生物化学分析ppt课件第三章免疫分析

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章 免疫分析,Immunological Analysis,第三章 免疫分析Immunological Analysi,免疫分析的定义,基于,抗原,（,Antigen,）与,抗体,（,Antibody,）之间的高特异性反应（即免疫反应）实现对,抗原,、抗体及相关物质检测的分析方法。,高特异性反应使抗体能在复杂基体的存在下专一的识别抗原，反之亦然,免疫分析的定义基于抗原（Antigen）与抗体（Antibo,免疫分析的基本原理,Immobilisied,antibody,Enzyme-labelled,antigen,antigen,Bound,fraction,Free,fraction,显色,荧光,化学发光,Principle of competitive immunoassays: the antigen molecules of the sample compete,With a fixed amount of labelled antigen for the limited amount of antibody binding sites,免疫分析的基本原理ImmobilisiedEnzyme-la,免疫学与免疫分析,免疫学（,Immunology,）：,研究生物体自身防御、肌体如何识别异物，并与之发生反应的学科。,免疫分析,是在免疫学发展的过程中出现和发展起来的，是人类探索和利用生物现象解决分析化学问题的一个典型例子。,免疫分析简单的就像一个滴定分析，可以直接测定复杂基体中的目标分子，而无需繁琐的前处理步骤。,免疫学与免疫分析免疫学（Immunology）：研究生物体自,双汇瘦肉精事件,双汇瘦肉精事件,蒙牛黄曲霉毒素事件,蒙牛黄曲霉毒素事件,动物性食品中克伦特罗残留量的测定,GC-MS,法：,提取,净化衍生化内标法定量（不含前处理过程，约,25 min,一个样），检出限为,0.5 gkg,-1,HPLC,法：,提取,净化浓缩外标法定量（不含前处理过程，约,8 min,一个样），,0.5 gkg,-1,酶联免疫法,提取,测定（不含前处理，约,1 h,，但可,同时,多个样品测定，,尿或血清样本可直接测定,），,0.5 gkg,-1,方法,3,为快速筛选法，阳性者需用方法,1,确认,基于酶联免疫原理可制成克伦特罗快速检验试纸，用于现场快速检测,GB/T 5009.1922003,动物性食品中克伦特罗残留量的测定GC-MS法：提取净化衍,乳和乳制品中黄曲霉毒素,M,1,的测定,免疫亲和层析净化,PLC-MS/MS,：,提取,离心净化基质加标外标法定量，定量限,0.01 g/Kg,免疫亲和层析净化,HPLC,（荧光检测器）：,提取,离心净化外标法定量，定量限,0.08 g/Kg,免疫亲和层析净化,MPS,：,提取,离心净化溴衍生化外标法定量，定量限,0.008 g/Kg,双流向酶联免疫法：,溶样后直接测定，定量限,0.5,g/Kg,方法,4,为快速筛选法，阳性者需用方法,1,确认,免疫亲和层析已成为常规的试样净化方式,GB/T 5413.372010,乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定 免疫亲和层析净化PLC,本章内容,4-1,免疫学的基本内容,4-2,抗原,4-3,抗体,4-4,免疫分析,本章内容4-1 免疫学的基本内容,4-1,免疫学的基本内容（,1,）,免疫的概念,免疫（,immunity,），源于拉丁文,immunitas,，在古罗马时代的本意是指免除劳伇或对国家的义务。,传统概念：,机体对再此感染具有的抵抗力称为免疫，即免除瘟疫。,许多与免疫反应关系密切的疾病或现象如变态反应、输血反应及移植排斥反应等不能用抗感染免疫来解释，或根本与感染因子无关。,现代概念：,机体对“非己”与“自身”物质的识别、应答过程中所产生的生物学效应的总和。,4-1 免疫学的基本内容（1）免疫的概念,免疫观念的转变,传统概念,现代概念,对象,针对病原因子,（非己）,针对一切抗原物质,（非己、自身）,应答,免疫反应,免疫反应、免疫耐受,效应,免疫防御,免疫防御、免疫损害,免疫是把双刃剑！,免疫观念的转变传统概念现代概念对象针对病原因子针对一切抗原物,免疫是把双刃剑,正常情况下产生免疫保护，对机体有利：,识别“非己”抗原，产生免疫应答并清除之,对于“自身”抗原不应答，维持耐受,异常情况下产生免疫病理反应，对机体不利：,将“自身”抗原识别为非己，损害正常的自身组织，导致自身免疫疾病,对“非己”抗原应答过度，产生变态反应,不能排除“非己”抗原，造成肿瘤或持续性感染等（免疫缺陷,）,免疫是把双刃剑正常情况下产生免疫保护，对机体有利：,4-1,免疫学的基本内容（,2,）,免疫学的发展历程,免疫学是一门既古老而又新兴的学科，其发展是人们在实践中不断探索、总结和创新的结果，可大致分为以下四个时期：,经验,免疫学时期（,至,18,世纪）,经典,免疫学时期（,19,世纪末,20,世纪初）,近代,免疫学时期（,20,世纪初,中叶）,现代,免疫学时期 （,20,世纪,60,年,）,4-1 免疫学的基本内容（2）免疫学的发展历程,经验免疫学时期（,1,）,人们对“免疫”的认识首先从感染性疾病和抗感染免疫开始,公元前,430,年古希腊历史学家修西得底斯（,Thucydides,）对雅典鼠疫的描述：从这九死一生的疾病中康复过来的人懂得，现在他们可以无所畏惧了。因为,在同一个身上这样的疾病不会发生两次，至少不会是致命的,。这些人不仅得到别人的，而且是他们自己的庆祝。