分子生物学课程DNA课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五章,DNA及基因组,1,第五章 1,一,二,请在这里输入您的主要叙述内容,整体,概述,三,请在这里输入您的主要,叙述内容,请在这里输入您的主要叙述内容,2,一二请在这里输入您的主要叙述内容整体概述三请在这里输入您的主,BREAKTHROUGH OF THE YEAR 2007:,Human Genetic Variation,21 DECEMBER 2007 SCIENCE,3,BREAKTHROUGH OF THE YEAR 2007:,BREAKTHROUGH OF THE YEAR 2008:,Reprogramming Cells,iPS (induced pluripotent stem cell),Runners-Up:,Direct Views of Exoplanets,The DNA of Cancer,New Class of High-T Superconductors,Protein flopping and folding,Splitting Water,Beginning of Life, the Movie,Color Coded Fat,Computing the Basics,DNA on the Cheap,4,BREAKTHROUGH OF THE YEAR 2008:,拓展伽马射线天空,脱落酸受体 （abscisic acid, ABA）,发现模拟磁单极子,长寿健康,科学家揭示月球存在冰,基因治疗回来了,石墨烯研究取得新进展,哈勃重生,第一台X射线激光器闪亮登场,BREAKTHROUGH OF THE YEAR 2009:,Ardipithecus ramidus,（始祖地猿）,Runners-Up:,5,拓展伽马射线天空 BREAKTHROUGH OF THE Y,2010年科研热点,IPS细胞,宇宙射线眼,外显子组研究,生物化学战胜癌症？,人类太空飞行,6,2010年科研热点 IPS细胞 6,一、核酸研究简史,第一阶段：核酸的发现,第二阶段：发现核酸是遗传物质,第三阶段：为分子生物学奠定基,础的时期,第四阶段：分子生物学高速发展时期,第一节 DNA的结构与功能,7,一、核酸研究简史 第一阶段：核酸的发现第二阶段：发现核酸,1889年 R.Altman 从动物细胞与酵母,菌中制备了,核酸,1869年 F.Miescher 从脓细胞中得到,核质,“Nuclein”,第一阶段：核酸的发现,1894年 A.Kossel 和A.Neumann 从胸腺,中提取核酸,8,1889年 R.Altman 从动物细胞与酵母1869年,1930年 正式提出核酸分为两大类：,核糖核酸,（RNA）,脱氧核糖核酸,（DNA）,1904年 Hammars 证明核酸中的糖是戊糖.,1909年 Levene和Jacobs鉴定核酸中的糖,是D-核糖.,1912年 Levene 认为核酸由4种核苷酸,组成,1929年 Levene 和Jacobs 确定胸腺核苷酸,中的糖是2-脱氧-D-核糖,9,1930年 正式提出核酸分为两大类：1904年 Hammar,第二阶段：发现核酸是遗传物质,1944年 Avery等揭示了,DNA是细菌的遗传物质,有荚膜的光滑型肺炎球菌（S型） 致病,无荚膜的粗糙型肺炎球菌（R型） 不致病,10,第二阶段：发现核酸是遗传物质 1944年 Avery等揭示了,R,型菌,R,型菌,R,型菌,+ ,S,型菌DNA,S,型菌DNA,S,型菌DNA,（经蛋白酶水解） （经核酸酶水解）, ,部分克隆变为 部分克隆变为 不能变为,S型菌 S型菌 S型菌,11,R型菌 R型菌,1952年 Hershey,Chase 通过噬菌,体感染细菌的实,验表明,病毒的遗,传物质是DNA。