酶组织化学刘学光课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,*,*,酶组织化学,刘学光,复旦大学根底医学院病理学系,酶是生物体内具有催化作用的特殊蛋白质,一般催化剂的共性：,1. 用量少而催化效率高,2. 不改变化学反响的平衡点,3. 可降低反响的活化能,作为生物催化剂的特性：,1. 催化效率高： 比其他催化反响高107-1013倍,2. 高度专一性,3. 易失活,4. 酶活力受调节控制,5. 酶的催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关,酶的分类、命名,1.习惯命名法：底物，所催化的反响性质，来源，其他特点,2.国际系统命名法：酶的底物 + 催化反响的性质,3.主要分类：催化反响的性质，六个大类,1氧化复原酶:氧化复原反响,2移换酶：功能基团的转移反响,3水解酶：水解反响,4裂合酶：从底物上移去一个基团而形成双键，或其逆反响,5异构酶：同分异构体的相互转变,6合成酶：连接酶,催化一切必须与ATP分解相偶联且由两种物质双分子合成一种物质的反响,酶组织化学( Enzyme Histochemistry),通过细胞内固有的酶催化底物的作用，并借助显色反响，在切片或涂片上显示组织或细胞中内源性酶的活性及定位。,特点,1原位检测：组织定位,2显示酶活性,开展历史,Klebs(1868)年&Struve(1872)证明中性多核白细胞过氧化酶存在,1939年前，研究细胞内的氧化反响,1939年，Takamatsu、Gomori 碱性磷酸酶硫化钴反响 、银反响,随后：磷酰胺酶、 ATP酶、 脂酶、酯酶等,金属盐法，硫化钴法，偶氮色素法，偶氮色素四唑盐法，磷酸化酶组织化学证明法,电镜酶组织化学：酶更精准的定位,1955年 Scheldon、 Brandes 金属沉淀法,1967年 Seligman 锇黑化法,免疫组织化学：抗原抗体反响+酶反响,1970年 Sternberger 酶标抗体法,根底知识,一细胞内的酶的特性,* 水溶性，易扩散，难溶或不溶于有机溶剂,* 有机溶剂不同程度降低酶的活性,* 易受温度影响，对热耐受性弱,* 对枯燥耐受性强,二酶的定位,在细胞内或超微结构中存在于特定部位,浆膜 5-核苷酸酶,细胞膜 ATPase,线粒体,1. 酶促反响 细胞内的酶催化分解适宜的底物，生成中间产物，即：初反响物(primary reaction product, PRP)。,2. 显色反响 其中之一再与辅助物经一步或二步反响，生成有色不溶水的终反响物(final reaction product, FRP) 沉积在原位以显示酶的存在和活性大小。,酶组织化学的根本原理,Artifact PRP弥散 定位不准确,受3个因素影响：,1. 底物在酶催化下水解的速度 快,2. PRP在缓冲液中的弥散系数 小,3. PRP与辅助物反响的速度 快,辅助物浓度一般1 mg/ml,一般原那么,最大限度保存酶活性、防止弥散、保证反响产物的特异性,1. 标本处理及制片不能影响酶活性和分布,2. 底物对酶有特异性：酶抑制剂/冲动剂检测特异性,3. 底物和辅助试剂渗透好：迅速，同步,4. 辅助试剂不能影响酶活性和其它反响剂的渗透,5. PRP与辅助试剂反响要快,FRP必需是水不溶、有色且稳定的物质,6. 