然后，在这兴高采烈的时刻，有一半是沉浸在徒劳的幻想之中，他们以为自己以后对任何病都是安全的了,经验免疫学时期（1）人们对“免疫”的认识首先从感染性疾病和抗,经验免疫学时期（,2,）,我国医学家在对治疗天花病长期临床实践中，对天花病的防治积累了丰富的经验，并创造性地发明了用,人痘苗预防天花,的方法，这是现代免疫学的开端。,1798 Edward Jenner,采用,牛痘预防天花,。,vaccination,：接种，取自拉丁文,vacca,牛及,vaccinia,牛痘之意,vaccine,：牛痘苗、疫苗,经验免疫学时期（2）我国医学家在对治疗天花病长期临床实践中，,经典免疫学时期（,1,）,减毒疫苗的发明,：,1880 Louis,Pasteur,发现陈旧鸡霍乱杆菌培养物不仅不会使鸡致病，而且还可抵御新鲜的鸡霍乱杆菌。基于此发明了通过物理、化学或生物学方法获得减毒疫苗或菌苗，如炭疽菌苗（高温）、狂犬病毒疫苗（反复传代减毒）,（,主动免疫,）,经典免疫学时期（1）减毒疫苗的发明：1880 Louis P,经典免疫学时期（,2,）,抗毒素（抗体）的发现,：,1890,年，,Behring,等人首创抗毒素血清预防和治疗，与,1901,年获诺贝尔首届医学和生理学奖。（,被动免疫,）,被动免疫可用于治疗，但没有记忆效应。,经典免疫学时期（2）抗毒素（抗体）的发现：1890年，Beh,经典免疫学时期（,3,）,免疫应答机制的研究,细胞免疫学说,：,1883,年，,Metchnikoff,发现白细胞的吞噬功能，即可吞噬和清除多种病原微生物。,体液免疫学说,：,1897,年，,Paul Ehrlich,提出。其论点是细菌或毒素等抗原能刺激机体产生存在于体液中的抗体；抗体可在体内,/,外与抗原发生凝集、沉淀等反应，从而清除各种病原微生物或中和细菌毒素。,两种学说的争论是科学史上最著名的争论之一。,1903,年,Wright,等发现抗体能增强吞噬细胞对抗体特异性细菌的吞噬能力，从而初步将两大学派统一起来，使的人们开始认识到机体的免疫机制包括体液免疫和细胞免疫两方面。,经典免疫学时期（3）免疫应答机制的研究,免疫机制的确立,Antibody and antigen aggregates are ingested by phagocytic cells,Special proteins in blood kill antibody-coated bacteria or viruses,Antibodies Form Aggregates,免疫机制的确立Antibody and antigen ag,经典免疫学时期（,4,）,补体的发现：,19,世纪末,Bordet,证实新鲜血液中含有一种不耐热的成分，可辅助和补充特异性抗体，介导免疫溶菌、溶血作用，故称为补体。,血清学方法的建立：,利用抗原和抗体间间的凝集、沉淀及补体结合反应建立了多种体外检测抗原和抗体的血清学方法。,免疫化学的研究,：即对抗原和抗体的理化性质及其特异性结合的化学基础问题的研究。,利用人工抗原发现抗原特异性是由小分子的结构及构象决定，解释了血清学反应现象；,电泳技术证明抗体是丙种球蛋白，并利用分离、纯化方法对抗体分子的结构与功能进行研究；,免疫电泳技术发现了抗体分子不均一性的本质，使得抗体分子与结构研究取得了重大进展。,经典免疫学时期（4）补体的发现：19世纪末Bordet证实新,近代免疫学时期,这一时期，人们冲破了抗感染免疫模板学说的束缚，对生物体的免疫反应性有了比较全面的认识，使免疫学开始研究生物问题，出现了全新的免疫学理论。 主要成就如下：,超敏反应的发现 ：,异常、过高的免疫应答，又称变态反应。,免疫耐受的发现：,无免疫应答现象。,克隆选择学说：,1959,年,Buenet,提出，较为完善地解释了抗体产生的机理。,免疫学技术的发展：,建立了间接凝集反应和免疫标记技术,近代免疫学时期这一时期，人们冲破了抗感染免疫模板学说的束缚，,现代免疫学时期,该时期确认了淋巴细胞系在免疫反应中的地位，阐明了免疫球蛋白的分子结构与功能，对免疫系统特别是细胞因子、粘附分子等进行了大量研究，并从分子水平对免疫球蛋白的多样性、类别转化等进行了探讨，在许多方面取得了突破性成就。,免疫系统的研究：,建立了免疫系统的组织学和细胞学基础,抗体结构与功能的研究：,统一了抗体球蛋白名称并建立了分类,免疫网络学说的提出：,基于克隆选择学说的另一个学说,抗体多样性研究,细胞因子与免疫细胞膜分子研究,现代免疫学时期该时期确认了淋巴细胞系在免疫反应中的地位，阐明,4-1,免疫学的基本内容（,3,）,免疫系统的组成,免疫器官,免疫细胞,免疫分子,中枢,外周,膜型分子,分泌型分子,胸腺,脾脏,干细胞系,T,细胞抗原识别受体,TCR,免疫球蛋白分子,Ig,骨髓,淋巴结,淋巴细胞,B,细胞抗原识别受体,BCR,补体分子,C,分子,法氏囊,（禽类）,粘膜免疫系统,单核吞噬细胞,白细胞分化抗原,CD,分子,细胞因子,CK,皮肤免疫系统,其他抗原提成细胞如树突状细胞、内皮细胞等,粘附分子,其他免疫细胞如粒细胞、肥大细胞、血小板、红细胞等,主要组织相容性抗原,MHC,其他受体分子,4-1 免疫学的基本内容（3）免疫系统的组成免疫器官免疫细胞,免疫器官（,1,）,中枢免疫器官：,发生、发育早；,是造血干细胞增殖发育分化为,T,、,B,淋巴细胞的场所，淋巴细胞在此增殖不需要抗原的刺激；,向外周免疫器官输送,T,、,B,淋巴细胞，决定外周免疫器官发育。,免疫器官（1）中枢免疫器官：,免疫器官（,2,）,外周免疫器官：,T,、,B,细胞的定居和增殖场所；,免疫应答的发生场所；,淋巴液过滤部位；,参与淋巴细胞再循环。,免疫器官（2）外周免疫器官：,免疫细胞,B,、,T,细胞称为免疫活性细胞，能发生特异性免疫应答。,免疫细胞B、T细胞称为免疫活性细胞，能发生特异性免疫应答。,免疫细胞与免疫分子,免疫分析相关,免疫细胞与免疫分子免疫分析相关,4-1,免疫学的基本内容（,4,）,免疫系统的三个基本功能,免疫防御：,对外来（异体）抗原物质的识别，排除。