，可针对2个不同的抗原表位。,缺点：,容易解离或被组织酶解。,三、,单链抗体（ScFv）和,双价,Sc,Fv,40,整理版ppt,三、单链抗体（ScFv）和双价ScFv40,原理：,将鼠Ig Fab基因片段与丝状噬菌体FUSE5载体连接，产,物转化大肠杆菌，使Fab与噬菌体外壳蛋白基因III以融,合蛋白表达的形式表达在丝状噬菌体表面，构建成噬菌,体表面肽库（Phage peptide library display）；再用特,异性抗原对该肽库进行筛选，获得具有高度抗原亲和力,的 Fab，最后进行体外重建。,方法：,DNA重组技术；ELISA。,优点：,亲和力保持良好。,缺点：,容易解离或被组织酶解。,四、噬菌体肽库技术构建抗体片段,41,整理版ppt,四、噬菌体肽库技术构建抗体片段41整理版p,Thanks!,42,整理版ppt,Thanks!42整理版ppt,
展开阅读全文