医学分子生物学新技术应用课件

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics,*,分子生物学新技术及其应用,分子生物学新技术及其应用,1,代谢组学及研究技术,microRNA的研究及应用,免疫共沉淀技术Co-Immunoprecipitation,4. 胞内RNA分子可视技术,代谢组学及研究技术,2,第一节 代谢组学及其研究进展,什么是代谢组学？,代谢组学研究方法,代谢组学分析技术,气相色谱-质谱联用技术GC-MS,液相色谱-质谱联用技术LC-MS,毛细管电泳-质谱联用技术CE-MS,核磁共振技术NMR,第一节 代谢组学及其研究进展什么是代谢组学？,3,代谢组学研究什么？,生物体系细胞、组织或生物体,代谢产物发生变化种类，随时间变化,特定基因突变,环境变化,生物体系,代谢组学研究对象,代谢组学研究什么？生物体系细胞、组织或生物体特定基因突,4,体内各种物质代谢过程互相联系形成一个整体,糖类,脂类,蛋白质,水,无机盐,维生素,各种物质代谢之间互有联系，相互依存。,消化吸收,中间代谢,废物排泄,体内各种物质代谢过程互相联系形成一个整体 糖类 脂类蛋白质,5,医学分子生物学新技术应用课件,6,机体物质代谢不断受到精细调节,机体有精细的调节机制，调节代谢的强度、方向和速度,内外环境的变化,对机体代谢造成影响,适应环境的变化,精细的调节控制,机体物质代谢不断受到精细调节机体有精细的调节机制，调节代谢的,7,代谢组(metabolome)是指一个细胞、组织或器官中所有代谢物的集合, 包含一系列不同化学型的分子, 比方肽、碳水化合物、脂类、核酸以及异源物质的催化产物等。,代谢组学(metabonomicsmetabolomics)来源于代谢组一词,是研究一个细胞、组织或器官中所有小分子代谢组分集合的科学。代谢组学研究的目的是定量分析一个生物系统内所有代谢物的含量。,代谢组(metabolome)是指一个细胞、组织或器,8,代谢组学分析可以指示细胞、组织或器官的生化状态, 协助阐释新基因或未知功能基因的功能, 并且可以提醒生物各代谢网络间的关联性, 帮助人们更系统地认识生物体。进展代谢组学研究涉及生命科学、分析科学以及化学统计学三大方面的专业知识。,代谢物化学分析技术及数据分析技术的开展极大促进了诸多生物、医学问题的研究, 这些知识的综合运用使得代谢组研究在疾病诊断、药理研究以及临床前毒理等研究中发挥了极为重要的作用。,代谢组学分析可以指示细胞、组织或器官的生化状态, 协助阐,9,普遍定义,代谢组学：通过考察生物体系细胞、组织或生物体受刺激或扰动后如将某个特定的基因变异或环境变化后，其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的一门科学。,研究对象：相对分子质量小于1000的内源性小分子。,代谢物小分子类别：多肽、氨基酸及其衍生物、胺、脂类、金属离子。,普遍定义代谢组学：通过考察生物体系细胞、组织或生物体受刺,10,特点,1.关注于内源性小分子化合物。,2.对生物体系中的小分子化合物进展定性定量研究,3.内源性小分子化合物的上调和下调指示了与疾病、毒性、基因修饰或环境因子的影响。,4.内源性化合物的特点用来表征疾病和药物筛选。,特点1.关注于内源性小分子化合物。,11,代谢组学的开展,1982,1983,1984,1989,1999,2000,2001,2002,2007,Van De Greef,:,publication of MS for urine profiling,Sadler, Buckingham and Nicholson:,First publication on,1,H-NMR of blood and plasma,Nicholson, et al.:,Multi-component analysis of spectra data from rat urine,Nicholson and Wilson:,NMR spectroscopy of biofluids,Nicholson:,Definition of Metabonomics,Haselden, et al.:,First independent Pharma publication of Metabonomics,Nicholson, Lindon, and Holmes:,Publication in Nature on Metabonomics,Holmes and Antti,Explanation of statistics in Metabonomics,Increasing # of