所有试剂不能与组织细胞有非特异性的吸附,主要步骤,1.组织处理：不固定冷冻切片，新鲜,固 定特殊固定剂，低温包埋,2.孵育,3.显色,4.显微镜下观察,各步骤需要注意的问题：,1. 组织处理：“最大限度保存酶活性,最常用：新鲜组织，快速冷冻，冰冻切片,长期保存需密封，-70,丙酮固定，低温脱水、包埋eg. -谷氨酰转肽酶,常规方法极少数酶类：氯乙酸酯酶,染色前的预固定 保持组织良好形态,丙酮:氯仿=1 : 1 4oC，510 分钟,多聚甲醛，甲醛，戊二醛,Note: 含有抑制酶活性/细胞化学成分活性的重金属盐Hg/Cr/Pb等,不用做固定剂,固定方法：浸泡固定 灌流固定,细胞涂片、培养细胞: 枯燥、密封、低温,2.切片制作: 一般812m,3.缓冲液：,用于配置固定液，漂洗液，酶反响孵育液,配制酶反响孵育液,1清洗器皿，过酸冲洗,2现用现配，保持新鲜,3) 严格配比，保持平和,4防止污染 过滤为佳,5优选试剂，注意纯度,4. 孵育反响,a. 温度及时间：37oC，15-30min,b. 孵育反响：切片孵育；漂浮孵育,5. 酶显示方法,1同步显示法,2二步显示法孵育后偶联法,3底物自身显示法,6.,酶特异性对照实验,用酶活性抑制剂,激活剂,采用无底物的孵育液,过固定或加热,改变孵育液,选择,PH,值,细胞内的定位差异,对结果分析要考虑的问题,经冷冻和原位固定后，酶究竟能保存多少?,酶是否在原位?,反响酶起了多少作用？,酶的活性是否代表了细胞生活时的状态?,沉淀的产物是否代表酶本身，时间延长是否会有改变，有没有扩散移位？,常用酶显示方法,1同步显示法：PRP + 辅助物 有色FRP,某些金属本身或化合物生成颜色eg.金属离子沉淀反响,硫化钴黑色 硫化铅棕黑色,2二步显示法孵育后偶联法,酶与底物作用产生的PRP沉积于原位，随后行显色反响,适用于：PH反响差异大；底物/辅助物易分解,局 限：要求PRP弥散度低,3底物自身显示法,可溶有色底物 不溶有色底物,底物分子重组,(1) 金属离子沉积法 酸性磷酸酶 Gomori反响1941年,以beta-甘油磷酸钠为底物，在酸性PH值(4.4-5.5)下，被酸性磷酸酶ACP水解，释放出磷酸盐。遇铅离子硝酸铅/醋酸铅生成磷酸铅(PRP)，再被S2-置换，最终生成硫化铅棕黑色沉淀。,酶促反响,R-PO4Na2+H20 R-OH +Pb3(PO4) 2,显色反响,Pb3(PO4)2 + 3 S2- 3PbS 棕黑色沉淀,该方法金属离子容易反响，沉着颗粒微细，反响色调美丽，反差明显 。,ACP,Pb,2+,激活剂：Mn2+ 抑制剂：NaF,定 位：溶酶体，ER， 胞浆,该酶活性比较高的器官：肝、肾、肠、脾、肾上腺,本卷须知:,铅离子 浓度是关键：非特异性吸附，NaF处理排除假阳性,孵育时间不宜过长：弥散，核非特异着色,铅法适用于:,ACP； 5-核苷酸酶； G6P酶；膜ATPase；,线粒体ATPase； TTPase(硫氨酸焦磷酸酶,2偶氮盐偶联反响,人工合成的酶底物在酶的作用下产生PRP，后者与重氮盐结合，引起偶联偶氮反响，使其生成不溶性的偶氮色素,碱性磷酸酶,a-萘基磷酸钠 磷酸氢二钠 + a -萘酚,-萘酚 + Fast Blue 