基因治疗概论ppt课件

,单击此处编辑母版标题样式,基因治疗概论,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第六章,基因治疗概论,1,基因治疗概论,1基因治疗概论,随着近代医学的发展,分子生物学的研究和应用已经逐渐进入临床领域,.,基因治疗是,90,年代出现的一种新的治疗技术,为现代治疗学开辟了一条新途径,.,自,1990,年对一位腺苷脱胺酶缺乏,(Adensine deaminase deficiency),引起严重免疫功能低下的患者,应用基因治疗获得成功以后,又有,3,种疾病取得良好的结果,:,家族性高胆固醇血症,(Familial hypercholesterolemia),和高雪氏病,(Gaucher disease),及囊性纤维化,(Cystic fibrosis).,目前认为,基因治疗是治疗基因突变性疾病的一项根本措施,同时它也是为非基因突变性疾病提供了一个新的治疗手段,.,一基因治疗的意义,从广义而言,基因治疗是应用基因或基因产物,治疗疾病的一种方法,.,从狭义而言,基因治疗是将外界的正常基因或治疗基因,通过载体转移到人体的靶细胞,进行基因修饰和表达,改善疾病的一种治疗手段,.,2,基因治疗概论,随着近代医学的发展,分子生物学的研究和应用已经逐渐,癌基因,癌基因是指细胞中发生变异的一类基因，这些基因在细胞中行使,正常的生物学功能，是机体生长和发育不可缺少的。这些基因所编码,的蛋白质都存在与细胞的各个部分中。研究表明，肿瘤是多种基因突,变累积的结果，基因突变主要发生在：癌基因、抑癌基因和,DNA,修复,基因。,其中绝大多数肿瘤的基因变异都是体细胞突变，包括点突变、扩增、,重排、缺失或甲基化状态的改变，在肿瘤的发生、发展过程中起促进,作用。,1982,年人类从,Harvey,和,Kirsten,肉瘤病毒中分离到第一个癌基因,Ras,。,随后证明,Ras,蛋白是一个,G,蛋白，具有,GTP,酶活性，参与细胞的信号,传导。在人类一些肿瘤中点突变导致,Ras,蛋白,GTP,酶活性下降。同年，,在,Burkitts,淋巴瘤中发现,Myc,基因。进一步研究表明突变的,Ras,基因和,Myc,基因联合转染细胞可诱导细胞发生恶性转化。,3,基因治疗概论,癌基因3基因治疗概论,人类又发现另一类基因可抑制肿瘤细胞的恶性增殖即抑癌基因。,1987,年,Dryja,克隆到第一个抑癌基因,Rb,，该基因编码一种未知功,能的蛋白，该蛋白失活则导致肿瘤发生。,1989,年人类发现抑癌,基因,P53,。肿瘤的基本特征是细胞的失控性生长，包括细胞的死,亡（调王）的减少或增殖的增加，即细胞的区分化等多个细胞,生命活动。众多的癌基因和抑癌基因改变与上述细胞的生命活,动异常最终都汇集到细胞周期的调控上来。因此肿瘤又被认为,是细胞周期异常性疾病。,20,世纪,90,年代，人们发现了许多与疾,病相关的基因，细胞周期调控因子，凋亡相关基因，血管生长,因子和受体，端粒酶等都是具有重要生物学功能的基因，它们,都参与细胞的增殖与分化的调控及维持正常生命活动，并进一,步明确这些基因的异常改变与肿瘤的发生发展密切相关。肿瘤,的研究已进入基因组学和蛋白组学时代，即分离和鉴定癌细胞,中的所有表达的蛋白质和特异性的标志蛋白。,4,基因治疗概论,人类又发现另一类基因可抑制肿瘤细胞的恶性增殖即抑癌基因。4基,癌基因的分類,根据基因产物资细胞内的定位和生物学功能,可将其分为：,生长因子（,Hst,，扩增,-,胃癌）,生长因子受体（,Neu-EerbB2,，扩增,乳腺癌、卵巢癌等）,信号传导分子（,K-Ras,，点突变,-,胰腺癌、肺癌、结肠癌）,转录因子（,Myc,，易位、扩增,-,淋巴瘤等）,细胞凋亡基因（,Bcl-2,，染色体易位,-B,细胞淋巴瘤）,细胞周期蛋白（,CYCD1,，扩增、易位,-,乳腺癌、淋巴瘤等）,等几大类。,这些原癌基因是细胞中的固有基因，正常情况下参与细胞,增殖与分化的调控，只有当基因的结构和功能发生变异并,具有使细胞发生恶性转化的作用，此时的基因称为癌基因。,癌基因蛋白组成细胞内庞大的信号网络，控制细胞的生长、,分化、凋亡、,DNA,损伤修复、基因转录、表达调控等。