免疫防御功能低下可导致免疫缺陷，主要表现为感染；该免疫反应的类型或强度异常时，可表现为超敏反应。,免疫稳定：,机体处理老化，损伤细胞的功能。该功能异常时，可导致自身免疫病，如,SLE,（红斑狼疮），类风湿等。,免疫监视：,清除,DNA,复制错误和,突变细胞。免疫功能低下可导致肿瘤发生率增高，增殖速度及转移加快。,4-1 免疫学的基本内容（4）免疫系统的三个基本功能,4-1,免疫学的基本内容（,5,）,免疫应答的类型,非特异性免疫：,又称为天然或固有免疫，是与生具有的，遇病原体后，首先并迅速起防卫作用。,特异性免疫：,又,称适应性或获得性免疫，是后天获得的， 是免疫学研究的主要对象。,免疫类型,天然免疫,获得性免疫,产生特点,生来具有,后天获得,特异性,非抗原特异性,抗原特异性,多样性,有限,丰富,回忆反应性,无,有,参与的主要成分,皮肤、粘膜和屏障结构,吞噬细胞、,NK,细胞、补体等,T,、,B,淋巴细胞抗体等,4-1 免疫学的基本内容（5）免疫应答的类型免疫类型天然免疫,特异性免疫应答,基本过程：,识别阶段；,活化增殖阶段；,效应阶段,特点：,特异性,（免疫分析的基础）、,记忆性,、自身耐受性、自我限制性,类型：,体液免疫与细胞免疫；初次应答与再次应答；主动免疫与被动免疫,对机体有利：,抗感染、抗肿瘤及自身稳定,免疫耐受,：不应答,对机体不利：,超敏反应、自身免疫病及移植排斥,特异性免疫应答基本过程：识别阶段；活化增殖阶段；效应阶,体液免疫和细胞免疫,体液免疫和细胞免疫,初次应答和再次应答,再次应答需用相同抗原刺激,初次应答和再次应答再次应答需用相同抗原刺激,4-2,抗原,抗原的概念,抗原（,Antigen,，,Ag,）是一类能够,刺激,动物机体免疫系统，诱导发生免疫应答，并能与相应的免疫应答产物在体内,/,外发生,特异性结合,的物质。,即抗原能与免疫系统中,B/T,淋巴细胞表面的抗原受体,BCR/ TCR,结合而促使其增殖、分化，产生免疫效应物质,抗体,/,致敏淋巴细胞,并与之结合。,4-2 抗原抗原的概念,4-2-1,抗原的两个基本性质（,1,）,免疫原性,/immunogenicity,：,指能引起免疫应答的性能，即能够刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞。,免疫反应性,/immunoreactivity,：,又称抗原特异性或抗原专一性，指能与免疫应答物（抗体或致敏淋巴细胞）在体内外相互作用起反应的性能。,免疫原性,免疫反应性,4-2-1 抗原的两个基本性质（1）免疫原性/immunog,4-2-1,抗原的两个基本性质（,2,）,具有免疫原性的分子,一定,具有免疫反应性（免疫耐受除外）；但具有免疫反应性的分子,不一定,具有免疫原性。,完全抗原,/complex A,g,：同时具有免疫原性和免疫反应性的物质，如大多数蛋白质,半抗原,/Ha,pten,：只具有免疫反应性而不具有免疫原性的物质，通常为小分子物质,半抗原连接适当的大分子载体可成为完全抗原,，能引发机体的免疫应答产生针对该半抗原反应的抗体。,这是免疫分析可用小分子测定物质基础。,4-2-1 抗原的两个基本性质（2）具有免疫原性的分子一定具,hapten + carrier = complex Ag,hapten + carrier = complex Ag,4-2-2,抗原的异物性和特异性（,1,）,异物性,：抗原的重要性质,化学结构与宿主自身成分不同或在胚胎期机体的免疫活性细胞从而接触过的物质称为异物。,异物性程度取决于抗原与机体的亲缘关系：,亲缘关系,（即种属关系）,越远，异物性越强，即免疫原性越强。,4-2-2 抗原的异物性和特异性（1）异物性：抗原的重要性质,具有异物性的物质,异种物质,同种异体物质：,ABO,的血型物质和,MHC,分子等,例如：输血应选择同种血型；器官移植物时供者与受者的亲缘关系越近（如血缘关系），则排斥反应的程度越轻。,改变或隐蔽的自身物质,脑组织、眼晶状体蛋白、精子及甲状腺球蛋白等；被理化和生物学因素改变或修饰的自身正常成分；突变的正常细胞（肿瘤细胞）,具有异物性的物质异种物质,4-2-2,抗原的异物性和特异性（,2,）,特异性：,指抗原与其诱生的抗体,/,致敏淋巴细胞间的相互吻合性、针对性和专一性。（锁和钥匙的关系）,免疫原性的特异性：,指某一特定抗原只能激发机体产生针对该抗原的特异性抗体,/,致敏淋巴细胞。,免疫反应的特异性：,指某一特定抗原只能与其特异性抗体,/,致敏淋巴细胞结合而出现发生反应。,4-2-2 抗原的异物性和特异性（2）特异性：指抗原与其诱生,决定抗原特异性的基础是什么？,决定抗原特异性的基础是什么？,4-2-2-1,抗原决定簇（,1,）,抗原决定簇,/,A,ntigenic,D,eterminant,：又称表位,epitope,，指抗原表面决定抗原特异性的某些,特定化学结构,（包括化学基团和分子构象）。抗原以此和,B/T,淋巴细胞表面的抗原受体,BCR/TCR,结合，进而引起免疫应答和免疫反应。,抗原不是以整个分子起作用，而是它表面的某些化学基团或构象，即表位起作用。,表位的特异性决定了抗原的特异性,，是与相应抗体或淋巴细胞表面受体结合的部位,。,4-2-2-1 抗原决定簇（1） 抗原决定簇/Antigen,4-2-2-1,抗原决定簇（,2,）,表位的组成,抗原,表位的组成,大小,/nm,半抗原,1,个简单的有机分子,0.51.5,天然蛋白质,612,个氨基酸残基,2.54.5,合成多肽,49,个氨基酸残基,2.03.5,多糖,6,个单糖残基,3.5,核酸,45,个嘌呤或嘧啶残基,1.52.0,4-2-2-1 抗原决定簇（2） 表位的组成抗原表位的组成大,4-2-2-1,抗原决定簇（,3,）,抗原的结合价：,指能和抗体分子结合的功能性表位的个数。完全抗原是多价，半抗原是单价的。