publications,代谢组学的开展19821983198419891999200,12,研究方法,研究步骤：,生物组织，体液经,灭活预处理,多个方法联用,研究方法研究步骤：生物组织，体液经多个方法联用,13,应用,药物研发,疾病研究,植物代谢组学,微生物代谢组学,中药现代化,应用药物研发,14,连接图数据库 Connections Map DB,京都基因与基因组百科全书 KEGG,(),生物化学途径 ExPASy,互联网主要代谢途径 main metabolic pathways on Internert, MMP,Duke 博士植物化学和民族植物学数据库,Arizona 大学天然数据库,Wiley_handbook of gc-ms,新药及其代谢产物质谱库,“肿瘤代谢组数据库,Pubmed 化合物数据库,NIST质谱数据库,一些有用的数据库：,连接图数据库 Connections Map DB一些有用的,15,代谢组学分析技术,气相色谱-质谱联用技术GC-MS),液相色谱-质谱联用技术 LC-MS),毛细管电泳-质谱联用技术 CE-MS),核磁共振技术 NMR,代谢组学分析技术气相色谱-质谱联用技术GC-MS),16,分析技术,1.气相色谱-质谱联用技术GC-MS,工作原理：,气相色谱仪,接口,质谱仪,常压,高真空,离子源,质量分析器,检测器,分析技术1.气相色谱-质谱联用技术GC-MS 气相色谱仪,17,质谱仪的根本构造及工作流程,质谱仪的根本构造及工作流程,18,几种新的,GC-MS,技术,全二维气相色谱质谱技术GCGC-TOFMS,气化室,检测器,色谱柱,1,色谱柱,2,调制器,几种新的GC-MS技术全二维气相色谱质谱技术GCGC-T,19,研究实例,用Leco ChromaTOF soft ware得到的质荷比为73m/z的离子碎片典型GCGC-TOFMS二维血浆色谱图Analytica Chimica Acta，2021，633，257-262,大连化物所许国旺教授分析确定,5,种糖尿病病源标记物：葡萄糖、,2-,羟基异丁酸、亚麻油酸、软脂酸、磷酸。 脂肪酸代谢紊乱,研究实例用Leco ChromaTOF soft ware得,20,GC-MS,适用于挥发性的代谢物。对于非挥发性代谢物的分析需要经过化学衍生。,多用于环境分析、大气有毒气体分析、某些疾病诊断等。,GC-MS 适用于挥发性的代谢物。对于非挥发性代谢物的分析需,21,2.液相色谱-质谱联用技术LC-MS,LC工作原理：,2.液相色谱-质谱联用技术LC-MS,22,液相色谱,-,质谱联用的新技术,4000Q Trap LC/MS/MS,液相色谱-质谱联用的新技术4000Q Trap LC/MS/,23,高效液相色谱系统配合液相质谱系统。安康和慢性乙肝病人的血清样本。,使用PLS-DA处理代谢数据正常组和慢性乙肝组对照Journal of Proteome Research, 2006, 5, 554-561,高效液相色谱系统配合液相质谱系统。安康和慢性乙肝病人的血清样,24,新型液相色谱技术,UPLC,新型超高液相色谱仪,HPLC,色谱柱填料颗粒：,3,、,5m,UPLC色谱柱填料颗粒：,别离能力得到空前提高,新型液相色谱技术UPLC新型超高液相色谱仪HPLC色谱柱填料,25,比较aHPLC和bUPLC用于美沙芬的代谢物TOP质谱全扫描Rapid Commun Mass Spectrom, 2005, 19, 843,比较aHPLC和bUPLC用于美沙芬的代谢物,26,UPLC,在代谢组学中的研究优势,UPLC相对于传统的HPLC有更好的别离效率、峰容量、及灵敏度，提供更适合与质谱联用的接口，有助于检出更多的代谢物。,提高方法通量、灵敏度，改善与质谱联用的定性定量结果。,UPLC与质谱联用为代谢组学研究提供更加高效、灵敏的研究平台。,UPLC在代谢组学中的研究优势UPLC相对于传统的HPLC有,27,毛细管电泳-质谱联用技术CE-MS,代谢组学研究的生物样品中包含多种离子性代谢物糖酵解代谢产物、三羧酸循环代谢物、如羧酸、磷酸化糖；以及核苷酸、氨基酸、辅酶等代谢物。,毛细管电泳是以毛细管为别离通道、采用高压直流电场为驱动力的的新型液相别离技术，通过离子化合物的质荷比m/z不同造成迁移速率不同来实现别离。,适用于普通反相色谱柱不易保存的离子性代谢物的别离分析。,毛细管电泳-质谱联用技术CE-MS代谢组学研究的生物样品,28,毛细管电泳-质谱联用分析仪兰州理工大学型号： P/ACE MDQ-Deca XP plus 厂家：美国 Beckan Coulter-Finnigan,毛细管电泳-质谱联用分析仪兰州理工大学型号： P/AC,29,NMR,基于具有自旋性质的原子核在核外磁场的作用下，吸收射频辐射而产生的能级跃迁谱学，主要用于反映化合物构造中的H和C原子的位置信息。,1H-NMR：在排除杂质及水峰的干扰下，1H-NMR的谱峰与样品中的化合物的氢原子是一一对应的。