,12,1952年 Hershey12,1953年,J.D.Watson 和 F.Crick建立,了,DNA双螺旋结构模型,第三阶段：为分子生物学奠定基础的时期,13,1953年 J.D.Watson 和 F.Crick建立第,1958,年 * Kornberg等发现了DNA聚合酶,( DNA polymerase),*,Meselson 等提出半保留复制，,阐明DNA复制的机理,* Crick提出了遗传信息传递的,中心法则,14,1958年 * Kornberg等发现了DNA聚合酶 * C,1965年 中国科学家人工合成牛胰岛素,1970年 Temin等发现了从RNA,DNA反转录现象，,使中心法则更完善,1961年以后Jacob、Nirenberg和 Monod 等取得三个有意义的进展：,1) 证实了mRNA携带着DNA到蛋白质合成机制所,需要的信息,2) 发现了遗传密码,3) 发现了蛋白质依靠tRNA和核糖体的帮助翻译,15,1965年 中国科学家人工合成牛胰岛素1970年 Temin,遗传信息传递的中心法则,（central dogma）,DNA,mRNA,转录,多肽链,翻译,蛋白质,翻译后加工,DNA,复制,逆转录,RNA复制,16,遗传信息传递的中心法则（central dogma）DNA,第四阶段：分子生物学高速发展时期,1.1971年 限制性内切酶发现，DNA的,分离成为可能,17,第四阶段：分子生物学高速发展时期1.1971年 限制性内,2. 直读核苷酸序列方法,(1975年Sanger发明,),18,2. 直读核苷酸序列方法 18,3. DNA体外重组技术,(1972年 Berg发明),19,3. DNA体外重组技术 19,1982年 中国科学家人工合成酵母,丙氨酸tRNA,1985年 Mullis建立PCR技术,1981年 T.Cech发现四膜虫rRNA前体的,自我拼接, 称为ribozyme.,20,1982年 中国科学家人工合成酵母1985年 Mulli,人类科学史上的三大工程,人类基因组计划,曼哈顿原子计划,阿波罗登月计划,1990年 美国正式启动人类基因组计划。,(human genome project,HGP),21,人类科学史上的三大工程 人类基因组计划曼哈顿原子计划阿波罗登,1999年7月,􁟥我国得到完成人类3号染色体,短臂上一个约30Mb区域的测,序任务，该区域约占人类整个,基因组的1%，简称1%项目。,提前两年于2001年8月 26日,绘,制完成“中国卷” ，赢得了国际,科学界的赞誉。,22,22,2003年4月,美、英、日、法、德、中等国政府首脑联,名发表六国政府首脑关于完成人类基因,组序列图的联合声明。,23,2003年4月23,1997年 英国爱丁堡罗斯林研究所首次,育成克隆羊。,24,1997年 英国爱丁堡罗斯林研究所首次24,水稻基因组（Rice Genome）,2001年10月，,中科院、科技部和国家计委联合向全世界宣布，中国率先完成水稻（籼稻）基因组工作“框架图”的绘制,2002年4月5日，,在Science 杂志上以封面文章的形式发表。,25,水稻基因组（Rice Genome）2001年10月，25,*后基因组计划（post-genome project）,又称为功能基因组学,（functional genomics）,* 蛋白质组（proteome）计划,又称为蛋白质组学（proteomics）,26,*后基因组计划（post-genome project）,* 随着许多新的RNA功能陆续被发现，,2000年各国科学家提出了RNA组的研究，,称为RNA组学（RNomics）,* 生物信息学 (bioinformatics),* 系统生物学 (systems biology),27,* 随着许多新的RNA功能陆续被发现， 27,二、DNA研究的临床应用,1. 疾病发病机理的研究,1） 遗传性疾病,基因变异或基因缺陷是疾病发生的根,本原因,如:,镰刀状红细胞性贫血,的致病因素是由,于珠蛋白第6位氨基酸由谷氨酸突变为,缬氨酸。,28,二、DNA研究的临床应用 28,如：,心血管疾病,型高脂蛋白血症的形成主要是由于,ApoE基因中第112位和第158位的G和C,发生变异，蛋白质肽链上原来 Arg 变成,Cys， 失去与ApoE受体结合的能力，使,血脂升高,29,29,2） 肿瘤,癌基因激活和抑癌基因失活分化受阻,肿瘤细胞（永生型）,如：上世纪70年代发现了癌基因,（,H-ras,) 与抑癌基因(,Rb,) 。