,表位是抗原中具有免疫原性的部位，一种表位激发一种淋巴细胞产生一类抗体。因此多价抗原会诱发机体产生多种类型的抗体。,多价抗原可与多个抗体分子交互结合。,抗原名称,人血清白蛋白,鸡卵清清蛋白,牛血清白蛋白,甲状腺球蛋白,表位数目,4,个,10,个,18,个,40,个,4-2-2-1 抗原决定簇（3）抗原的结合价：指能和抗体分子,4-2-2-2,抗原表位分类（,1,）,根据结构可为,线性表位,（顺序或,/,连续表位）和,构象表位,（非连续表位）,构象表位一般位于抗原表面，线性表位可在任何部位,表位中各基团的序列或空间构象的细微变化均会使其抗原性发生改变。,例如：,A,型血和,B,型血红细胞表面抗原的区别仅在于前者是,N-,乙酰氨基半乳糖，而后者为,L-,岩藻糖。,4-2-2-2 抗原表位分类（1）根据结构可为线性表位（顺序,4-2-2-2,抗原表位分类（,2,）,根据位置可分为,功能性表位,和,隐蔽性表位,功能性表位位于抗原表面，易被,B,细胞识别引发应答；隐蔽性表位位于抗原内部，不易被淋巴细胞识别引发应答，但若因各种理化原因暴露出来则可引发应答。,根据识别表位的淋巴细胞可分为,B,细胞表位,和,T,细胞表位,，分别仅可被,B/T,细胞表面,BCR/TCR,识别,4-2-2-2 抗原表位分类（2）根据位置可分为功能性表位和,4-2-2-3,抗原决定基对抗原特异性的影响（,1,）,4-2-2-3 抗原决定基对抗原特异性的影响（1）,4-2-2-3,抗原决定基对抗原特异性的影响（,2,）,4-2-2-3 抗原决定基对抗原特异性的影响（2）,4-2-2-4,共同抗原和交叉反应（,1,）,交叉反应：,指抗体除可与其相应抗原发生特异性反应外，有时还可与其他抗原发生反应。,交叉反应的,物质基础：,不同抗原物质表面可能含有相同或相似的表位，即共同表位。任一抗原刺激机体产生的抗体可与含相同或相似决定基的其他抗原发生反应。,共同抗原：,具有相同表位的不同抗原称为共同抗原或交叉抗原。共同抗原的存在和交叉反应的发生并非否定抗原的特异性，而是由于抗原的异质性和共同表位所致。,4-2-2-4 共同抗原和交叉反应（1） 交叉反应：指抗体除,4-2-2-4,共同抗原和交叉反应（,2,）,4-2-2-4 共同抗原和交叉反应（2）,4-2-2-4,共同抗原和交叉反应（,3,）,交叉抗原的生物学意义,某些情况下，针对病原微生物的免疫应答可导致对人体的免疫损伤（如异嗜性抗原）,在进行特异性诊断或鉴定时，须排除交叉抗原可能产生的干扰,应用交叉抗原可能诱导出针对难于制备的抗原的免疫应答，例如近年报道，斑疹伤寒立克次氏体可诱导机体产生针对,HIV,的免疫应答。,4-2-2-4 共同抗原和交叉反应（3） 交叉抗原的生物学意,Question,？,1796,年，英国医生琴纳通过为一个小男孩接种牛痘（一种感染牛的病毒），成功地预防了天花（一种感染人的病毒），这与抗原特异性相矛盾吗？试解释这一现象。,Question？1796年，英国医生琴纳通过为一个小男孩接,生物化学分析ppt课件第三章免疫分析,4-2-3,影响免疫原性的条件,抗原的理化性质,抗原的种类,分子的大小,化学组成及物理性状,抗原决定基的易接近性,抗原与机体的相互作用,进入机体的途径,机体遗传因素,4-2-3 影响免疫原性的条件抗原的理化性质抗原与机体的相互,抗原的理化性质（,1,）,抗原的种类：,天然抗原多为大分子有机物，多数蛋白质为良好的抗原，多糖及多肽也具一定的免疫原性，其化学性质有关。,分子大小：,抗原的分子量一般,10 kD,，且分子量越大，免疫原性越强，其机制为：,a.,表面分布较多抗原决定基；,b.,化学性质相对稳定；,c.,降解及排除速率较慢，有利于持续刺激机体免疫系统。,抗原的理化性质（1）抗原的种类：,抗原的理化性质（,2,）,化学组成及物理性状：,分子量并非决定免疫原性的惟一和绝对因素，免疫原性物质还须,具备复杂的化学组成与特殊的化学基团,。,例如：,a.,简单重复的有机大分子不具免疫原性（如磺化聚苯乙烯）；,b.,明胶的分子量逾,100 kD,，但其仅由直链氨基酸组成，故免疫原性很弱；,c.,胰岛素分子量仅,5.7 kD,，但其序列中含芳香族氨基酸，故具免疫原性。,物理性状的影响：,颗粒抗原的免疫原性强于可溶性抗原；多聚体的免疫原性强于单体。,抗原的理化性质（2）化学组成及物理性状：,抗原的理化性质（,3,）,抗原决定基的易接近性,即抗原决定基是否容易被,B,、,T,淋巴细胞表面的抗原受体所接近，越容易接近，抗原性越强。,抗原的理化性质（3）抗原决定基的易接近性即抗原决定基是否容易,抗原与机体的相互作用（,1,）,抗原进入机体的方式,抗原剂量：,过多,/,过少都不能产生抗体且会引起免疫耐受,免疫途径：,同一物质经不同途径进入机体，其刺激免疫系统产生应答的强度各异，依次为：皮内注射,皮下注射,肌肉注射,腹腔注射（仅限于动物）,静脉注射,口服,抗原与机体的相互作用（1）抗原进入机体的方式,抗原与机体的相互作用（,2,）,机体遗传因素,个体对抗原刺激产生应答的能力受遗传因素控制。同种动物不同品系或不同个体，对同一抗原产生应答的强度或性质各异。,年龄、性别和健康状态也有影响：青壮年,幼,/,老年；雌性,雄性（怀孕除外）；感染或免疫抑制,我们每天吃的食物是否会引起免疫应答？,怎样进行有效地疫苗接种？,抗原与机体的相互作用（2）机体遗传因素,4-2-4,半抗原,完全抗原（,1,）,半抗原：,具有一定结构特征的小分子，它自身不具备免疫原性，但可与大分子载体偶联形成完全抗原，引发免疫应答得到能与该半抗原特异性结合的抗体。,选择大分子载体的注意事项：,（,1,）与免疫动物异源，如免疫动物为兔，可选用牛血清白蛋白、卵清白蛋白等；（,2,）所得抗体中也有针对大分子载体表位的。,偶联方式：,重氮化法；,碳二亚胺法；,戊二醛法；,混合酸酐法；,O,羧甲基羟胺法,偶联位置：,尽可能将极性基团和芳香环等特征基团暴露出来。