所测的样品中的每一个氢在谱图中都有唯一的谱峰与之相对应。图谱中信号的强弱那么反映出样品中各组分相对含量的关系，适用于研究代谢产物。,NMR基于具有自旋性质的原子核在核外磁场的作用下，吸收射,30,医学分子生物学新技术应用课件,31,核磁共振,电子云：,基于具有自旋性质的原子核在核外磁场的作用下，吸收射频辐射而产生的能级跃迁谱学。主要用于反响化合物构造中的H和C原子的位置信息。,核磁共振电子云：基于具有自旋性质的原子核在核外磁场的作用下，,32,hr-MAS of biological tissue,一样强度,Lipid,CH,2,-CO,Lipid,CH,2,-C=C,Lipid,CH,2,-CH,2,-CO,Lipid,CH,2,Lipid,CH,3,Citrate,Lactate,Alanine,放大,人前列腺组织prostate tissu良性 vs. 恶性,癌症组织给出更多的脂类物含量lipid ！,hr-MAS of biological tissue一样强,33,代谢组学研究一般包括四个步骤：,第一步，给予生物体一定的刺激。,第二步，代谢组数据的采集。用核磁共振、质谱、色谱等分析手段测定其中代谢物的种类、含量和状态以及其变化。,第三步，建立表征代谢特征的时空模型。在代谢组学中最常用的建模方法是主成分分析(Principle Components Analysis, PCA)。,第四步，建立代谢物时空变化与生物体特性的关系，到达从不同层次和水平上阐述生物体对相应刺激的响应的目的。,代谢组学研究一般包括四个步骤：第三步，建立表征代谢特征的时空,34,microRNA,的研究与应用,microRNA 的研究与应用,35,10.1.1,概述,10.1.2. microRNA,的分子生物学研究方法,10.1.3 microRNA,的实验技术,10.1.4 microRNA,与疾病,内容构造,10.1.1 概述内容构造,36,概述,miRNA是由2125个核苷酸组成的非编码RNA；,它通过与靶基因的3-UTR的配对，促进mRNA的降解或抑制mRNA的翻译从而抑制其靶基因的表达；,它在生物体生长发育、细胞增殖、分化、凋亡以及人类各种疾病的发生开展过程中发挥重要的调控作用。,?,什么是,miRNA,？,概述 miRNA是由2125个核苷酸组成的非编码RNA；?,37,概述,MicroRNA,的发现,lin-4: Lee等人于1993年在线虫中通过胚胎发育时间控制缺陷性遗传筛选实验中发现，是第一个被发现的miRNA。,lin-4在L1,L2阶段大量表达，如缺失，那么导致幼虫发育停顿。,L1,L2,L3,L4,L1L4,，线虫发育的四个不同阶段,概述 MicroRNA的发现 L1 L2,38,let-7: Rinhart,等人于,2000,年在线虫发现第二个,miRNA,，,let-7,。,let-7,在,L3,L4,阶段大量表达，控制幼虫的,L4,阶段向成虫阶段发育转换。,L1L4,，线虫发育的四个不同阶段,L1,L2,L3,L4,概述,MicroRNA,的发现,L1L4，线虫发育的四个不同阶段 L1 L2,39,MicroRNA,的起源与生物合成过程,1. miRNA,基因被转录成,pri-miRNA (RNA,聚合酶,),；,2. pri-miRNA,被剪切成具有,70-100,个核苷 酸 的,pre-miRNA (Drosha,DGCR8),；,3. pre-miRNA,从核内被转移至胞质,(Exportin-5, Ran-GTP),；,4. pre-miRNA,被剪切成,21-25,个核苷酸的双链,RNA,双体,(Dicer,TRBP,PACT),；,5.,双链,RNA,双体中成熟,miRNA,链会选择性整合入,RISC,并与,mRNA,互补配对,。,MicroRNA的起源与生物合成过程1. miRNA基因被转,40,MicroRNA,的起源与生物合成过程,microRNA gene,Pol ,Drosha/DGCR8,Pri-miRNA,Pre-miRNA,Cytoplasm,Dicer/TRBP/PACT,duplex intermediate,RISC,mature miRNA,miRNA biogenesis,Nucleus,Exportin-5/,Ran-GTP,MicroRNA的起源与生物合成过程microRNA gen,41,miRNA与siRNA的性质比较,miRNA,siRNA,相同点,长度及特征,分子量约,22nt,，,5,端是磷酸基，,3,端是羟基,合成的底物,均由双链,RNA,或,RNA,前体加工而来,Dicer,酶,依赖,Dicer,酶并具有,Dicer,加工产物的特征,Argonaute,家族蛋白,均需,Argonaute,家族蛋白参与,RISC,均为,RISC,组分，在介导沉默机制上有相似之处,作用方式,均可抑制靶基因翻译或导致,mRNA,降解,进化关系,两种假设：,siRNA,是,miRNA,的补充；,miRNA,在进化过程中替代了,siRNA,引自 