免疫组化课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,可编辑,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,可编辑,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/9/14,#,免疫组织、细胞化学,（,immunohistochemistry,，,IHC),免疫组织、细胞化学（immunohistochemistr,1,第一章 理论基础,theoretic basis,免疫组织细胞化学是一门原位示踪染色技术。学科交叉的产物。,第一章 理论基础 theoretic basis,2,理论基础是利用荧光素、生物素或地高辛等标记的抗体（或抗原）对组织切片或细胞涂片上的细胞或组织内的相应抗原（或抗体）的动态变化进行原位显示,经过组织化学的呈色反应之后，用显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察。实现,定性、定位或定量,检测,理论基础是利用荧光素、生物素或地高辛等标记的,3,基本特点是“特异,灵敏，准确，形态、 机能、 代谢三位一体”，系分子病理学研究的常用手段。,基本特点是“特异, 灵敏，准确，形态、 机能,4,学习的重点有四：,1.,名词概念；,2.,技术原理；,3.,操作要领；,4.,结果判断原则（尤其是对照染色和假阳性 假阴性的判别）。,学习的重点有四：,5,免疫组化发展概况,免疫组化的优点,相关的免疫学理论,免疫组化应用范围,染色技术和注意事项,凡是能作抗原、半抗原的物质，如蛋白质、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受体及病原体等都可用相应的特异性抗体在组织、细胞内将其用免疫细胞化学手段检出和研究。,抗原,抗体反应的,一对一性,大体观察,目的：寻找,“,特征性,”,的组织学改变,组织学观察,（,HE,染色 特殊染色,-,组织化学方法）,免疫组化发展概况,免疫组化发展概况免疫组化的优点相关的免疫学理论免疫组化应用范,6,免疫组化课件,7,免疫组化课件,8,免疫组化发展概况,免疫组化的优点,相关的免疫学理论,免疫组化应用范围,染色技术和注意事项,免疫组化在病理诊断中的应用开始于,20,世纪,70,年代，,90,年代已经在国外病理科列为病理技术室的常规工作，我国,90,年代开始在病理诊断中逐渐普及。,免疫组化的发展过程,年,代,研究者,事,件,1941,年,Coons,实用免疫荧光技术,1948,年,Fagraeus,进一步发展免疫荧光技术,1970,年,Sternberger,抗体酶标记技术,1974,年,Taylor,证实组织中的浆细胞免疫组化,1975,年,Kohler,单克隆抗体技术,1981,年,Hsu,ABC,法,90,年代以来,SP,法，原位杂交,免疫组化发展概况免疫组化的优点相关的免疫学理论免疫组化应用范,9,免疫细胞化学的突出优点是：,1.,高度的特异性,免疫组化发展概况,免疫组化的优点,相关的免疫学理论,免疫组化应用范围,染色技术和注意事项,抗原抗体反应是特异性最强的反应之一，免疫细,胞化学所用的抗体必须是特异性强的多价或单价抗体，,具有高度的认别能力，在抗原识别上可达到单个氨基,酸的水平，这是其它组织化学方法难以相比的。,免疫细胞化学的突出优点是：免疫组化发展概况免疫组化的优点相关,10,2.,敏感性高,免疫组化发展概况,免疫组化的优点,相关的免疫学理论,免疫组化应用范围,染色技术和注意事项,现代免疫细胞化学采用各种有效方法最大限度,保存细胞和组织内待检物质的抗原性，采用各种增,敏方法，使用高度敏感的和高亲和力的抗体，保证,可检出细胞内超微量的抗原分子，用显微镜和电子,显微镜观察结果，因此，它是在细胞、分子水平或,基因水平的检测技术。,2. 敏感性高免疫组化发展概况免疫组化的优点相关的免疫学,11,免疫组化发展概况,免疫组化的优点,相关的免疫学理论,免疫组化应用范围,染色技术和注意事项,3.,方法步骤统一,若掌握一种技术操作方法步骤，则一通百通。,4.,形态、机能和代谢密切结合,是一种综定性、定位和定量密切结合；形态、,机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。,免疫组化发展概况免疫组化的优点相关的免疫学理论免疫组化应用,12,免疫细胞化学技术在细胞、染色体或亚细胞水,平原位检测抗原分子，是其它任何生物技术难以达,到和代替的，它能在细胞、基因和分子水平同时原,位显示基因及其表达产物，形成了新的检测系统，,为生物学、医学和各个领域分子水平的研究与诊断，,开拓了广阔的前景。,免疫组化发展概况,免疫组化的优点,相关的免疫学理论,免疫组化应用范围,染色技术和注意事项,免疫细胞化学技术在细胞、染色体或亚细胞水免疫组化发展概况,13,免疫细胞化学技术日新月异，以惊人的速度发,展，尤其是和分子生物学的理论和技术日益结合密,切，基因探针、核酸分子杂交技术、原位,PCR,技术、,核酸杂交和免疫细胞化学双标记技术、电镜杂交技,术等成为免疫细胞化学技术的新发展成员，标志着,免疫细胞化学又进入了一个新的发展阶段。