,4-2-4 半抗原完全抗原（1）半抗原：具有一定结构特征的,半抗原偶联位置对抗体特异性的影响,雌酮,雌二醇,雌三醇,半抗原,不同偶联位置交叉反应,%,17-,位偶联,3-,位偶联,6-,位偶联,雌二醇,100,100,100,雌酮,96,2.0,1.0,雌三醇,10,0.8,0.4,雌二醇与载体蛋白的偶联位置对抗体特异性的影响,半抗原偶联位置对抗体特异性的影响雌酮雌二醇雌三醇半抗原不同偶,4-2-4,半抗原,全抗原（,2,）,苏丹红,I,全抗原的合成：,三聚氰胺,I,全抗原的合成：,全抗原合成后需验证是否偶联成功并计算偶联比。,4-2-4 半抗原全抗原（2）苏丹红 I 全抗原的合成：全,4-2-4,半抗原,全抗原（,3,）,载体的作用,为什么单独用半抗原不能产生抗体？,载体在抗体产生中发挥什么作用？,4-2-4 半抗原全抗原（3）载体的作用,生物化学分析ppt课件第三章免疫分析,4-2-4,半抗原,全抗原（,4,）,小分子半抗原可通过与载体大分子结合获得免疫原性和特异性抗体；,载体不仅增加了半抗原分子大小，使之获得免疫原性，而且在再次应答的免疫记忆中起重要作用，,再次应答由载体决定,。,大多数天然抗原都可看作是半抗原,载体复合物，半抗原实质就是抗原决定簇，而其余部分则为载体。,细胞介导免疫应答的特异性由载体决定，而体液免疫应答的特异性由抗原决定。,载体效应：,初次与再次免疫时，只有使半抗原结合在同一载体上，才能产生抗半抗原的再次免疫应答现象。,4-2-4 半抗原全抗原（4）小分子半抗原可通过与载体大分,4-2-5,抗原的分类,对,T,细胞的依赖分类：,T,细胞依赖抗原,/TD,抗原和非细胞依赖抗原,/TI,抗原，亦称胸腺依赖抗原和胸腺非依赖抗原。,根据与机体的亲缘程度分类：,异种抗原、同种异型抗原（如,AB,红细胞抗原）、异嗜性抗原（无血缘关系但却存在共同表位的抗原）、自身抗原（改变或隐蔽的自身物质）、 独特型抗原（如鼠的,Ig,对兔）。,其它分类：,天然抗原和人工抗原；,完全抗原、半抗原；,颗粒性抗原，可溶性抗原,4-2-5 抗原的分类 对T细胞的依赖分类：T细胞依赖抗原/,4-2-6,佐剂（,1,）,佐剂：,预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的物质，可视为一种非特异性免疫增强剂。,佐剂的种类,化合物：,包括氢氧化铝、明矾、矿物油及吐温,80,、弗氏不完全佐剂（羊毛脂与石蜡油的混合物）以及人工合成的多聚肌苷胞苷酸,(polyI:C),、脂质体等。,生物制剂：,经处理或改造的细菌及其代谢产物，如卡介苗、短小棒状杆菌、百日咳杆菌，以及霍乱毒素,B,亚单位,(CTB),、革兰阴性菌细胞壁成分脂多糖（,LPS,）和类脂,A,、源于分支杆菌的胞壁酰二肽等；细胞因子及热休克蛋白等。,4-2-6 佐剂（1）佐剂：预先或与抗原同时注入体内，可增强,4-2-6,佐剂（,2,）,作用机制：,改变抗原物理性状，延长抗原在体内存留时间；,刺激吞嗜细胞，增强提呈能力；,刺激淋巴细胞增殖，分化。,应用：,增强特异免疫应答，如制备抗血清及疫苗接种；,非特异地增强机体免疫功能，可用于抗肿瘤与抗感染,4-2-6 佐剂（2）作用机制：,4-3,抗体,抗体,（,Antibody,，,Ab,）：介导体液免疫的重要效应分子，是,B,细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的可特异性结合抗原的糖蛋白。,免疫球蛋白,（,Immunoglobulin,，,Ig,）：具抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白（,1964,年国际卫生组织的统一命名）。,Ab,都是,Ig,，但,Ig,不一定是,Ab,，通常也不区分。,Ig,的分布：,分泌型,，血清等体液中；,膜型,，,B,细胞膜上，即,BCR,4-3 抗体抗体（Antibody，Ab）：介导体液免疫的重,抗体是具有免疫性质的球蛋白,Electrophoretogram of anti-OVA rabbit serum before (a) and after (b) removal of antibody by affinity chromatograph.,抗体是具有免疫性质的球蛋白Electrophoretogra,4-3-1,免疫球蛋白的结构,典型,Ig,分子的基本结构呈“,Y”,字型，,由,两条相同的,重链,和两条相同的,轻链,通过二硫键连接而成。重链和轻链近氨基端的,1/4,或,1/2,氨基酸序列变化很大，为,可变区,；其它部分氨基酸序列相对恒定，为,恒定区,；位于,C,H1,和,C,H2,之间富含脯氨酸的区域为,铰链区,。（,Y=2H+2L,）,4-3-1 免疫球蛋白的结构典型Ig分子的基本结构呈“Y”字,重链与轻链,重链,（含,450,550,个,AA,残基和不同数量糖，,M,r,约,50,75 kD,）,重链的类：,按,AA,的组成和顺序的不同分为,5,种，即,、，与之对应的,Ig,称为,IgG,、,IgA,、,IgM,、,IgD,、,IgE,；,重链的亚类：,根据,IgG,和,IgA,铰链区,AA,组成和重链二硫键数目与位置的差异又分为若干亚类，如,IgG1IgG4,、,IgA1,和,IgA2,轻链,（约,214,个,AA,残基，通常不含糖，分子量约,25 kD,）,轻链的型,：分为,与,两型，每个,Ig,分子的轻链的型相同,轻链的亚型：,型又可分为,1,、,2,、,3,和,4,等四个亚型,重链与轻链重链 （含450550个AA残基和不同数量糖，M,5,种免疫球蛋白的比较,分子量,基本四链,结构的数目,重链类型,抗原价数,正常血清中的含量,%,IgA,1.6,10,5,1or2,2,13,IgD,1.8,10,5,1,？