方福德, microRNA的研究方法与应用, 中国协和医科大学出版社, 2021,miRNA与siRNA的性质比较 m,42,miRNA,siRNA,不同点,机制性质,是生物体正常的调控机制,往往是外源引起,直接来源,发夹状,pre-miRNA,长链,dsRNA,分子结构,单链,RNA,双链,RNA,，,3,端有,2,个非配对碱基,对靶基因,mRNA,特异性,较低，一个突变不影响,miRNA,的抑制作用,较高，一个突变容易引起,RNAi,沉默效应的改变,作用方式,miRNA,途径,RNAi,互补性,不完全互补，存在错配现象,一般要求完全互补,生物学功能,对机体的生长发育有重要作用,抗病毒的防御机制；沉默过表达的,mRNA,；保护基因组免受转座子侵入,重要特性,高度的保守性、时序性和组织特异性,高度特异性,续表,1,miRNA,43,miRNA,siRNA,不同点,作用机制,通过与,miRNP,核蛋白体复合物结合，识别靶基因,mRNA,，并与之部分互补，从而抑制其翻译。在动物中，成熟的,miRNA,与蛋白质复合物,miRNP,结合，引导这种复合物通过部分互补结合,mRNA 3-UTR,，从而抑制其翻译。,miRNA,也可切割完全互补的,mRNA,渗入,RISC,中，引导复合物与,mRNA,完全互补，通过其自身的解旋酶活性，解开,siRNA,，通过反义,siRNA,链识别目的,mRNA,，通过内切酶活性切割目的片段，再通过细胞外切酶进一步降解目的片段。,siRNA,也可以抑制具有短片段互补性的,mRNA,翻译,加工过程,不对称加工，仅剪切,pre-miRNA,一个侧臂，其他部分降解,对称地剪切来源于双链,RNA,前体的两个侧臂,对,RNA,的影响,与,mRNA,的稳定性无关,影响,mRNA,的稳定性,作用位置,作用于靶基因,3-UTR,作用于,mRNA,的任何部位,生物学意义,主要在发育过程中发挥作用，调节内源性基因的表达,不参与生物发育，是,RNAi,的产物，原始作用是抑制转座子活性与抵御病毒感染,续表,2,miRNA,44,MicroRNA,的鉴定,正向遗传学的突变筛查方法最初几个miRNA分子的发现；效率不高；,cDNA克隆技术有优势也有缺乏；,生物信息学预测方法 是实验预测方法有益和必要的补充；目前两个最主要的miRNA基因预测工具：MiRscan和miRseeker,当然计算机预测的miRNA必须经过RT-PCR或Northern试验分析才能鉴定,MicroRNA的鉴定 正向遗传学的突变筛查方法最初几个m,45,MicroRNA,的特征,广泛存在于真核生物中,是一类内源性表达的非编码短序列,RNA,本身不具有开放阅读框,(ORF),；,成熟的,miRNA,长度通常为,21,25nt,；,miRNA,在进化上具有高度保守性；,miRNA,表达具有细胞和组织特异性，同时具有时序性,如拟南芥中的,miR-171,仅在其花序中高水平表达，在某些组织低水平表达，在茎、叶等组织中却无任何表达的迹象；,20-24h,的果蝇胚胎提取物中可发现,miR-12,，却找不到,miR3-miR6,，在成年果蝇中表达的,miR-1,和,let-7,也无法在果蝇胚胎中表达,MicroRNA的特征广泛存在于真核生物中, 是一类内源性表,46,MicroRNA,的功能,miRNA,通过基因的转录后调控过程参与了生命体的发生、生长、发育、分化和死亡的各个过程。,如线虫幼虫发育阶段的转换，哺乳动物的造血分化，脂类代谢，激素分泌，癌症，糖尿病，白血病以及病毒感染等。,MicroRNA的功能miRNA通过基因的转录后调控过程参与,47,miRNA,靶基因 功能作用,lin-4 lin-14, lin-28,线虫早期时序发育,let-7 lin-41, RAS,线虫晚期时序发育,lsy-6 Cog-1,线虫神经系统发育,mir-273 Die-1,线虫神经系统发育,bantam Hid,果蝇细胞凋亡,mir-14,未知 果蝇细胞凋亡及脂类代谢,mir-430,未知 斑马鱼神经发育,mir-181,未知 小鼠,B,淋巴细胞分化,mir-375 Mtpn,小鼠胰岛素分泌,mir-15/16 BCL-2,人,B,淋巴细胞慢性白血病,mir-155,未知 人弥散性大,B,淋巴瘤,mir-17-92 E2F1,人,B,细胞淋巴瘤和肺癌,局部功能的miRNA,引自 方福德, microRNA的研究方法与应用, 中国协和医科大学出版社, 2021,miRNA 靶基因,48,miRNA,靶基因 功能作用,mir-223 