,免疫组化发展概况,免疫组化的优点,相关的免疫学理论,免疫组化应用范围,染色技术和注意事项,免疫细胞化学技术日新月异，以惊人的速度发免疫组化发展概况,14,核酸分子探针,-,杂交,-,免疫细胞化学放大和显示杂交信,号，可以称为杂交免疫细胞化学。所以，核酸分子探针的研制已成为免疫细胞化学实验室中必需的试剂生产技术，需要学习引进分子生物学的有关技术和设备，建立相应的基因工程实验条件，把基因重组技术、单克隆抗体技术和免疫细胞化学技术融合在一起，就成为了现代免疫细胞化学的新主体。更高倍电镜技术和图像分析，流式细胞仪技术的不断更新，把原位定性、定位和定量技术提高到了更新的水平，形成了免疫细胞化学发展的两翼，向着生物科学更广阔领域飞翔。,免疫组化发展概况,免疫组化的优点,相关的免疫学理论,免疫组化应用范围,染色技术和注意事项,核酸分子探针- 杂交-免疫细胞化学放大和显示杂交信免疫组化发,15,免疫组织、细胞化学的全过程包括：, 抗原提取和纯化, 免疫动物或细胞融合（单克隆抗体）, 抗体效价检测和提取, 标记抗体, 细胞和组织切片标本的制备, 免疫细胞化学反应和显色, 观察和记录结果,免疫组化发展概况,免疫组化的优点,相关的免疫学理论,免疫组化应用范围,染色技术和注意事项,免疫组织、细胞化学的全过程包括：免疫组化发展概况免疫组化的优,16,由此可见，免疫细胞化学的基本理论是,抗原抗体,反应,，,标记化学反应,和,呈色化学反应,。由于免疫细胞,化学是在细胞和组织上进行抗原抗体反应，所以，必,须熟练掌握显微标本制备的全过程，要求待检标本形,态结构和抗原性保存良好，抗原不从原位扩散或丢失。,所以，从事免疫细胞化学的工作者必须了解以下有关,理论及掌握有关细胞和组织学技术。,免疫组化发展概况,免疫组化的优点,相关的免疫学理论,免疫组化应用范围,染色技术和注意事项,由此可见，免疫细胞化学的基本理论是抗原抗体免疫组化发展概,17,有关的免疫学理论,免疫组化发展概况,免疫组化的优点,相关的免疫学理论,免疫组化应用范围,染色技术和注意事项,有关的免疫学理论免疫组化发展概况免疫组化的优点相关的免疫学理,18,一、抗原、抗体的概念及抗原抗体的关系,抗原,(Antigen),凡能刺激机体产生抗体，并能与抗体发生特,异性结合的物质称为抗原。物质所具有的这种特,性称为抗原性,(Antigenicity),。,免疫组化发展概况,免疫组化的优点,相关的免疫学理论,免疫组化应用范围,染色技术和注意事项,一、抗原、抗体的概念及抗原抗体的关系免疫组化发展概况免疫组化,19,抗体,(Antibody),是机体受抗原刺激后，在体液中出现的一种,能与相应抗原发生反应的球蛋白，称免疫球蛋白,(Immunoglobulin, Ig),。含有免疫球蛋白的血清称,免疫血清。,免疫组化发展概况,免疫组化的优点,相关的免疫学理论,免疫组化应用范围,染色技术和注意事项,抗体(Antibody)免疫组化发展概况免疫组化的优,20,抗原与抗体的关系,抗原是引起机体产生免疫反应的主要外因，决,定免疫反应的特异性，机体与抗原物质的斗争过程,中为加速循环和排除抗原而产生的抗体、致敏淋巴,细胞等物质，是机体排除异体物质的保护性反应。,没有抗原的刺激，机体不能产生抗体；没有抗原物,质，也无法检测抗体的存在，利用抗体可以检测抗,原物质。,免疫组化发展概况,免疫组化的优点,相关的免疫学理论,免疫组化应用范围,染色技术和注意事项,抗原与抗体的关系免疫组化发展概况免疫组化的优点相关的,21,二、抗原的性质及种类,抗原的性质,1.,异种异体物质,机体能对进入体内的异种、异体的大分子物质,产生抗体，该物质与机体的种系关系愈远，其抗原,性就愈强，机体的免疫反应也更强。例如鸭血清白,蛋白对鸡的免疫原性较弱，而对家兔则能引起较强,的免疫反应。,二、抗原的性质及种类,22,同种异体物质也可具有抗原性，同种不,同个体之间，同一类型的细胞和组织，其抗,原性也有差异， 例如人的红细胞有,ABO,血,型抗原及,Rh,型抗原。人类白细胞和其它组,织的细胞膜上也具有组织相容性复合物的抗,原性物质,( Man Histocompatibility Complex,MHC),。,同种异体物质也可具有抗原性，同种不,23,自身抗原：,机体对本身所具有的物质不产生免疫反应。但在某,些条件下，使机体某种物质、 细胞或组织成分具有抗原,性时，也可导致机体产生免疫反应。 此具有抗原性的自,身物质称自身抗原,(Antoantigen),，所产生的抗体称为自,身抗体,(Antoantibody),。 如自身组织变性， 机体组织或,细胞在各种理化因素作用下， 引起化学组成的分子排列,和构型改变，形成新的抗原决定簇， 例如服用安替比林、,匹拉米洞等药所致白细胞减少， 就是由于所服用药物改,变了白细胞的一部分表面化学结构， 形成新的抗原决定,簇,激活免疫活性细胞产生白细胞抗体,(,自身抗体,),，导致,白细胞减少症。 