,1,IgE,2.0,10,5,1,2,0.01,IgG,1.5,10,5,1,2,80,IgM,9.0,10,5,5,5,（,10,）,6,5种免疫球蛋白的比较分子量基本四链重链类型抗原价数正常血清中,可变,V,区与恒定,C,区（,1,）,可变区,V,H,和,V,L,各包括,3,个高变区和,4,个骨架区；,V,H,与,V,L,的,3,个,高变区,共同组成与抗原决定基互补的表面，即互补决定区（,CDR,），,CDR,决定抗体的,特异性,；,V,H,和,V,L,共同构成抗体的独特型。,可变V区与恒定C区（1）可变区 VH 和VL,抗体互补决定区和抗原表位结合示意图,类似蛋白与细胞表面受体或酶与底物；,反应动力：,离子键、氢键、疏水力和范德华力,可逆反应,抗体互补决定区和抗原表位结合示意图类似蛋白与细胞表面受体或酶,可变,V,区与恒定,C,区（,2,）,恒定区,C,H,和,C,L,不同类重链,C,H,长度不一，分为,C,H,1,、,C,H,2,、,C,H,3,；有些具,C,H,4,C,区结构相对稳定，有些结构是同一种属的每一个体均具有的（,同种型,）；但亦存在一些变化，即某些结构是某个体独有的（,同种异型,）,可变V区与恒定C区（2）恒定区CH 和CL,铰链区,位于,C,H,1,和,C,H,2,之间，含有丰富的脯氨酸。具有柔曲性，可以伸展、弯曲和转动。有利于与不同距离的抗原表位结合，又有利于暴露抗体分子的补体结合点。,易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等酶水解,IgM,和,IgE,无铰链区,铰链区 位于CH1和CH2之间，含有丰富的脯氨酸。具有柔曲性,功能区或结构域,Ig,分子的,2,条重链和,2,条轻链都可折叠为数个环形结构域。每个结构域一般具有其独特的功能，因此又称为功能区。每个功能区约含个,110,氨基酸残基，其二级结构是由几股多肽链折叠而成的两个反向平行的,片层。,功能区或结构域Ig分子的2条重链和2条轻链都可折叠为数个环形,Ig,的水解片段,Fab,：,抗原结合片段。由,L,和,V,H,+C,H,1,组成，可与抗原结合，,1,价。,Fc,：,可结晶片段。由,2C,H,2+2C,H,3+,铰链区组成，不与抗原结合。,F(ab,),2,：,2Fab+,铰链区，可与抗原结合，,2,价。既保留了抗体活性，又避免了,Fc,的免疫原性可能产生的副作用，因此被广泛用作生物制品。,Ig的水解片段Fab：抗原结合片段。由L和VH+CH1组成，,Ig,中的抗原决定簇,同种型：,同一物种中所有个体产生的免疫球蛋白分子均具有的抗原特异性,（意义？）,鼠,Ig,免疫兔，可得兔抗鼠,Ig,（,二抗,），可与所有鼠,Ig,结合,独特型（个体基因型）：,不同,B,细胞克隆产生的免疫球蛋白分子具有其独特的抗原特异性,同种异型：,同一物种不同个体间的免疫球蛋白分子具有的不同抗原特异性,Ig中的抗原决定簇同种型：同一物种中所有个体产生的免疫球蛋白,生物化学分析ppt课件第三章免疫分析,4-3-2,抗体的产生（,1,）,免疫应答中的细胞过程,4-3-2 抗体的产生（1）免疫应答中的细胞过程,4-3-2,抗体的产生（,2,）,克隆选择理论,动物体内存在许多具有免疫活性的细胞克隆，,不同细胞克隆具有不同的表面受体,BCR,，能与相应抗原决定簇发生互补结合；,一旦某种抗原进入体内与相应细胞克隆的,BCR,发生结合后便选择性地激活了这一克隆,（结合力高于某个定值）,激活后的细胞克隆扩增并产生大量抗体；,抗体,Ab,分子的特异性与被选择的细胞的,BCR,受体,相同,。,4-3-2 抗体的产生（2）克隆选择理论,克隆选择理论的核心论点,每个,B,淋巴细胞的,DNA,中具有独特的碱基序列，它决定了该淋巴细胞所能产生的抗体的氨基酸序列；,每个,B,淋巴细胞在它开始成熟时会产生少量的特异性抗体，其中部分结合在细胞表面，即细胞表面受体,BCR,；,单个,B,淋巴细胞产生单一种类的抗体，,合成特定种类的抗体承诺发生在抗体遇到抗原之前,；（即带有各种受体的免疫活性细胞克隆早已存在，抗原的作用只是选择并激活相应的克隆）,BCR,和该细胞后代的分泌产物（抗体）具有相同的特异性,克隆选择理论的核心论点每个B淋巴细胞的DNA中具有独特的碱基,4-3-2,抗体的产生（,3,）,抗体产生的动力学,分泌抗体的量,免疫时间,4-3-2 抗体的产生（3）抗体产生的动力学分泌抗体的量免疫,4-3-3,抗体的制备,多克隆抗体,单克隆抗体,基因工程抗体：,又称重组抗体，借助,DNA,重组技术和蛋白质工程技术，按人们的意愿在基因水平上对,Ig,进行切,割、拼接或修筛，重新组装成为新型抗体分子。,虽不能完全控制整个过程，但可在一定程度上按人类意愿进行,4-3-3 抗体的制备多克隆抗体,多克隆抗体（,1,）,用含多种抗原决定簇的抗原物质免疫动物，刺激多个,B,细胞克隆所获得的免疫血清（含多种抗体的混合物，即为所说抗体），此为多克隆抗体。,生产相对比较便宜、快速,不需要特殊的技术和太长的时间,特异性不高且每批多克隆抗体的,特异性及亲和性都不相同,既有针对间氨基苯磺酸的抗体，,也有针对偶联蛋白上各表位的抗体,多克隆抗体（1）用含多种抗原决定簇的抗原物质免疫动物，刺激多,多克隆抗体（,2,）,多种抗体的混合物,（多克隆抗体）,针对不同表位的,B,细胞,克隆增值,多克隆抗体（2）多种抗体的混合物针对不同表位的B细胞克隆增值,单克隆抗体（,McAb,）（,1,）,是指由,一个,B,杂交瘤细胞,活化、增殖、分化产生的子代细胞克隆分泌的、,针对一个抗原决定簇,的抗体。,杂交瘤技术,，即,通过融合经免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞，以获得,同时具有,抗体分泌功能和保持细胞永生性特征的杂交瘤细胞克隆，是获取单克隆抗体的主要技术途径。