,30,2） 肿瘤30,2. 疾病的基因诊断,DNA诊断：,*快速DNA点杂交,*限制性内切酶酶谱分析法,*DNA限制性片段长度多态性,分析法 （RFLP）,*聚合酶链反应（PCR）,产前诊断、植床前诊断,31,2. 疾病的基因诊断产前诊断、植床前诊断31,A B,Kb 1 2 3 1 2 3 Kb,8.3 hcs-L,6.7 hcs-B,5.8 hcs-A,3.8,hGH-N,3.0 h,GH-V,1.2 h,HG-V,25.0,21.8,17.9,14.8,单纯性生长激素缺乏症(IGHD),(isolated growth hormone deficience),图中 A为BamHI酶解片段与hGH cDNA探针杂交放射自显影图,B,为,HindI,酶解片段与hGHcDN,A,探针杂交放射自显影图,1 为正常人. 2 为IGHD患者. 3 为杂合子DNA,hcs 为人绒毛膜促乳素. h,GH 为人生长激素,32,A,父亲,母亲,孩子,GTCGTACGTGA,CACACACACACACACACACA,GTACGATACGT,GTCGTACGTGA,CACACACACACACACACACA,GTACGATACGT,GTCGTACGTGA,CACACACACACACACACACACA,GTACGATACGT,GTCGTACGTGA,CACACACACACACACACA,GTACGATACGT,GTCGTACGTGA,CACACACACACACACACACA,GTACGATACGT,GTCGTACGTGA,CACACACACACACACACA,GTACGATACGT,父亲 母亲 孩子,46bp,42bp,40bp,42bp,42bp,46bp,40bp,42bp,40bp,PCR结果的凝胶电泳：,图：某个CA2核苷酸重复的微卫星在一个家系中的PCR检测结果示意图,短串联重复(short tandem repeat,STR)多态性分析,33,父亲母亲孩子GTCGTACGTGACACACACACACA,3. 疾病的预防与基因治疗,1）采用基因工程产生疫苗药物,2）基因治疗,34,3. 疾病的预防与基因治疗34,世界首例癌症疫苗,由美国Merck公司研制，专门针对人乳头状瘤病毒（HPV）的疫苗“加德西”（Gardasil），2006年6月8日获得美国FDA的上市批准。这是世界上第一个，也是惟一一个获准上市的用来预防由HPV6、11、16和18型引起的宫颈癌和生殖器官癌前病变的癌症疫苗，保护率超过95%。,该癌症疫苗的推出，将是人类首次真正尝试通过疫苗将一种癌症彻底消除。,德国科学家拉尔德楚尔豪森,2008年诺贝尔生理学或医学奖,35,世界首例癌症疫苗由美国Merck公司研制，专门针对人乳头状瘤,构件分子核苷酸,nucleotide,核苷,nucleoside,磷酸,phosphate,碱基,bases,戊糖,pentose,嘧啶,pyrimidine,嘌呤,purine,核糖,ribose,脱氧核糖,deoxyribose,三、核酸,的结构,核酸,（多核苷酸,Polynucleotide,),（一）分子组成,36,构件分子核苷酸nucleotide核苷nucleoside,1.含氮有机碱,（1）嘧啶碱：胞嘧啶,C,ytosine,胸腺嘧啶,T,hymine,尿嘧啶,U,racil,（2）嘌呤碱：腺嘌呤,A,denine,鸟嘌呤,G,uanine,37,1.含氮有机碱,38,38,碱基上有修饰：,核苷的大写字母前加上代表修饰基团,的小写字母右上方写明碱基的第几位,m,2,G 表示 2-N-甲基鸟苷,位置,m,3,2 2 7,G 表示 N,2,，N,2,，7-三甲鸟苷,数量,S,4,U 表示 4-硫代尿嘧啶,甲基,(3)稀有碱基,39,碱基上有修饰：m2G 表示 2-N-甲基鸟苷,R,苷,40,R苷40,2. 戊糖,41,2. 戊糖41,顺式腺苷,反式腺苷,3.