在外伤、感染和炎症时，可能使隐蔽性,抗原如精子、 甲状腺球蛋白等释放，引起机体产生免疫,反应。,自身抗原：,24,并非异物都是抗原，例如砂尘和一些非生,物性高分子聚合物，仅能激发细胞吞噬反应而,不能使机体产生抗体或致敏淋巴细胞。,并非异物都是抗原，例如砂尘和一些非生,25,2.,大分子胶体,凡具有抗原性的物质，分子愈大，抗,原性愈强,(,如细菌、蛋白质,),。,2. 大分子胶体,26,3.,抗原的特异性,各种抗原物质的化学组成虽然很复杂，但能刺激,机体产生抗体并与抗体反应相结合的化学组成，仅仅,是抗原物质表面的一些具有活性的化学基因,化学结,构及空间构型，称为抗原物质决定簇,(,基,) ( Antigenic,determinant),。 各种抗原物质各有其特异的抗原决定,簇，但不同的抗原物质常含有共同的抗原成分，称为,类属抗原。在分类上相近的种类之间的同一类蛋白质,抗原，可表现出类属抗原的关系。多种物质结构的相,似性，决定这些物质抗原上的类属关系，而分子结构,的差异性，决定各种物质抗原的特异性。,3. 抗原的特异性,27,抗原的特异性是临床诊断、预防、治疗的基,础。各种特异诊断抗体的制备依靠特异性抗原物,质的获得；在不易获得特异性抗原的条件下，可,利用类属抗原代替。但在鉴别抗原时，应注意区,分类属抗原，以免误诊。,抗原的特异性是临床诊断、预防、治疗的基,28,凡暴露的抗原决定簇的数目多，间距大，免疫,原性也就较强。能与抗体分子结合的抗原决定簇的,总数，称为抗原的结合价。简单的半抗原一般只能,与一个抗体分子结合，是单价抗原。根据抗原分子,大小推算，有,100,个氨基酸的多肽，约有,1420,个,不重叠的抗原决定簇，即有,1020,个抗原结合价。,凡暴露的抗原决定簇的数目多，间距大，免疫,29,抗原的种类,1.,完全抗原,完全抗原是指能在机体内引起抗体形成,(,免疫,原性,),， 并可与其抗体特异性结合,(,反应原性,),的物,质。如细菌、蛋白质等。,2.,不完全抗原或称半抗原,(hapten),在体内单独存在时不引起抗体产生， 当其与,蛋白质或胶体颗粒结合后，则可引起抗体形成。,抗原的种类,30,三、抗体的性质和种类,抗体的一般性质,抗体是免疫球蛋白,(Immunoglobulin, Ig),。,人类免疫球蛋白有五类，即,IgG,、,IgA,、,IgM,、,IgD,和,IgE,。,三、抗体的性质和种类,31,抗原性和分类特征,免疫球蛋白都是大分子的物质，抗原性,较复杂。轻链和重链，可变区和稳定区，由,于分子结构的差异，各有不同的特异性抗原。,一般根据重链的抗原性分类，根据轻链的抗,原性分型。,抗原性和分类特征,32,抗体的种类,抗体种类很多，可分以下几种：,1.,根据获得抗体的不同分类, 免疫抗体,患传染病后或经人工注射疫苗后产生的,抗体；或是用已知抗原免疫动物产生抗体；,或是用单克隆抗体技术制备的抗体；近年还,可用基因工作制备抗体。,抗体的种类,33, 天然抗体,是指未患传染病也未注射疫苗而在体内,出现的抗体。, 自身抗体,是机体对自身组织成分产生的抗体。, 天然抗体,34,2.,根据抗原与抗体在试管内是否出现肉眼可见的反应,进行分类, 完全抗体,此抗体能与抗原结合，在一定条件下不出现可见,的抗原抗体反应。, 不完全抗体,此抗体能与抗原结合，在一定条件下出现可见的,抗原抗体反应。完全抗体具有完全的,Ig,分子结构，经,酶水解后的片段,Fab,或,F(ab),2,，可表现出不完全抗体,的作用。不完全抗体与抗原结合后，抗原表面便具有,抗体球蛋白的特性，如与抗球蛋白抗体作用后，则出,现可见的反应。,2. 根据抗原与抗体在试管内是否出现肉眼可见的反应,35,抗原与抗体的反应,抗原与抗体的反应统称为免疫学反应。在体内,进行的抗原抗体反应称为免疫反应，在体外进行的,抗原抗体反应称为血清学反应。由于抗原的物理性,状不同，参与反应的因素不同,(,有的有补体或吞噬,细胞参加,),，因此在抗体与抗原反应时， 可表现出,各种形式的反应。,抗原与抗体的反应,36,1.,抗原与抗体的结合是高度特异性的结合,抗原与抗体的结合是二者分子表面的物理化,学吸附现象，抗原抗体复合物在一定的条件下也,可以解离。,1. 抗原与抗体的结合是高度特异性的结合,37,2.,一个抗体分子有两个抗原结合点,(,称两价,),在一个抗原分子上则可有许多个结合点,(,称为,多价,),。 抗原与抗体分子的结合，不受两者数量比,例的限制，但如需要出现肉眼可见的反应，则抗原,与抗体的量需保持一定比例。在抗原或抗体过量的,条件下，不能聚合成大颗粒，因此不能出现肉眼可,见的反应。,2. 一个抗体分子有两个抗原结合点 (称两价),38,3.,主要的血清学反应有,3,个类型,即凝集反应、沉淀反应和有补体参,加的各种血清学反应。,3. 主要的血清学反应有3个类型,39,五、补体系统,补体系统,(Complement system),是存在于人和动物,正常血清中，具有酶活性的一组复杂的血清蛋白。