,（,1984 Noble Prize,）,前期需较多的时间、经费及仪器投入，但一旦成功，可以源源不断地提供质量稳定、特异性强、纯度高的抗体。,单克隆抗体（McAb）（1）是指由一个B杂交瘤细胞活化、增殖,单克隆抗体（,2,）,单克隆抗体（2）,免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的融合,免疫脾细胞：,取自经免疫成功后的,BALB/c,小鼠的脾脏，与其相应的亲本骨髓瘤细胞呈同源性，组织相容性一致。（脾脏中,B,淋巴细胞占全部淋巴细胞的,6070%,）,骨髓瘤细胞：,属于癌细胞，适宜条件下可在体内、外无限增殖。通常采用,SP2/0,瘤细胞（由,BALB/c,小鼠的瘤细胞经培养而建株），该细胞系经过培养和药物筛选使之变异，已完全失去抗体表达能力，且,缺乏鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（,HGPRT,）,，因此用其作为亲本细胞所得的杂交瘤细胞可分泌更加纯一的单克隆抗体。,细胞融合：,聚乙二醇,PEG,做融合剂。,PEG,能导致细胞膜上脂类物质的物理结构重新排列，使细胞膜容易打开而促进细胞融合,免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的融合免疫脾细胞：取自经免疫成功后的B,杂交瘤细胞选择性培养及筛选（,1,）,肿瘤细胞合成,DNA,的途径：,（,1,）主要途径：利用糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成,DNA,，但是叶酸（相关辅酶）拮抗物氨基蝶呤（,Aminopterin,）可以阻断该途径；（,2,）应急途径：当叶酸受阻时，细胞可通过鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（,HGPRT,）和胸腺嘧啶核苷激酶（,TK,）利用次黄嘌呤（,Hypoxanthine,）和胸腺嘧啶核苷（,Thymidine,）维持核酸的正常代谢。,HAT,培养液：,次黄嘌呤,+,氨基蝶呤,+,胸腺嘧啶,杂交瘤细胞选择性培养及筛选（1）肿瘤细胞合成DNA的途径：（,杂交瘤细胞选择性培养及筛选（,2,）,细胞组合,HGPRT,生长状态,淋巴细胞,+,骨髓瘤细胞,+,生长增殖,淋巴细胞,+,淋巴细胞,+,不增殖死亡,骨髓瘤细胞,+,骨髓瘤细胞,-,死亡,未融合的淋巴细胞,+,不增殖死亡,未融合的骨髓瘤细胞,-,死亡,对各个孔中的培养液进行检测，挑选所需克隆,杂交瘤细胞选择性培养及筛选（2）细胞组合 HGPRT 生长状,杂交瘤细胞的克隆化,概念：,建立单一细胞克隆,方法：,有限稀释法（如图）,克隆建立的标准：,连续两次以上,100%,阳性孔,单克隆抗体细胞株分装后液氮中保存，使用时复苏即可,杂交瘤细胞的克隆化概念：建立单一细胞克隆单克隆抗体细胞株分装,单克隆抗体的制备,体内法,将杂交瘤细胞接种于,BALB/C,小鼠或裸鼠的腹腔内，以诱生腹腔肿瘤和含,McAb,的腹水。一般可从一只小鼠获得,1-10 mL,腹水，约含,10-50 mg McAb,。,简单易行，但产量不高，且抗体中含正常小鼠的,Ig,，纯化有一定难度，常用于诊断试剂。,体外法,利用培养液直接培养，上清液中即含有相应的,McAb,无正常小鼠的,Ig,混杂，也无鼠类病毒污染的危险；但培养液用量大，成本高，最终产物中仍混有培养液中的各种成分。,单克隆抗体的制备体内法体外法,杂交瘤技术的原理,杂交瘤技术的原理,多抗与单抗的比较,多抗,（血清）,单抗,（腹水）,单抗,（培养上清）,特异性抗体含量（,mg/mL,）,0.1-1,0.5-5,0.005-0.025,无关,Ig,含量（,mg/mL,）,10,0.5-1,其他血清蛋白,大量,少,均一性,+,+,特异性,多决定簇,单决定簇,单决定簇,稳定性,较好,略差,略差,重复性,差,好,好,多抗与单抗的比较,基因工程抗体,基因工程抗体,（重组抗体）：是指应用,DNA,重组及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同的需要进行改造和装配，经导入适当的受体后重新表达的抗体。,目标：,降低免疫原性，降低分子量增加穿透性,技术手段：,用,DNA,重组和蛋白质工程技术对已有单抗进行改造，包括人源化抗体、小分子抗体、双价特异性抗体和抗体融合蛋白等的制备。,用抗体库技术筛选、克隆新的单抗。,基因工程抗体基因工程抗体（重组抗体）：是指应用DNA重组及蛋,4-3-3,抗体的纯化（,1,）,有多种方法可用来纯化多克隆和单克隆抗体。选择哪一种方法与抗体的用途、对抗体纯度的要求以及抗体的种类和来源（血清、培养上清液、腹水）有关。,粗纯：,盐析（,33%,饱和的硫酸铵可沉淀所有类型的,Ig,），简单方便，适合大量样品的处理，但纯度较差。,通用型纯化：,用抗体结合蛋白,Protein A,、,Protein G,或,Protein L,（从细菌中提取的细胞壁蛋白，可特异性与抗体在非特异性位点,Fc,区域结合）亲和柱。纯度较高，适合大规模抗体制备。,特异型纯化：,免疫亲和层析（将抗原固定制备成特异的亲和纯化柱），纯度特别高，特异性特别好。,4-3-3 抗体的纯化（1）有多种方法可用来纯化多克隆和单克,4-3-3,抗体的纯化（,2,）,技术,用途,优点,缺点,硫酸铵沉淀法,单独或与其它方法联用,便宜、容易、对大体积比较方便,中等产率,辛酸,-,硫酸铵法,单独或用于任何来源的,IgG,便宜、容易、适用于大体积、可获得纯的抗体,中等产率,多步骤,羟基磷灰石,-,硫酸铵,各种来源的抗体,适用于大体积，可获得近纯的抗体,多步骤,方法耗费较高,凝胶过滤或,离子交换色谱,相对纯的,IgM,便宜，适用于大体积,低盐浓度下蛋白,A,亲和色谱,纯的,IgG,，但,IgG1,产率低,对牛,IgG,结合弱，容易，单一步骤，高产率，可选择性洗脱,IgG,的不同亚型,方法昂贵，对,IgG1,的结合不好,高盐浓度下蛋白,A,亲和色谱,纯的,IgG,及,IgG1,适于多种抗体，单一步骤，高产率，可以选择性的洗脱,IgG,的不同亚型,方法昂贵，对,IgG1,的结合弱,4-3-3 抗体的纯化（2）技术用途优点缺点硫酸铵沉淀法单独,4-3-4,抗体性能的评价（,1,）,抗体的亲和力：,指,抗原决定簇,与,抗体结合位点,间的作用力。