核苷,：,C-N 糖苷键,嘌呤碱,N9,嘧啶碱,N1,戊糖,C1,42,顺式腺苷反式腺苷3.核苷：C-N 糖苷键嘌呤碱N9戊糖C14,* 顺式和反式构象的定义:,相对于糖的一部分,碱基沿糖苷键C-N(对于嘧啶是N 1,对嘌呤是N9)。可以采取2种主要的取向,顺式和反式构象。,43,* 顺式和反式构象的定义:43,假尿苷,5,1,44,假尿苷5144,4. 核苷酸,45,4. 核苷酸45,1,2,3,4,5,46,1234546,47,47,5,3,环核苷酸,cAMP 、 cGMP,表示磷酸与3、5核苷,羟基相接,48,53环核苷酸48,（二）、游离核苷酸的功能,ATP、 GTP、 UTP、 CTP 参于代谢,5FU（5氟尿嘧啶） 抗癌药物,6MP（6巯基嘌呤） 抗癌药物,5-碘脱氧尿苷 治疗病毒性心肌炎,AZT 抗AIDS病毒,（Azido thymidine 叠氮基胸苷）,cAMP 、cGMP 第二信使,49,（二）、游离核苷酸的功能49,（三）DNA的一级结构,1. DNA的一级结构是指脱氧核苷酸,（碱基）在DNA分子中的排列顺序,2. DNA分子中脱氧核苷酸的连接方式,3，5磷酸二酯键,3.直线形DNA有二个末端：,5磷酸末端,3羟基末端,50,（三）DNA的一级结构 50,A. 分子结构式,B线条式,C字母式,51,A. 分子结构式51,1) 端粒DNA的结构,真核生物线性染色体末端的DNA序列, 称为端粒。,端粒DNA序列相当保 守，,端粒DNA的3末端是由数百个串联的重复,序列,，,长5-10 kb。,重复,序列由,G-T丰富的6个核苷酸组成。,人:5-,AGGGTT,AGGGTT-3,4. 端粒（telomere）DNA结构与功能,52,1) 端粒DNA的结构 4. 端粒（telomere）,荧光原位杂交显示端粒和端粒序列,53,荧光原位杂交显示端粒和端粒序列53,端粒的重复序列是由端粒酶（telomerase）合成后添加到染色体末端。端粒酶是一种核糖核蛋白复合物，具有逆转录酶的性质，以物种专一的内在RNA为模板，把合成的DNA添加到染色体的3端。,端粒起到,细胞分裂计时器,的作用，核苷酸复制和基因,DNA,每复制一次，端粒减少,50-100 bp,，正常体细胞染色体缺乏端粒酶活性，故随细胞分裂而变短，细胞随之衰老。人的生殖细胞，部分干细胞染色体，肿瘤细胞和永生细胞系具有端粒酶活性。,54,端粒的重复序列是由端粒酶（telomerase）合成后添加到,55,55,2）端粒DNA的功能,a 保证线性DNA的完整复制,b 维持染色体的稳定,c 决定细胞的寿命,56,2）端粒DNA的功能56,2009诺贝尔生理学或医学奖 - 端粒酶（telomerase）,Elizabeth Blackburn,Jack Szostak,Carol Greider,57,2009诺贝尔生理学或医学奖 -,1)DNA分子十分巨大，最小的DNA分子,也包含有几千bp，分子量在10,6,以上。,人类基因组含有约3.1647 10,9,bp。,5. DNA的一级结构特点,58,1)DNA分子十分巨大，最小的DNA分子5. DNA的一,59,59,2)每一物种DNA都具有其特有的碱基,组成,3) 有些碱基常被甲基修饰，称为甲基,化(methylation),60,2)每一物种DNA都具有其特有的碱基3) 有些碱基常被甲基,(1) 细菌DNA甲基化, 各种细菌都具有一定的甲基化模式，,在DNA分子中平均 1%的碱基被甲,基化。,甲基化最多的是腺嘌呤和,胞嘧啶,61,(1) 细菌DNA甲基化 各种细菌都具有一定的甲基化模式,细菌DNA甲基化作用的生物学意义,a. 影响DNA的构象, 影响蛋白质与DNA的,相互作用, 以调节DNA 复制、转录、修,复、重组和包装的过程。,如：发生在-G,A,TC-的腺嘌呤，于DNA,复制产生的错误碱基修复中起作用,b. 多发生于内切酶酶切位点，防止噬菌体,入侵，是一种细菌自身保护机制。,62,细菌DNA甲基化作用的生物学意义62,( 2)真核细胞的DNA甲基化, 真核细胞DNA中,胞嘧啶,甲基化最多，,约5%,甲基化为5-甲基胞嘧啶，大多,数甲基化发生在,CpG,重复序列中。