NF1A,人粒系分化,mir-23b Hes1,小鼠神经发育,mir-206 Connexin43,鸡骨骼肌发育,mir-125a/b ERBB2, ERBB3,调节原癌基因的表达,mir-1,未知 影响人脂肪基质细胞成肌潜能,mir-133a,未知 人肌细胞发育,mir-9a Sens,调节果蝇感官发育,mir-122,未知 人肝癌发生,续表,miRNA 靶基因,49,MicroRNA,的调控机制,mRNA剪切,miRNA与靶mRNA几乎完全互补；,切割位点在从5端起与miRNA配对的第10位和11位核苷酸之间 ；,由RISC中的内切酶催化完成；,可催化多个mRNA分子的降解,翻译抑制,miRNA与靶mRNA互补程度较低；,翻译抑制可能发生在翻译起始后的某一阶段；,翻译顺利进展但翻译产物可能被特异性降解,每个,miRNA,可以有多个靶基因，而几个,miRNAs,也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个,miRNA,来调控多个基因的表达，也可以通过几个,miRNAs,的组合来精细调控某个基因的表达,MicroRNA的调控机制mRNA剪切每个miRNA可以有多,50,MicroRNA,表达的研究方法,miRNA基因芯片技术，高通量检测miRNA表达情况的最正确选择；,PAGE/Northern blotting杂交法，可用于miRNA表达水平的定量检测，还能与RNA marker结合使用检测miRNA分子的大小，用来排除其他小分子RNA的污染；,原位杂交，可直观显示生物体miRNA的时间和组织特异性表达谱；,miRNA实时定量PCR，可高度灵敏地检测出低丰度表达地靶分子，适用于高通量筛选。,MicroRNA表达的研究方法 miRNA基因芯片技术，高通,51,miRNA,功能研究的主要实验策略,引自,J Krtzfeldt, Matthew N Poy and Stoffel. Strategies to determine the biological function of miRNAS. Nature Genetics, 2006,38 (suppl):S14-S19,Dicer mutants,Global miRNA Knockout,Tissue/cells,miRNA identification,Phenotype,Gene expression profiling,miRNA overexpression,miRNA Silencing,Microarray gene expression,Target validation,Rescue,Phenotype,Phenotype,Phenotype,Disease model,miRNA profiling,Gene expression profiling,Normalize miRNA profile through overexpression/silencing,Bioinformatics,miRNA功能研究的主要实验策略引自J Krtzfeldt,52,MicroRNA,功能研究方法,miRNA,体外或体内水平的过表达研究,构建相应的表达载体,体外合成,miRNA,前体分子,miRNA,表达抑制研究,基因水平抑制,miRNA,表达,使用反义核酸分子抑制,miRNA,表达,MicroRNA功能研究方法 miRNA体外或体内水平的过表,53,医学分子生物学新技术应用课件,54,miRNA,基因克隆,一根本原理：miRNA克隆是依赖于其本身的特殊构造，5端的磷酸基团和3端的羟基基团，以T4 RNA连接酶在分子末端加上连接子，然后利用RT-PCR方法扩增获得目的片段，克隆到适宜的载体，最后测序验证。,二应用：microRNA基因克隆主要用于寻找新microRNA基因，同时还可获得准确的表达信息。,miRNA基因克隆一根本原理：miRNA克隆是依赖于其本,55,Michael MZ, 2006,Total RNA,5 P,OH 3,PAGE size separation,5 HO,OH 3,Phosphatase,5 HO,T,4,RNA ligase,5 P,P 3,3 adapter,P 3,5 P,P 3,T,4,polynucleotide kinase,-OH 3,P 3,T,4,RNA ligase,P 3,Ban ,Ban ,5 adapter,RT-PCR,Ban ,Ban digest, religate, ligate into plasmid vector and sequence inserts,miRNA,基因克隆策略,Michael MZ, 2006Total RNA5 PO,56,miRNA基因克隆的根本步骤,一总RNA的提取,关键：尽量不使小RNA丧失,二小分子RNA别离纯化及富集,变性聚丙烯酰胺凝胶PAGE方法 是用于小分子RNA别离纯化的理想方法。