由于抗体为,二价,，抗原通常为,多价,，两者之间作用很复杂，一般用,表观亲和常数,表示抗体的亲和力。半抗原为,一价,，,是研究抗体亲和性的良好材料。（有多种方法可以测定亲和力）,抗体,Ab,与半抗原,Hp,之间的反应：,K,：,亲和力,K,1,：,结合常数；,K,2,：,解离常数,Ab,：,游离抗体结合位点的浓度,Hp,：,游离半抗原的浓度,AbHp,：已饱和的抗原结合位点浓度,4-3-4 抗体性能的评价（1）抗体的亲和力：指抗原决定簇与,平衡透析法测定,K,值,将,已知浓度的抗体和半抗原,溶液用半透膜隔离，达到透析平衡时测定游离半抗原的浓度。（仅半抗原可以出入半透膜，透析平衡时透析袋内外半抗原浓度相等）,c,Ab,：抗体结合位点的浓度,：每个抗体结合位点平均结合的半抗原数目,n,：每个抗体分子最多可结合的半抗原数目,Scatchard,曲线,平均亲和常数,K,0,：,=n/2,时的,平衡常数,K,0,平衡透析法测定K值将已知浓度的抗体和半抗原溶液用半透膜隔离，,4-3-4,抗体性质的评价（,2,）,抗体的效价（滴度）：,对给定的测试反应，能给出可观察到的抗原与抗体之间的反应时抗血清的最大稀释度。,效价越高，使用起来越经济；,效价是针对,原始,抗血清（多抗）或腹水（单抗）的，否则将失去不同抗血清性能比较的价值；,不同方法由于灵敏度不同所测得效价也不同（如免疫双扩散和或酶联免疫法测定的效价不同，无法比较）,4-3-4 抗体性质的评价（2）抗体的效价（滴度）：对给定的,4-3-4,抗体性质的评价（,3,）,特异性及交叉反应,促黄体发生激素（,LH,）和促卵泡激素（,FSH,）对甲状腺激素（,TSH,）多克隆抗血清交叉反应。,固定抗体，然后加入一定量的标记抗原（产生信号）和不同浓度的待测物质，孵化，分离、洗涤后测定信号。,4-3-4 抗体性质的评价（3）特异性及交叉反应促黄体发生激,4-3-5,抗体与抗原的可见性反应（,1,）,凝集反应：,颗粒性抗原（如细菌、细胞）与相应抗体，在适当电解质存在的条件下，经过一定时间后出现肉眼可见凝集块称为凝集反应。（,pH68,、,37,C,、,0.9% NaCl,）,4-3-5 抗体与抗原的可见性反应（1）凝集反应：颗粒性抗原,凝集反应,直接凝集反应：,指颗粒性抗原与相应抗体在电解质参与下直接结合出现凝集的现象，如人的,A,、,B,、,O,血型鉴定。,间接凝集反应：,将可溶性抗原,/,抗体吸附于与免疫无关的载体上（如人,O,型血红细胞、聚苯乙烯乳胶颗粒等），使之成为致敏载体颗粒，然后与相应抗体或抗原作用，在电解质参与下出现的凝集反应。如：病原微生物抗体、抗核抗体、抗甲状腺抗体、乙肝表面抗原（,HBSsAg,）、甲胎蛋白（,AFP,）等检测，妊娠诊断等,。,凝集反应直接凝集反应：指颗粒性抗原与相应抗体在电解质参与下直,4-3-5,抗体与抗原的可见反应（,2,）,沉淀反应：,可溶性全抗原（多价）与抗体（,2,价，多抗）在一定浓度比范围内形成大的交联结构而析出的现象。,4-3-5 抗体与抗原的可见反应（2）沉淀反应：可溶性全抗原,免疫比浊法（,immunonephelomytry,）,高浓度抗体溶液中加入少量可溶性抗原，即可形成一些肉眼看不见的小免疫复合物，它可使通过液体的光束发生散射，随着加入,抗原增多,，形成的,免疫复合物也增多,，,光散射现象,也相应加强。,免疫比浊法就是在一定的抗体浓度下，加入一定体积的样品，经过一段时间，用光散射浊度计（,nephelometry,）测量反应液体的浊度，来推算样品中的抗原含量。,本法敏感、快速简便，可用于定量测定免疫球蛋白的浓度,免疫比浊法（immunonephelomytry）高浓度抗体,凝胶免疫扩散,抗原、抗体在凝胶内扩散，当特异性的抗原抗体相遇后，就会在凝胶内的电解质参与下发生沉淀，形成,可见的沉淀线,。,一种抗原抗体系统只出现一条沉淀带；复合物抗原中的多种抗原抗体系统均可根据自己的浓度、扩散系数、最适比等因素形成自己的沉淀带（多条）。,抗原抗体扩散使用的凝胶种类很多，除琼脂外还有明胶、果胶、聚丙烯酰胺等，总称为免疫扩散。,凝胶免疫扩散抗原、抗体在凝胶内扩散，当特异性的抗原抗体相遇后,单向免疫扩散,将抗血清均匀地混合于琼脂糖凝胶内，打孔，加样。孔中待测样品的抗原辐射状向含抗体的胶内扩散，至抗原与抗体的量达一定比例时形成可见的沉淀环。一定条件下沉淀环的直径或面积与相应的抗原含量成正比。,本方法简便，易于观察结果，常用于定量测定某种特定蛋白质，其缺点是需,1-2,天才能看结果。,单向免疫扩散将抗血清均匀地混合于琼脂糖凝胶内，打孔，加样。孔,双向免疫扩散（,1,）,将抗原和抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由向四周扩散，在,相遇处形成沉淀线,。若反应体系中含有两种以上抗原,-,抗体系统，则小孔间可出现两条以上沉淀线。本法常用于抗原,/,抗体的定性检测、组成和两种抗原相关性的分析。,双向免疫扩散（1）将抗原和抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者,双向免疫扩散（,2,）,检测未知抗原,/,抗体,A,：浓度,Ag/Ab,近似，分子量,Ag,Ab,B,：浓度,Ag/Ab,近似，分子量,AgAb,F,：浓度,AgAb,抗原性质分析,A,：待检,Ag,与标准,Ag,完全