,5,基因治疗概论,癌基因的分類 5基因治疗概论,基因变异方式与原癌基因活化 细胞中活化的原癌基因,被称为癌基因。进一步明确原癌基因在物理、化学即生物的,致癌因素作用下发生改变。原癌基因活化的方式为：点突变、,染色体易位或基因扩增等。实验结果表明，基因变异与肿瘤,的某些生物学特性相关，有待进一步研究。,（,1,）点突变与癌基因 点突变是导致癌基因活化的主要方式。,人们针对基因的点突变在多聚酶链式反应（,PCR,）等技术对,Ras,、,Met,、,p53,、,Men,等多种癌基因和抑癌基因进行了大量,病例分析，明确了这些基因的点突变是基因变异的重要方式,并与细胞的癌变有关。但是，基因点突变与基因功能改变的,关系等有待进一步研究。,6,基因治疗概论,基因变异方式与原癌基因活化 细胞中活化的原癌,(,2) DNA,扩增与癌基因 基因扩增是癌基因活化的另,一个主要形式,细胞内一些基因通过不明原因复制成,多拷贝,这些多拷贝的,DNA,以游离形式存在称双微体,(DMS),获再次整合入人染色体形成均染区,(HSR),它表,示高度的染色体结构破坏与不稳定性。基因扩增和,过量表达其结果均可影响细胞的正常生理功能。双,微体,(DMS),和均染区,(HSR),包含数十万碱基对，扩增,量由二十至数百倍，,DNA,扩增区内一个或多个靶基,因拷贝数和基因表达量因此而增加，这种肿瘤细胞,受生物选择的影响而将扩增的,DNA,序列维持下来。,因此一些肿瘤细胞,DNA,的扩增区内可能含有数个,细胞癌基因。,7,基因治疗概论,(2) DNA扩增与癌基因 基因扩增是癌基因活化的另7基因,（,3,）染色体重排与癌基因 研究表明，在各种肿瘤都有染色体结构异常，,这种多种肿瘤或细胞系都有的特定染色体改变称为表标志染色体。如淋,巴瘤中染色体第,8,号和第,14,号易位、慢性粒细胞白血病中染色体第,9,号和,第,22,号易位等。近,10,年来，通过实体瘤中特殊染色体异常提供的线索已,鉴定出一些新基因，今后会有更多新基因被识别出来。,（,4,）癌基因甲基化改变,DNA,甲基化状态的改变可导致基因结构和功能,的异常，是细胞癌变过程中重要的一步。,DNA,甲基化具有重要的生物学,意义，它的作用表现在控制基因表达，维护染色体的完整性，调节,DNA,重组的某些环节，可能在低于外来入侵的寄生,DNA,中起重要作用。近来,研究发现，正常的,DNA,甲基化模式如果被破坏，例如基因启动子区域过,渡甲基化或过低甲基化都会导致细胞发生癌变。已发现，大量的肿瘤细,胞中抑癌基因的失活是该基因的启动子区域的过渡甲基化有关。癌基因,DNA,甲基化水平越低，其表达水平愈高，肿瘤的生物学行为愈复杂。,认为，进行,DNA,甲基化状态的分析有可能成为判断肿瘤生物学行为特性,及临床预后的重要指标之一。,8,基因治疗概论,（3）染色体重排与癌基因 研究表明，在各种肿瘤都有染色体结构,（,5,） 基因过量表达与癌基因的关系 人类拥有的,3,5,万个,基因中约有,15%,左右的基因可以进行表达，这类基因具有,一定的组织、细胞特异性。这些基因均参与细胞增殖与分,化的过程，控制细胞正常的生理功能。基因表达水平的改,变是细胞癌变的早期事件，通过对,Ras,、,ErbB2,、,Met,几种,癌基因在胃粘膜病变过程中表达水平的分析，确定这三种,基因表达水平的改变与胃粘膜病变演化有密切关系。,Ras,基因突变、过量表达，被认为是肿瘤发生的重要原因,之一。研究结果提示，基因表达水平的改变是细胞癌变的,重要因素，无论是从基因的量变还是质变，这一过程是受,体内和体外诸多因素的调节，由此可见细胞增殖与分化平,衡的调节和维持是通过对这样一类癌基因的表达来实现的。,9,基因治疗概论,（5） 基因过量表达与癌基因的关系 人类拥有的35万个9基,癌基因与人类肿瘤,目前已鉴定出许多与肿瘤细胞相关的癌基因，进一步研究癌基因,在肿瘤中的作用。,（,1,）,Ras,基因变异与肿瘤 研究表明，约,10%,15%,的肿瘤至少,有三种,Ras,，因中一种的点突变，其中,K-Ras,基因更易称为突变,的基因。