偶氮染料,蓝色沉淀,酯酶、转肽酶、肽酶,酶,+,水,重氮盐种类不同，其偶氮颜色多样蓝色，紫色，红色，褐色等,常用重氮盐: 坚牢兰RR 坚牢兰B 坚牢兰RC 坚牢兰TR 坚牢兰B 六偶氮副品红 六偶氮新品红,常用底物：萘酚AS-B1 萘酚AS-D 萘酚AS-MX 萘酚AS-TR,应用：ALPase, ACPase 酯酶， 转肽酶，肽酶， beta-葡糖苷酶,方法：同时偶联法,后偶联法：防止重氮盐对酶的抑制作用,(3) 四唑反响,底物 氢离子 与无色四唑盐结合,常用四唑盐种类:,三苯四唑氯化物 TTC,蓝四唑盐 BT,新四唑盐 NT,硝基兰四唑盐(nitroblue tetrazolium, NBT),四硝基兰四唑TNBT,噻唑兰 (3(4,5-dimethyl thiazolyl-2YL) 2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT),红色,/,蓝色沉淀,脱氢酶,/,氧化酶,被还原,单胺氧化酶和几乎所有的脱氢酶都可以用四唑反响显示,例：四唑盐法显示琥珀酸脱氢酶,以琥珀酸钠盐为底物，在酶的作用下脱氢，人工合成的硝基蓝四唑NBT为受氢体，复原为紫色不溶物以代表琥珀酸脱氢酶的活性,琥珀酸脱氢酶是线粒体的标记酶之一，存在于所有有氧呼吸的细胞，以心肌、肾曲管上皮、肝细胞含量最丰富,(4) 联苯胺色素法,过氧化物酶联苯胺法,NH,2,NH,2,酶,+ H,2,O,2,NH,NH,棕色沉淀,2H,联苯胺,联苯胺蓝,过氧化物酶,催化各种物质被过氧化氢所氧化,见于乳腺、甲状腺、唾液腺、肥大细胞等,髓过氧化物酶见于中性/嗜酸性白细胞及其前体细胞，对造血系统疾病的鉴别诊断极为重要,辣根过氧化物酶HRP作为大分子示踪剂,DAB 3-二氨基联苯胺,(5) 靛蓝反响,底物被酶分解为二个PRP，其中之一可在一定条件下形成不溶的靛蓝,酯酶,吲哚酚酯 吲哚酚 + RCOOH,2 吲哚酚 靛蓝,胆硷酯酶、磷酸酶、糖苷酶、非特异酯酶,酶,+,水,氧化,酶组织化学的应用,了解组织、细胞的代谢活动,细胞类型的判断,了解细胞定位,用于肿瘤的研究,用于免疫组化和杂交组化的显示手段,1观察组织细胞代谢,心肌梗死2小时 琥珀酸脱氢酶,细胞色素氧化酶,HE无改变 异柠檬酸脱氢酶,磷酸化酶,Reyes Syndrome,又称脑病脂肪肝综合征，是一种急性脑病和肝脏脂肪浸润综合征,常常发生于某些急性病毒性传染病以后，多见于儿童，临床表现为：急性致死性脑病、脂肪肝、肝功能衰竭，高血氨,肝细胞琥珀酸脱氢酶活性下降,2细胞类型 / 细胞定位,氯乙酸酯酶 中性粒细胞,被抗CD66C, CD66D, CD88抗体的免疫组化代替,非特异性酯酶 Mf,被抗CD64、CD68抗体的免疫组化代替,乙酰胆硷酯酶 小肠 神经节细胞,ATP酶 皮肤 郎罕氏细胞,3癌前病变的标志,以肝癌发生为例,早期，HE无明显变化，但酶组织化学观察到,糖代谢紊乱,肝细胞癌,增生结节,GGT,AFP,G6P,小肝细胞,过渡细胞,卵圆细胞,肝细胞,嗜碱,嗜酸,4免疫组化和杂交组化的显示方法,与酶组化的不同，在于是检测引入酶,免疫组化常用HRPDAB + H2O2,杂交组化常用AP BCIP + NBT ,掌握内容,酶组织化学的根本原理,光镜酶组织化学的根本方法,几种重要的酶组织化学方法,Thanks for your attentions!,