,真核细胞中甲基化酶与去甲基化酶成,双成对存在，都对CpG二核苷酸序列,有特异性，使甲基化与去甲基化成为,可逆的生物学过程。,63,( 2)真核细胞的DNA甲基化63, 多种基因的启动子区和第一外显子（60）,富含CpG，称为CpG岛，通常为非甲基化,状态,。,散在的CpG则为甲基化的。, DNA甲基化通常抑制基因表达，与人类,发育和肿瘤疾病关系密切。,64, 多种基因的启动子区和第一外显子（60） 6,*,CpG岛：,在基因的末端通常存在一些富含,双核苷酸“CG”的区域，称为“CpG岛”,通过分析5-甲基胞嘧啶在真核细胞基因组,中的分布, 发现 CpG岛的存在，这些区域,是,非甲基化,的，通常为1-2kb，绝大多数,在基因的5 末端。,65,* CpG岛：在基因的末端通常存在一些富含65,在人类基因组内，存在有近3万个CpG岛；,在大多数染色体上，平均每100万碱基含,有515个CpG岛，这些CpG岛不仅是基,因的一种标志，而且还参与基因表达的调,控和影响染色质的结构。,66,在人类基因组内，存在有近3万个CpG岛；66,6. DNA的一级结构的测定,1) 双脱氧末端 终止法Sanger法,2) 化学法Maxan-Gilbert法,67,6. DNA的一级结构的测定67,Sanger双脱氧末端 终止法测序的基本原理,68,Sanger双脱氧末端 终止法测序的基本原理68,Maxan-Gilbert化学法测序基本原理,69,Maxan-Gilbert化学法测序基本原理69,DNA自动序列测定的基本原理,70,DNA自动序列测定的基本原理70,第一步：加入复制终止剂,荧光检测探头,电泳，看谁跑得快,71,第一步：加入复制终止剂荧光检测探头电泳，看谁跑得快71,第二步：荧光检测,72,第二步：荧光检测72,DNA全自动分析仪：,ABI Prism,3700型全自动遗传分析仪,安玛西亚DNA序列分析系统型号：MegaBACE 500/1000/4000,73,DNA全自动分析仪：ABI Prism 3700型全自动遗,（四）DNA的二级结构,Dr.Crick Dr.Watson,74,（四）DNA的二级结构 Dr.Crick,1.,DNA双螺旋结构,的提出,Watson和Crick在1953年提出了著,名的,DNA双螺旋结构模型,。这个模,型不仅解释了DNA的理化性质，而,且将结构与功能联系起来，大大推,动了分子生物学的发展。,75,1. DNA双螺旋结构的提出75,* 双螺旋提出的根据,1) DNA纤维晶体的x-衍射研究,1952年 Wilkins等,2) Chargaff的碱基分析,AT GC ATGC的比值,不同来源DNA是不同的,3) 碱基和核苷酸的结晶学资料,76,76,Chargaff,原则,（1）不同种生物DNA分子中的核苷酸排列顺序不同,（有种族特异性）,（2）同种生物不同组织器官细胞中DNA分子的核苷酸,排列顺序相同,(无组织器官特异性),（3）某一特定生物，其DNA碱基组成恒定,（4）任何生物DNA碱基组成都符合,A=T， G=C， A+G=T+C,77,Chargaff 原则77,78,78,a. DNA双链反向平行,b. 碱基配对,* AT GC,* 碱基是一个平面环分子。碱基平面垂直,于螺旋轴,* 相邻碱基相距0.34nm，每10个碱基旋,转1圈，双螺旋螺距为3.4nm，相邻两个,碱基正好相差36,0,2. DNA的双螺旋,结构的特点：,1) B型DNA结构,79,a. DNA双链反向平行2. DNA的双螺旋79,80,80,碱基配对结构,基,81,碱基配对结构基81,c在DNA双螺旋分子上交替存在着,大沟和小沟,蛋白质通过大沟和小沟识别碱基序,列的特异性，其中大沟对于的识别、,结合尤为重要。