由球,蛋白、碳水化合物、与磷脂结合而成，约占血清球蛋白,总量的,10%,，不耐热，加热,56,经,30min,即被灭活。补,体参与多种抗原抗体反应，导致细菌、红细胞等溶解。,但此作用不是特异性的，即能与任何抗原抗体的复合物,结合而发生反应。近年的研究表明补体不仅是机体自身,稳定和保护性反应的重要物质之一，而且还参与许多免,疫病理的损伤机制。,五、补体系统,40,补体系统由,9,个成分,11,种血清蛋白质组成，常以,符号“,C”,表示。根据其作用顺序分别命名为,C,1,、,C,2,、,C,3,、,C,4,、,C,5,、,C,6,、,C,7,、,C,8,和,C,9,。其中,C,1,又由,3,个亚,单位所组成，即,C1q,、,C1r,和,C1s,。,C,1,C,9,代表活,化的补体成分。 所有补体成分均为大分子蛋白质；,除,C,1,q,外，皆以不活动形式存在于血清中。,补体系统由9个成分11种血清蛋白质组成，常以,41,补体的各种成分由体内不同部位合成。,C,1,由胃,肠道上皮细胞合成，,C,2,与,C,4,由巨噬细胞合成，,C,3,主要在肝脏合成，,C,6,、,C,9,也可能在肝脏合成。,当因某种原因补体被激活时， 补体成分便按两,种激活途径,C,1,激活途径和,C,3,激活途径，按一定的顺,序呈现连锁的酶促反应， 参与机体的防御功能和维,持自稳状态； 亦可作为一种介质或效应物质参与机,体的免疫病理过程。,补体的各种成分由体内不同部位合成。C1由胃,42,免疫细胞化学的,分类和有关技术概述,免疫细胞化学的,43,一、分类,根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为,免疫,荧光细胞化学技术,，,免疫酶细胞化学技术，免疫铁蛋白,技术，免疫金,银细胞化学技术，亲和免疫细胞化学技,术，免疫电子显微镜技术,等。近些年来，核酸分子原位,杂交技术采用生物素、地高辛等非放射性物质标记探针，,和免疫细胞化学技术密切结合，发展为杂交免疫细胞化,学技术。不同的免疫细胞化学技术，各具有独特的试剂,和方法，但其,基本技术方法是相似的,，都包括抗体的制,备，组织材料的处理，免疫染色、对照试验、显微镜观,察等步骤。还有双重和多重标记技术也有重要的用途。,一、分类,44,二、抗体的制备和配制,抗体的制备,这是免疫细胞化学技术的首要试剂，必需制备,具有很高特异性和敏感性的高效价抗体。目前国内,外市场各种特异性抗体日益增多，许多实验室直接,应用市售产品，现在我国自制抗体种类少，发展抗,体生产十分必要。尤其要定位一种新的抗原物质，,能够自制较好。,二、抗体的制备和配制,45,抗体的配制,包括抗体的贮存液和抗体使用液的配制,方法。新制备或购进的是原液或冻干品，抗,血清为全血清，单克隆抗体是培养上清液或,腹水。,抗体的配制,46,1.,抗体贮存,获得新抗体后，应先根据生产厂家提供的,抗体效价，将其分装，可每,10ul,或,100ul/,支分,装入安瓿或,0.25ml,带盖塑料管中，密封。放入,-20-40,冰箱中保存备用,一般可保存,12,年。小量分装的抗体可,1,次用完， 避免反复冻,融而影响效价的降低。一般用前新鲜配制使用,液体，稀释的抗体不能长时间保存，在,4,可,存放,13,天，超过,7,天效价显著降低。,1. 抗体贮存,47,免疫组化课件,48,免疫组化课件,49,2.,抗体使用液的配制,这是任何免疫细胞化学方法中最重要的,一环，无论是一抗、二抗和各种标记抗体，,用前都必须按不同免疫染色方法和抗原性强,弱与抗原的多少，稀释使用各种抗体原液，,以便获得最佳免疫染色结果。,2. 抗体使用液的配制,50,抗体稀释的配制：,常用,0.01mol/L pH7.4 PBS,或,TBS,缓冲液,作抗体稀释液。可用以下方法配制专用的抗体,稀释液，防止抗体效价下降，减少抗体在组织,上的非特异性吸附：取,0.05mol/L pH7.4 TBS,100ml,，加温到,60,再加入优质明胶,100mg,，,搅拌溶解后，冷却至室温，加入,1g,牛血清蛋白，,加入,NaN3 200mg,溶解后，过滤，分装，,4,保存。,抗体稀释的配制：,51,抗体的最佳稀度由于各种抗体的效价不,同，组织中抗原强弱不一，应根据不同情况,作适当的调整，以取得中等阳性稀释度为佳，,因其既适合于抗原性强和含量多的标本，也,可用于抗原性弱的标本。,抗体的最佳稀度由于各种抗体的效价不,52,THANK YOU,SUCCESS,2024/8/26,53,可编辑,THANK YOUSUCCESS2023/9/253,三、组织材料的处理,组织材料的处理是获得良好免疫细胞化学,结果的前提，必需保证要检测的细胞或组织取,材新鲜，固定及时，形态保存完好，抗原物质,的抗原性不丢失、不扩散和被破坏。,三、组织材料的处理,54,四、免疫染色,可在细胞涂片或组织切片上进行免疫染,色。一般程序是：, 标记抗体与标本中抗原反应结合；, 用,PBS,洗去未结合的成分；, 直接观察结果,(,免疫荧光直接法,),；或,显色后再用显微镜观察,(,免疫酶直接法,),。