,三小分子RNA片段修饰,小分子RNA的修饰包括磷酸化、去磷酸化以及在3端和5端连接上连接子等,miRNA基因克隆的根本步骤一总RNA的提取,57,miRNA基因克隆的根本步骤,四克隆及测序鉴定,含3与5端接头的小分子RNA，经RT-PCR扩增后连接至适宜的载体，转化克隆，最后用相关方法鉴定阳性克隆。,五PAGE/Northern blotting验证,PAGE/Northern blotting方法是确认microRNA 最有效 和常用的方法。,miRNA基因克隆的根本步骤四克隆及测序鉴定,58,PAGE/Northern blotting,一根本原理：PAGE/Northern blotting与常规核酸杂交技术原理一样，都是根据碱基互补配对原理，设计特异探针，与膜杂交，经放射自显影后分析杂交信号。唯一的差异在于选择对小分子RNA别离效率更高的PAGE代替琼脂糖作为别离胶。,二应用：PAGE/Northern blotting方法能提供准确的杂交信息以及有效检测低丰度的RNA分子，在验证micorRNA基因芯片结果及降低假阳性方面具有重要作用，是目前研究microRNA的重要技术。,PAGE/Northern blotting一根本原理：,59,PAGE/Northern blotting根本操作步骤,一总RNA的提取,关键：尽量不使小RNA丧失,二样品处理,取适量提取的RNA样品于上样缓冲液及去离子甲酰胺中 混匀，55孵育30 min，冰浴后准备PAGE别离。,三PAGE别离、转膜及固定,PAGE/Northern blotting根本操作步骤一,60,PAGE/Northern blotting根本操作步骤,四寡核苷酸探针的制备,探针标记可选择放射性核素或非放射性荧光，其中放射 性核素敏感度高，可检测较低丰度的microRNA分子,五杂交、洗膜、压片及显影,六如果选用放射性标记的探针，在分析结果后要去除Northern印记膜上的放射性，防止放射性污染。,PAGE/Northern blotting根本操作步骤四,61,MicroRNA,基因芯片技术,根本原理：MicroRNA基因芯片的根本原理与以往传统基因芯片的使用原理根本一样， 即经过标记的待测microRNA与芯片上特定位置的探针根据碱基互补配对原那么杂交，再经特定仪器扫描，以计算机相关软件对荧光信号进展检测，并转化为可读的数字信息，最后经大量数据分析筛选出有显著表达差异的microRNA。,MicroRNA基因芯片技术 根本原理：MicroRNA基因,62,MicroRNA,基因芯片技术,主要应用：,1寻找和发现新microRNA基因；,2miRNA相关疾病的诊断和治疗，如肿瘤、 白血病、糖尿病等；,3药物筛选和药物开发等；,MicroRNA基因芯片技术主要应用：,63,MicroRNA,基因芯片技术操作流程示意图,Li W, Ruan KC. 2021,MicroRNA基因芯片技术操作流程示意图Li W, Rua,64,MicroRNA,基因芯片技术操作流程,一MicroRNA基因芯片的设计与制作,可根据实验需要自行设计芯片，需要考虑探针的种类、点阵数目及片基种类等；也可向市面上购置芯片,二RNA提取与纯化,三RNA样品的标记,MicroRNA芯片表达谱分析的一个前提条件是检测到所有的microRNA，并且结果具有可重复性。因此，选择适宜的microRNA标记系统是实现芯片表达谱检测准确性的一个保证。,MicroRNA基因芯片技术操作流程一MicroRNA基,65,MicroRNA,基因芯片技术操作流程,四芯片杂交及后处理,由于microRNA分子量小，因此，杂交反响条件及杂交后洗脱条件需慎重选择。,五图像采集和数据分析,MicroRNA基因芯片图像的采集和分析是microRNA芯片技术的重要环节，芯片图象获取的准确性和分析的可靠性直接影响芯片的应用。,六验证,由于microRNA基因芯片结果存在假阳性的可能性，需要用PAGE/Northern blotting、定量PCR等方法验证。,MicroRNA基因芯片技术操作流程四芯片杂交及后处理,66,MicroRNA,实时定量,PCR,根本原理：利用能特异标记PCR产物的荧光物质，显示PCR 产物的动态累积，得到S 型的扩增曲线；假设该曲线的前期PCR 符合指数性扩增，于是在单纯指数方程的根底上，通过比较产物积累的速度来间接比较初始模板的分子数。,最初，实时定量PCR被用于定量检测小RNA分子的前体表达；现在，经过方法改进可用于检测成熟小RNA分子的表达。