,82,c在DNA双螺旋分子上交替存在着82,d维持双螺旋的力量,氢键,碱基堆积力（base stacking force）,碱基平面叠在一起，存在Van der Waals力,碱基 疏水性，在双螺旋内部形成疏水的力量,离子键,83,d维持双螺旋的力量83,3. DNA的右手螺旋和左手螺旋,* DNA构象与核苷酸顺序碱基组成有关,并取决于环境条件（盐类、相对湿度）,* 主要构象类型：,右手螺旋：A、B、C、D、E、T 型DNA,左手螺旋：Z 型DNA,84,3. DNA的右手螺旋和左手螺旋84,湿度和盐类对DNA构象的影响,多核苷酸,盐类,相对湿度,构象类型,Na,+,75,A,Na,+,92,B,Li,+,44,C,Li,+,66,B,T2,噬菌体,DNA,Na,+,60,T,DNA,RNA,杂合链,Na,+,33,92,A,天然,RNA,（逆转录病毒）,Na,+,高达,92,A,Na,+,43,Z,Na,+,高达,92,A,Li,+,81,B,天然,DNA,Poly (dG-dC),85,湿度和盐类对DNA构象的影响多核苷酸盐类相对湿度构象类型N,86,86,右手螺旋,1）B型 生理条件下最普遍的形式,2）A型 RNA双螺旋及DNARNA,杂交链（空间位阻小，有利于转录）,3）C型 线粒体DNA及一些病毒,4）D型、E型 存在于噬菌体等生物中,87,右手螺旋87,3. 左手螺旋Z型DNA,1) 发现:,1979年 A. Rich等人工合成六聚体,d（CGCGCG）单晶进行X射线,衍射分析，数据表明是Z型骨架,左手双螺旋DNA,2) ZDNA的结构特点:,每个螺旋由12个碱基对构成，螺距,4.46nm，直径 1.8nm,88,3. 左手螺旋Z型DNA88,89,89,b. 脱氧胞苷的碱基取反式构象，脱氧,鸟苷的碱基是顺式。在ZDNA中,GC交替而出现顺式和反式构象,交替。使糖-磷酸的主链的走向呈,“之”字型，这,样Z-DNA主链呈锯,齿状（Zig-Zag）走向。,c. 大沟消失，小沟变深,90,b. 脱氧胞苷的碱基取反式构象,d. 体内存在的Z-DNA序列特点:,(1) DNA序列必须是嘌呤嘧啶交替排列,如： CGCGCG,GCGCGC,(2)序列中必须有5-甲基胞嘧啶的存在,91,d. 体内存在的Z-DNA序列特点: 91,E. 与Z-DNA结合的特殊蛋白质,FZ-DNA有利于DNA 的负超螺旋,打开,G抗Z-DNA抗体,92,E. 与Z-DNA结合的特殊蛋白质92,3）Z-DNA的功能：,基因表达有关,Z-DNA抗体常常紧密地结合在染色,体的疏松部位,增强转录活性的位点。,93,3）Z-DNA的功能：93, 基因调控,Hochschild 等报道,一旦发现细菌调控,蛋白紧密结合于它的调控位点, 就通过,RNA聚合酶来激活相关基因的表达 ,Z-DNA可能参与识别调控蛋白质。,94, 基因调控94, 基因重组,Willia等做的黑粉菌实验指出, Z-DNA,在基因重组中起非常重要的过渡作用.,在黑粉菌中有一种rec1酶能使染色体,第一次配对后互相交换片段, 在配对时,由rec1酶使Z-DNA的双链产生 , 并且这,种酶与Z-DNA亲和力比B-DNA高75,倍, Z-DNA与rec1酶紧密结合是这一,时期的主要特征.,95, 基因重组95, 疾病治疗与新药开发,Kim等研究表明, 一种关键的痘病毒蛋,白 E3L蛋白(已知该蛋白是病毒摧毁动,物细胞的防御系统所必需的)是通过,Z-DNA结合、干扰防御系统的运行来,行使功能的。E3L 是牛痘的致病蛋白,质之一，通过修饰该蛋白质的活跃位,点可以使其丧失功能。,96, 疾病治疗与新药开发96,表2 右手螺旋与左手螺旋DNA分子的比较,_,项 目 A-DNA B-DNA Z-DNA,_,螺旋方向 右旋 右旋 左旋,每转1圈碱基数 11 104 12,螺旋直径 2.55nm 2.37nm 1.84nm,螺距 2.46nm 3.32nm 4.56nm,碱基平面的倾角 19,o,l,o,9,o,大沟 窄，很深 宽，较深 平,小沟 很宽，浅 窄，较深 很窄, 深,_,_,97,表2 右手螺旋与左手螺旋DNA分子的比较97,4.三螺旋DNA（H DNA）,三螺旋DNA（triple-helical DNA),三链DNA（triple strands of DNA),是一条DNA链在DNA的大沟与DNA,双螺旋中的一条DNA链以氢键相结,合形成的三股螺旋结构。