在,此基础上发展出间接法，多层法，双标记法,等各种方法。,四、免疫染色,55,在免疫染色中应特别注意增强特异性染,色，减少或消除非特异性染色。在各种免疫,染色中都必须注意以下几个问题：,1.,增强特异性染色的方法, 蛋白酶消化法, 合适的抗体稀释度,在免疫染色中应特别注意增强特异性染,56, 温育时间,大部分抗体温育时间为,3060min,， 必要,时可,4,过夜,(,约,18h),。温育的温度常用,37,，,也可在室温中进行，对抗原抗体反应强的以室,温为佳。,37,可增强抗原抗体反应；适用于多,数抗体染色，但应注意在温箱中进行，防止切,片干燥而导致失败。, 温育时间,57, 多层染色法,对弱的抗原可用间接法,(,双层,),、,PAP,和,ABC,法（三层）、四或五层,PAP,法或,ABC,法，,或,PAP,的,ABC,联合染色法等，可以较大程度,的提高敏感性，获得良好结果。, 多层染色法,58, 显色增敏剂的应用,如在过氧化物酶底物中加入氯化镍，,可提高显色敏感度,4,倍。, 显色增敏剂的应用,59,2.,减少或消除非特异性染色的方法,组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异,性背景染色，最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶元,和结缔组织成分上。最有效方法是在用第一抗体前加制,备第二抗体动物之非免疫血清,(1:51:20),封闭组织上带,电荷基团而除去与第一抗体非特异性结合。必要时可加,入,2%5%,牛血清蛋白，可进一步减少非特异性染色。,作用时间为,1020min,。 也可用除制备第一抗体以外的,其它动物血清,(,非免疫的,),。有明显溶血的血清不能用，,以免产生非特异性染色。,2. 减少或消除非特异性染色的方法,60,免疫荧光染色时，可用,0.01%,伊文氏兰,(PBS,溶液,),稀释荧光抗体， 对消除背景的非特异性荧光,染色有很好的效果。当然使用特异性高、效价高的,第一抗体是最重要的条件。洗涤用的缓冲液中加入,0.85% 1% NaCl,成为高盐溶液，充分洗涤切片，,能有效的减少非特异性结合而减少背景染色。,免疫荧光染色时，可用 0.01% 伊文氏兰 (PBS,61,3.,显色反应的控制,免疫酶染色应注意控制：, 成色质浓度和温育时间可调节，增加成色质,的量和,/,或增加底物温育时间，可增加反应产物强度。,着色太深可减少温育反应时间。, 过氧化物酶显色时，,H,2,O,2,浓度大时将使显,色反应过快而致背景加深；过量,H,2,O,2,也可能抑制,酶的活性。,3. 显色反应的控制,62,4.,复染,根据所用的染色方法和呈显颜色等，可,选用适当的复染方法。如阳性结果呈红或棕,色，则用苏木素将细胞核染成兰色，以便定,位检测。也可用,1%2%,甲基绿复染。,4. 复染,63,五、对照,其目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，,排除非特异性疑问。主要是针对第一抗体对照，,常用的对照方法包括： 阳性对照； 阴性对,照； 阻断试验； 替代对照； 空白对照；, 自身对照； 吸收试验。,五、对照,64,阳性对照,用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行,免疫细胞化学染色，对照切片应呈阳性结果，称,为阳性对照。证明全过程均符合要求，尤其当待,检标本呈阴性结果时，阳性对照尤为重要。,阳性对照,65,阴性对照,用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈,阴性结果，称阴性对照，是阴性对照的一种。,其实空白、替代、吸收和抑制试验都属阴性对,照。当待检标本呈阳性结果时，阴性对照就更,加重要，用以排除假阳性。,阴性对照,66,六、免疫细胞化学结果的判断,对免疫细胞化学结果的判断应持科学的慎重,态度，要准确判断阳性和阴性，排除假阳性和假,阴性结果，必须严格对照实验，对新发现的阳性,结果，除有对照试验结果外，应进行多次重复实,验，要求用几种方法进行验证，如用,PAP,法阳性，,可再用,ABC,法验证。必须学会判断特异性染色,和非特异性染色，对初学者更为重要，否则会得,出不科学的结论。,六、免疫细胞化学结果的判断,67,特异性染色与非特异染色的鉴别点主要在于,特异性反应产物常分布于特定的部位，如胞浆内，,也有分布有细胞核和细胞表面的，即具有结构性。,特异性染色表现为在同一切片上呈现不同程度的,阳性染色结果。非特异性染色表现为无一定的分,布，常为某一部位成片的均匀着色。细胞和周围,的结缔组织均无区别的着色，或结缔组织呈现很,强的染色。,特异性染色与非特异染色的鉴别点主要在于,68,非特异性染色常出现在干燥切片的边缘，,有刀痕或组织折叠的部位。在过大的组织块，,中心固定不良也会导致非特异性染色。有时,可见非特异性染色和特异性染色同时存在，,由于过强的非特异性染色背景不但影响对特,异性染色结果的观察和记录，而且令人对其,特异性结果产生怀疑。