,MicroRNA实时定量PCR根本原理：利用能特异标记PCR,67,MicroRNA,实时定量,PCR,主要应用：,1microRNA的定量检测，可准确检测出细胞或组织样品中特定微量的microRNA表达水平；,2由于该方法可以同时检测microRNA及其前体，因此，可以根据两者在不同发育阶段的表达差异情况来深入了解microRNA的起源和发生；,3应用于临床诊断和治疗等。,MicroRNA实时定量PCR主要应用：,68,TaqMan MicroRNA,实时定量,PCR,示意图,5,3,microRNA,RT primer,cDNA,Forward primer,Reverse primer,Q,F,Real-time PCR,Reverse transcription,TaqMan probe,Chen CF, Ridzon DA, Broomer AJ, et al. Real-time quantification of microRNAs by stemloop RTPCR.,Nucleic Acids Res. 2005; 33(20): e179,TaqMan MicroRNA 实时定量PCR示意图53,69,MicroRNA,实时定量,PCR,操作步骤,一总RNA提取、小分子RNA的别离纯化及富集,二逆转录反响,MicroRNA的逆转录反响与普通的针对mRNA的逆转录反响过程根本相似，但也有其特异之处，如它的逆转录酶的特异性等。,三实时定量PCR,针对microRNA的实时定量PCR的热学反响条件要慎重选择。,MicroRNA实时定量PCR操作步骤一总RNA提取、小,70,MicroRNA,与疾病,MicroRNA,与人类疾病包括肿瘤、糖尿病、炎症、心脏疾病、病毒感染等的发生密切相关。,MicroRNA,造成疾病发生的可能原因有：突变、基因表达失活、低效转录等原因造成的,microRNA,表达下调；启动子区域基因扩增或突变等原因造成的,microRNA,表达上调等。,MicroRNA与疾病MicroRNA与人类疾病包括肿瘤、糖,71,microRNA引发癌症的可能原因：,1microRNA与细胞的增殖、分化、凋亡密切相关，而肿瘤那么是由细胞增殖、分化、凋亡功能紊乱而引发的 ；,2许多microRNA的基因位于基因组中易发生断裂、移位、缺失等变异的区域 ；,3与正常组织相比，在恶性肿瘤和肿瘤细胞株中普遍存在着对microRNA的表达失控,microRNA引发癌症的可能原因：,72,充当抑癌基因作用的,miRNA,:,miR-15a,和,miR-16-1 :,这两个,miRNAs,的缺失或下调，促进了白血病、淋巴瘤和前列腺癌的发生。,mir-143,和,mir-145,:,在结肠癌中明显下调,充当癌基因作用的,miRNA,:,miR-21:,在胶质母细胞瘤中表达增加,miR-155,:,在,Burkitt,淋巴瘤、,Hodgkin,淋巴瘤等肿瘤中表达上升,充当抑癌基因作用的miRNA:miR-15a和miR-16-,73,肿瘤类别 表达变化趋势,microRNA ID,经验证的靶基因,肺癌 表达上调,miR-26a1,miR-21 TPM1,miR-24-1(miR-189),miR-17-92,miR-30a,miR-143 ERK5,miR-145,miR-188,miR-331,表达下调,miR-200b,Let-7 HMGA2, RAS,目前肺癌中已经表达分析及初步功能研究的局部microRNA,肿瘤类别 表达变化趋势 micr,74,MicroRNA,与糖尿病,MicroRNA引发糖尿病的可能原因：,1 MicroRNA参与胰岛素的合成分泌调节； 2 MicroRNA对血糖代谢起着直接或间接的调控作用；,3MicroRNA与脂质代谢密切相关；,MicroRNA与糖尿病MicroRNA引发糖尿病的可能原因,75,功能的局部miRNA与糖尿病的关系,Amit K. Pandey, et al., 2021,功能的局部miRNA与糖尿病的关系Amit K. Pande,76,miRNA的综合信息网站：,:/,miRNA的综合信息网站：,77,免疫共沉淀技术,免疫共沉淀技术,78,医学分子生物学新技术应用课件,79,医学分子生物学新技术应用课件,80,医学分子生物学新技术应用课件,81,医学分子生物学新技术应用课件,82,医学分子生物学新技术应用课件,83,医学分子生物学新技术应用课件,84,医学分子生物学新技术应用课件,85,医学分子生物学新技术应用课件,86,医学分子生物学新技术应用课件,87,医学分子生物学新技术应用课件,88,医学分子生物学新技术应用课件,89,医学分子生物学新技术应用课件,90,医学分子生物学新技术应用课件,91,医学分子生物学新技术应用课件,92,医学分子生物学新技术应用课件,93,医学分子生物学新技术应用课件,94,医学分子生物学新技术应用课件,95,医学分子生物学新技术应用课件,96,医学分子生物学新技术应用课件,97,医学分子生物学新技术应用课件,98,医学分子生物学新技术应用课件,99,医学分子生物学新技术应用课件,100,医学分子生物学新技术应用课件,101,参考文献,1. Zhifa