,98,4.三螺旋DNA（H DNA）98,99,99,1）三螺旋DNA结构：,（1） 三螺旋DNA是在DNA双螺旋结构的,基础上形成的，三链区的三链均为,同型嘌呤（homo purine HPU）或,同型嘧啶 (homo pyrimidine HPY）,100,1）三螺旋DNA结构：100,（2）,根据三条链组成及相对位置又可分为,Pu-Pu-Py（偏碱性介质中稳定）,Py-Pu-Py（偏酸性介质中稳定）,（3） 链中的碱基配对方式两个碱基符合,Watson-Crick碱基配对“ - ”，另个,碱基 按Hoogsteen模型“ ”,即 T A - T,C, G - C,(第三位上的 “C” 必须质子化),A,A - T,101,（2） 根据三条链组成及相对位置又可分为（3） 链中,102,102,嘧啶核苷酸,嘌呤核苷酸,(a)嘧啶-嘌呤-嘧啶三螺旋DNA序列,(b)三螺旋DNA结构示意图,a,b,103,嘧啶核苷酸嘌呤核苷酸(a)嘧啶-嘌呤-嘧啶三螺旋DNA序列a,2） 生物学意义及应用：,(1)三螺旋DNA结构常位于DNA一些,重要的部位。如复制的起始点或终,点，转录的调控区或调节蛋白结合,位点以及DNA重组位点，提示与这,些功能相关。,(2)丰富了DNA结构学说,104,2） 生物学意义及应用：104,b. 用寡聚DNA片段封闭转录因子结合,点关闭有害基因活病毒基因。,（抗肿瘤，病毒，寄生虫等）,(3) 基因治疗中的应用,a. 单链DNA片段可携带切割剂（核酸,内切酶，EDTA-Fe等）携带至DNA,的特定位点，选择性切断DNA。,105,b. 用寡聚DNA片段封闭转录因子结合 (3),5.四螺旋DNA,1)发现在真核染色体末端含有一个,富含G的单链 DNA 尾巴，它在体内,的超螺旋 应力作用下，可自身回折,形成 Hoogsteen G-G 碱基对。两个,DNA 分子或染色体分子可彼此连接,起来形成一个局部的四螺旋结构。,106,5.四螺旋DNA106,107,107,2) 四螺旋DNA的结构,*四螺旋结构由多个G-四碱基体形,成右手螺旋，每圈含13个四碱基,体DNA。,*在四碱基体中，四条链以对称和反,对称构象交替存在。,108,2) 四螺旋DNA的结构 *在四碱基,109,109,3) 可能的生物学意义,两个DNA分子或染色体分子可彼此连,接起来形成一个局部的四螺旋结构,这种,结构可能起着稳定染色体的作用,110,3) 可能的生物学意义110,（五）DNA超螺旋结构（三级结构）,1.DNA三级结构就是指双螺旋DNA链,进一步扭曲、盘旋形成超螺旋结构。,*超螺旋：,负超螺旋（negative supercoil）,正超螺旋(positive supercoil),111,（五）DNA超螺旋结构（三级结构）111,2. 生物体的闭环DNA都以超螺旋形式,存在,如质粒、病毒、线粒体的DNA,112,2. 生物体的闭环DNA都以超螺旋形式112,（六）真核生物染色体DNA,真核生物DNA分子呈线状，其超螺旋,结构不同于上述环状DNA。它们主要存,在于染色体，以,核小体,的形式再进一步,盘绕折叠。,113,（六）真核生物染色体DNA 真核生物DNA分子呈线状，,*核小体,Nucleosome,1）核小体核心：组蛋白Histone八聚体,（,H2A,H2B,H3,H4,各两分子）,1.75,圈,DNA,超螺旋（,146bp,）,2）连接区：组蛋白,H1,和,20-80 bp DNA,双螺旋,114,*核小体Nucleosome114,115,115,DNA,（2nm）,核小体链（ 11nm，每个核小体200bp）,纤丝（ 30nm，每圈6个核小体）,突环（ 150nm，每个突环大约75000bp）,玫瑰花结（ 300nm ，6个突环）,螺旋圈（ 700nm，每圈30个玫瑰花）,染色体（ 1400nm，,每个染色体含10个玫瑰花200bp）,真核生物染色体DNA组装,116,DNA核小体链（ 11nm，每个核小体200bp）纤丝（ 3,DNA的质量、长度和浓度计算方法,1. 