,非特异性染色常出现在干燥切片的边缘，,69,阳性细胞的染色特征,免疫细胞化学的呈色深浅可反映抗原存在的数,量，可作为定性、定位和定量的依据。, 阳性细胞染色分布有三种类型, 胞浆； 细胞核； 细胞膜表面。 大部分,抗原见于细胞浆，可见于整个胞浆或部分胞浆。, 阳性细胞分布可分为灶性和弥漫性。,阳性细胞的染色特征,70,由于细胞内含抗原量不同， 所以染色强,度不一。如果细胞之间染色强度相同，常提示其,反应为非特异性。,阳性染色定位于细胞， 且与阴性细胞相,互交杂分布；而非特异性染色常不限于单个细胞，,而是累及一片细胞。,切片边缘、刀痕或皱折区域， 坏死或挤,压的细胞区，胶原结缔组织等，常表现为相同的,阳性染色强度，不能用于判断阳性。, 由于细胞内含抗原量不同， 所以染色强,71,染色失败的几种原因, 所染的全部切片均为阴性结果,包括阳性对照在内，全部呈阴性反应，原因可能是：, 染色未严格按操作步骤进行, 漏加一种抗体，或抗体失效, 缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性, 底物中所加,H,2,O,2,量少或失效, 复染或脱水剂使用不当,染色失败的几种原因,72,所有切片均呈弱阳性反应, 切片在染色过程中抗体过浓，或干燥了, 缓冲液配制中未加氯化钠和,pH,不准确，洗涤不彻底, 使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应时间过长, 抗体温育的时间过长,H,2,O,2,浓度过高，呈色速度过快, 粘附剂太厚, 所有切片均呈弱阳性反应,73,所有切片背景过深, 未用酶消化处理切片, 切片或涂片过厚,漂洗不够, 底物呈色反应过久, 蛋白质封闭不够或所用血清溶血, 使用全血清抗体稀释不够, 所有切片背景过深,74,阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反,应，固定和处理不当是最常见的原因。,对于阳性结果的定量判断常规办法是根据呈色深,浅和阳性细胞数量分类计数，以（,-,）、,+,、,+,、,+,等分级和计数统计。现在已采用图象分析计量，使免,疫细胞化学的定量成为可能的先进的形态定量方法。,另一种先进的免疫细胞化学计量分类技术,流式细,胞光度计技术。,阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反,75,用于免疫细胞化学的,有关细胞和组织学技术,用于免疫细胞化学的,76,一、细胞和组织,免疫组织化学技术是用标记物或显色物标记的抗,体检测细胞和组织内的抗原，从而达到诊断和研究疾,病的目的。抗原的准确显示和定位与制备的细胞和组,织标本质量的好坏有着密切的联系。由于各种抗原的,生化、物理性质不同，如温度高低、酸碱度强弱及各,种化学试剂的作用均可影响抗原的免疫学活性，良好,的细胞和组织学结构将有助于抗原的准确定位。因此，,细胞和组织标本的采集制备在免疫组织化学技术中占,有十分重要的位置。,一、细胞和组织,77,细胞标本的取材,目前，免疫组化技术已经应用于细胞学诊断，如,鉴别低分化癌与恶性淋巴瘤、黑色素瘤、低分化肉瘤,等。,CEA,应用于胸腹水中间皮瘤与癌的鉴别。,McAb,应用于淋巴白血病和恶性淋巴瘤的分类分型。近年来，,培养细胞的免疫组化技术在鉴定细胞的种类、分化程,度、表面抗原特点以及肿瘤结构成分改变等方面的研,究均起到了积极作用。,细胞标本的取材,78,细胞标本的取材有以下,3,种方法：,1.,印片法,2.,穿刺吸取涂片法,该法穿刺吸取直接涂片的优点是操作简便，细,胞形态保持较好。缺点是细胞分布不均匀。,3.,体液沉淀涂片法,主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多、,细胞少的标本。体液采取后，必须及时处理，更不,宜加固定液。,细胞标本的取材有以下3种方法：,79,如用细胞离心涂片器,(Cytospin),，可将标本,用上述离心沉淀法制成,210,5,个细胞,/ml,的细胞,悬液，吸取,50l,加入涂片器内，离心后即制成,分布均匀的细胞涂片，细胞分布在直径约,6mm,的小圆圈内，每个圆圈内的细胞数约,10,5,个。,如用细胞离心涂片器(Cytospin)，可将标本,80,培养细胞标本的取材可根据培养的细胞特性,分别采取不同的方法。某些细胞有贴壁生长的特,性，如纤维母细胞、粘液癌细胞等，只需将载玻,片或盖玻片插入培养液内即可收集到理想的细胞,标本。某些细胞只能在培养液中生长，可用上述,体液沉淀离心涂片法处理。,培养细胞标本的取材可根据培养的细胞特性,81,组织标本的取材,组织标本主要取之于活组织检查标本、手术切,除标本、动物模型标本以及尸体解剖标本等。前三,者均为新鲜组织，后者是机体死亡,2h,以上的组织，,可能有不同程度的自溶， 其抗原可能有变性消失，,严重弥散现象，因此， 尸检组织应尽快固定处理，,以免影响免疫组化标记效果。