Shen, Anik St-Denis and Pascal Chartrand. Cotranscriptional recruitment of She2p by RNA pol II elongation factor Spt4-Spt5/DSIF promotes mRNA localization to yeast bud. Genes and Development, 2021, 24:1914-1926,2. Zhifa Shen, Nicolas Paquin1, Amlie Forget and Pascal Chartrand. Nuclear shuttling of She2p couples ASH1 mRNA localization to its translational repression by recruiting Loc1p and Puf6p. Mol.Bio.Cell, 2021. 20, 2265-2275 .,医学分子生物学新技术应用课件,102,RNA Visualization inside Cells- seeing is believing,Techniques to Label RNA,RNA PolyA binding proteins taged with Green Fluorescent Protein (GFP),Fluorescent In Situ Hybridization (FISH),MS2 coat protein (MCP) -MS2 binding sites (MBS) system,RNA Visualization inside Cells,103,The RNA-binding protein She2p-GFP,P,200,VNSEEEFQTLSAAWHSILDGKLSALDEEF,230,She2p,GFP,Shen et al. Mol. Biol. Cell. Vol. 20 (2021),The RNA-binding protein She2p,104,FISH Fluorescence In Situ Hybridization,Shen Z., et al. Mol. Biol. Cell, 2021, 20(8): 2265-2275.,TATTTC,T,GAAGAACA,T,TCATTTAATAGAT,T,TACTCAGTATCTGGG,T,CTT (T modified with,CY3/CY5),FISH Fluoresce,105,Specific RNA labeled with the MS2 system,Valeria de Turris et al. (2021 ) ISBN: 978-3-527-31288-7,Specific RNA labeled with the,106,Advancements in Imaging Technologies,single-molecule imaging: Optical system to match the requirements for imaging single moving particles.,Including:,Acquiring images at rates as fast as, or faster than, the particle movements projected optically onto the capture chip,Applying a minimal amount of light to avoid phototoxicity and bleaching of the sample.,Maximizing the signal-to-noise ratio and tracking the particles in three dimensions (3D) and in time (4D imaging).,Advancements in Imaging Techno,107,一、 FISH Fluorescence In Situ Hybridization技术介绍,一、 FISH Fluorescence In Situ,108,医学分子生物学新技术应用课件,109,FISH,过程,FISH过程,110,制片,制片,111,医学分子生物学新技术应用课件,112,医学分子生物学新技术应用课件,113,医学分子生物学新技术应用课件,114,