长度 0.34 bp = （nm),2. 分子质量 660 bp = （dal),3. 浓度 50 OD,260nm,= g /ml,(光径为1cm),117,DNA的质量、长度和浓度计算方法117,(七)DNA的变性、复性和杂交,1. 变性（denaturation),1）概念 ：,当DNA的二级结构和三级结构受到物理化学等因素的破坏而解体，其一级结构核苷酸间共价键并不断裂，使配对碱基间氢键断裂，有序的螺旋解离成无序单链的过程称为变性。,118,(七)DNA的变性、复性和杂交118,*引起变性的因素：,常见的有加热、酸、碱、乙醇、,丙酮、尿素、甲酰胺等作用，,119,*引起变性的因素：119,2) 变性过程中DNA物化性质发生改变,增色效应,(hyperchromic effect), 浮力密度, 黏度, 旋光度变小, 沉淀速度,120,2) 变性过程中DNA物化性质发生改变120,3）DNA的熔解曲线(melting curve),熔解温度（melting temperature, Tm ）,通常将 50% DNA 分子变性时的温度,称为熔解温度。,* 一般DNA在生理条件下 T,m,在,85-95,o,C之间,121,3）DNA的熔解曲线(melting curve,DNA的熔解曲线,122,DNA的熔解曲线122,(2) 影响Tm的因素,.,DNA的碱基组成,（GC）Tm,（GC）每增加1, Tm线性增加0.41,（GC）为40，Tm为87,（GC）为60，Tm为95,123,(2) 影响Tm的因素123,.介质中的离子强度,盐浓度Tm, 变性过程跨越的温,度范围更狭窄 , 如单价离子浓度增,加10倍, Tm增加约16.6 ,. 变性剂,50甲酰胺可使Tm降低30,. DNA的均一性,124,.介质中的离子强度. 变性剂. DNA的均一性124,离子强度对Tm的影响,125,离子强度对Tm的影响125,2. 复性 (renaturation),(1) 概念：,变性的两条DNA单链在合适条件下，可按原来的碱基配对再结合在一起，形成双螺旋结构。,* 退火（annealing）:,加热变性的DNA分子在温度缓慢,降低时可恢复到原来正常DNA的结,构, 这个复性过程又称“退火”,126,2. 复性 (renaturation)* 退火（ann,127,127,图3-26 DNA热变性过程的两种冷却过程示意图,128,图3-26 DNA热变性过程的两种冷却过程示意图128,(2) 影响DNA复性因素,1）,DNA序列,简单序列 复性快,2）,DNA浓度,浓度高 复性快,3）,DNA片段大小,小片段DNA易于复性,129,(2) 影响DNA复性因素129,4） 温度,复性最佳温度为Tm-25（一般为,60，50甲酰胺存在最佳温度42）,5）,溶液中离子浓度,盐浓度需在0.4molL 以上,130,4） 温度 130,3. 杂交（hybridization）,1) 概念: 不同来源但具有同源性的,两条DNA或RNA单链， 按碱基配,对的原则结合，这一过程为杂交，,可以是,DNA-DNA、RNA-DNA、,RNA-RNA之间进行。,131,3. 杂交（hybridization）131,132,132,2) 核酸分子杂交常用的技术,Southern印迹分析法,1975年英国科学家 Southern 首先,提出并利用此方法检查基因组DNA,的特异序列。,Northern印迹分析法,根据Southern法的基本原理，分,析检测RNA,。,133,2) 核酸分子杂交常用的技术 Northern印迹分析法,提问与解答环节,Questions and answers,134,提问与解答环节134,结束语,感谢参与本课程，也感激大家对我们工作的支持与积极的参与。课程后会发放课程满意度评估表，如果对我们课程或者工作有什么建议和意见，也请写在上边,135,结束语135,谢谢您的观看与聆听,Thank you for watching and listening,136,谢谢您的观看与聆听136,