,组织标本的取材,82,组织标本的取材常常受到多种因素的影,响，如各种内窺镜钳取的组织，常因过度挤,压而变形，严重者组织结构被破坏。大组织,标本病变分布广泛，抗原在组织中分布不均,一，出现人为的组织取材不准确。,组织标本的取材常常受到多种因素的影,83,为了避免上述缺点，组织取材时应注意：, 活检钳的刃口必须锋利，以免组织受挤压, 取材部位必须是主要病变区, 必须取病灶与正常组织交界区, 必要时取远距病灶区的正常组织作对照,为了避免上述缺点，组织取材时应注意：,84,为充分保存组织的抗原性，标本离体后,应立即作处理，或立即速冻成冰块进行冰冻,切片，或立即用固定液处理，进行脱水、浸,蜡、包埋、石蜡切片。如不能迅速制片，可,贮存于液氮罐内或,-70,冰箱内备用。,为充分保存组织的抗原性，标本离体后,85,二、细胞和组织的固定,固定,为了更好的保持细胞和组织原有的形态,结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织,进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白,质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，,更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗,原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，,防止抗原弥散。,二、细胞和组织的固定,86,不同抗原，其稳定性也不相同，因而对,固定剂的耐受性差异较大。如,T,淋巴细胞表,面抗原属不稳定性抗原，对固定剂的耐受较,差，抗原活性容易丧失。 而,HBsAg,属稳定,性抗原，其抗原活性很少受固定剂种类、固,定时间、温度等因素的影响。,不同抗原，其稳定性也不相同，因而对,87,固定剂,用于免疫组织化学的固定剂种类较多，,性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其,重视固定剂的选择，介绍如下。,固定剂,88,1.,醛类固定剂,双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于,原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对,IgM,、,IgA,、,J,链和,链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。,10%,钙,-,福尔马林液,(,浓甲醛,10ml,，饱和碳酸钙,90ml),。,10%,中性缓冲福尔马林液,(,浓甲醛,10ml, 0.01mol/L pH7.4,PBS 90ml,）。,4%,多聚甲醛磷酸缓冲液,pH7.4 (,多聚甲醛,40g, 0.1mol/L,PBS,液,pH7.4 500ml,，两者混合加热至,60,，搅拌并摘加,1N,NaOH,至清晰为止，冷却后加,PBS,液至总量,1000ml),。,戊二醛,-,甲醛液,(,戊二醛,10ml,，蒸馏水加至,100ml),。,1. 醛类固定剂,89,2.,非醛类固定剂,Pe,等人比较几种非醛类双功能试剂指出，碳,化二亚胺、二甲基乙酰胺、二甲基辛酰亚胺和对,苯醌等均适用于多肽类激素的组织固定，单独使,用时，边缘固定效应重，但与戊二醛或多聚甲醛,混合使用，效果明显改善。,2. 非醛类固定剂,90, 碳化二亚胺液,1-ethyl-3 (3-dimethyl-,aminopropyl) carbodiimide-HCL,：,2g,溶于,100ml 0.01mol/L,pH7.4 PBS,中。,此液宜用于标记多肽类激素的组织，对标记,IgA,、,IgG,效果不佳。, 碳化二亚胺液 1-ethyl-3 (3-dimet,91, 碳二亚酰胺,-,戊二醛液,(ECD-G,液,),ECD-1-ethyl-3 (3-dimethyl-aminopropyl) -,Carbodiimide hydrochloride,，即乙基,-,二甲基氨,基丙基碳亚胺盐酸盐，简称乙基,-CDI,。,该液常用于多肽类激素的固定，对酶等蛋白,质固定效果良好，对细胞内抗原定位，超微结构,保存好，是一种培养细胞电镜免疫细胞化学研究,的良好固定剂。, 碳二亚酰胺-戊二醛液(ECD-G液),92,Zenkers,液,重铬酸钾,2.5g,氯化汞,5g,，硫酸钠,1g,，蒸馏,水,100ml,，混合溶解后，临用时加冰醋酸,5ml,。,该固定液对免疫球蛋白染色最佳、固定时间,约,24h,，染色前必须脱汞色素。, Zenkers液,93,3.,丙酮及醇类固定剂,丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻,切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时,4,低温保存备用，临用时，只需将涂片或冰冻切,片插入冷丙酮内,510min,，取出后自然干燥，贮存,于低温冰箱备用。,3. 丙酮及醇类固定剂,94,固定组织时应注意：, 应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。, 组织块不宜过大过厚,必须小于,2cm1.5cm0.3cm,，,尤其是组织块厚度必须控制在,0.3cm,以内。, 固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织,20,倍,以上，否则组织中心固定不良影响效果。, 组织固定后应充分水洗，去除固定液，以减少固定液,造成的人为假象。,固定组织时应注意：,95,固定方法,1.,浸入法,(Immersion method),将组织浸泡在固定液内， 必要时可在,低温,(4),环境下进行，固定时间可根据抗,原的稳定性以及固定液性质而定， 一般在,212h,之间。,固定方法,96,2.,灌注法,(Irrigation method),此法适用于动物实验研究。,灌注法固定可使固定液迅速达到全身,各组织，达到充分固定之目的。灌注中洗,还能排除红细胞内假过氧化物酶的干扰。,2. 灌注法(Irrigation method),97,三、组织切片技术,应用于光镜的免疫组织化学染色的切片,厚度一般要求,5m,左右，神经组织的研究要,求切片厚度在,20100m,，有利于追踪神经,纤维的走行。,三、组织切片技术,98,1.,冰冻切片,是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方,法。其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗,原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰,冻切片。新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻,切片。,冰冻切片后如不染色，必须吹干，贮存低温,冰箱内，或进行短暂预固定后贮存冰箱保存。,1. 冰冻切片,99,2.,石蜡切片,其优点是组织结构保存良好，在病理和,回顾性研究中有较大的实用价值，能切连续,薄片，组织结构清晰，抗原定位准确。,2. 石蜡切片,100,3.,振动切片,用振动切片机,(vibratotme),，可以把新鲜组织,(,不,固定不冰冻,),切成厚片,20-100m,，以漂浮法在反应板,进行免疫组织化学染色，然后在解剖显微镜下检出免,疫反应阳性部位，修整组织进行后固定，最后按电镜,样品制备、脱水、包埋、超薄切片、染色观察等。组,织不冰冻，无冰晶形成和组织抗原破坏，在免疫组化,染色前避免了组织脱水、透明、包埋等步骤对抗原的,损害，能较好地保留组织内脂溶性物质和细胞膜抗原，,主要用于显示神经系统抗原分布研究。这种包埋前染,色，尤其适用于免疫电镜观察。,3. 振动切片,101,4.,塑料切片,塑料包埋切片常用的埋剂有甲基丙烯酸盐类,(Glycol,methacrylate,GMA),及环氧树脂类,(Epon 812,618),，其,优点是可以同时作光镜和电镜检测，能相互对照所查抗,原，定位准确。塑料包埋切片可切出比石蜡切片更薄的,切片,光镜切片可薄至,0.5-2m,故称半薄切片,(Semithin,section),。,GMA,保存抗原较好，不与组织产生共聚合，,但形态学结构欠佳。,4. 塑料切片,102,环氧树脂如,Epon,和,Araldite,能较好地保存形态学,结构，但在聚合过程中易和组织起作用，改变抗原结,构。塑料包埋切片由于处理程序繁多，抗原活性易丢,失。同时，半薄切片进行免疫染色时，抗血清不易穿,透树脂，因此，塑料切片主要用于免疫电镜的超微切,片前定位。包埋前染色的标本，切半薄切片后不需染,色，直接在相差显微镜下观察免疫反应部位呈黑点状，,定位后进一步作超薄切片，这样，可以明显提高免疫,电镜阳性检出率。,环氧树脂如Epon和Araldite 能较好地保存形态学,103,5.,超薄切片,电镜标本制作，应用超薄切片机,(Ultrotome),进行切片。,5. 超薄切片,104,经常,不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有,力量,Study Constantly, And You Will Know Everything. The More You Know, The More Powerful You Will,Be,写,在最后,经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量写,105,感谢聆听,不足之处请大家批评指导,Please Criticize And Guide The,Shortcomings,结束语,讲师,：,XXXXXX,XX,年,XX,月,XX,日,感谢聆听结束语讲师：XXXXXX,106,