,K-Ras,基因点突变集中在第,12,位氨基酸残基，少数病,理中也有第,13,位及第,61,位点突变。约,50%,结肠癌、,70%,90%,胰,腺癌、,30%,的肺癌均有,Ras,点突变。在正常细胞中，每一种,Ras,基,因都分别编码一种鸟苷酸结合蛋白。,Ras,蛋白在细胞增殖分化信,号从激活的跨膜受体传递到下游蛋白激酶的过程中起作用。其结,果导致,Ras,蛋白与,GTP,（三磷酸鸟苷）的持续结合具有促进细胞,增殖作用。研究表明，采用针对,Ras,基因的变异将,Ras,基因的功能,失活，可抑制肿瘤的恶性生长，进一步证明纠正突变型,Ras,引起,的信号传导通路的异常可能是一条控制肿瘤细胞恶性化增殖的,有效途径。,10,基因治疗概论,癌基因与人类肿瘤10基因治疗概论,（,2,）,Myc,基因变异与肿瘤,Myc,基因是一种癌基因。通过染色体,易位而活化，通常通过第,8,号染色体与第,14,号染色体间易位，破,坏,Myc,基因的调控，在某些肿瘤细胞中,Myc,基因还受,DNA,扩增的,影响。,Myc,基因在细胞生长调控中具有重要作用，一旦发生突变，,导致细胞恶性增殖。,此外：,Nen,基因变异与卵巢癌、乳腺癌及胃癌等，,c-Met,基因变异,与胃粘膜病变，,Bcl-2,基因与细胞凋亡等都是研究热点。,（,3,）端粒酶 端粒是真核细胞线形染色体末端由段粒,DNA,和端粒,蛋白质构成的一种特殊结构。人的端粒,DNA,序列由,5,向,3,方向的,（,TTAGGG,）,n,重复串联组成。正常情况下，随着细胞分裂，端粒,的进行性缩短并诱发一系列分子事件，最终导致细胞凋亡。端粒,酶是一种能延长端粒末端的核糖蛋白酶，以自身,RNA,为模板合成,端粒,DNA,并整合到染色体末端，使染色体延长，从而延长细胞的,寿命甚至是细胞永生化。绝大多数正常体细胞端粒酶为阴性，普,遍认为端粒酶的激活与恶性肿瘤的发生与发展密切相关。端粒酶,的活化涉及一系列基因的表达和调控的变化，从而导致细胞增殖,分化的异常。,11,基因治疗概论,（2）Myc基因变异与肿瘤 Myc基因是一种癌基因。通过染,癌基因与肿瘤的预防诊断和治疗,（,1,）环境致病因素抑癌基因变异的积累 目前认为，任何一,种肿瘤都与一种致病微生物相关，并往往伴某一类型的慢性,炎症。去除致病因素，阻断细胞癌变是预防肿瘤发生的关键。,如早期发现,RNA,病毒通过影响宿主细胞的基因而与肿瘤发生,相关，煤焦油中的化学物质作用于,DNA,引起细胞癌变及诱发,肿瘤。这些被确定为细胞癌变的重要因素。同时多种肿瘤具,有家族聚集现象，因此遗传易感性是另一个致癌因素。在这,些因素作用下，癌基因发生突变等导致肿瘤发生。说明肿瘤,的发生发展是全身代谢障碍性导致的疾病。肿瘤的发生与发,展是多基因以多种形式变异积累的病变过程，任何一个单基,因都不能从基因水平阐明肿瘤发病的分子机制。,12,基因治疗概论,癌基因与肿瘤的预防诊断和治疗12基因治疗概论,（,2,）细胞癌变的分子模型与肿瘤相关基因的鉴定,以胃癌研究为例：胃粘膜慢性病变不同阶段中某些肿瘤相,关基因变异方式、频率给与病变演化关系。根据对处在不,同阶段的胃粘膜组织的分析（正常胃粘膜、浅表性胃炎、,慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生、异型增生、胃癌），初步,确定在胃癌中检出高频率的基因变异，包括癌基因的扩增、,重排、点突变、过量表达。抑癌基因缺失、点突变、过量,表达和基因甲基化改变，此外，在胃粘膜病变异型性增生,和肠上皮化生中也检测到,p53,和,Ras,基因的点突变及基因,Met,、,ErbB2,、,Akt2,过量表达。研究表明，基因过量表达多发生,在细胞癌变的起始阶段，基因点突变可能是细胞癌变启动,阶段的一个主要事件，这一阶段的可逆性较大；基因扩增、,重排多发生在癌变的促进阶段，癌变细胞可能开始向不同,的生物学行为分化，可能表现出多样性和异质性；基因缺,失不仅能导致癌变细胞生物学行为的多样化并导致癌变细,胞增值分化平衡失调，促使肿瘤迅速发展。,13,基因治疗概论,（2）细胞癌变的分子模型与肿瘤相关基因的鉴定13基因治疗概,癌基因与肿瘤生物学的关键科学问题,随着基因组、蛋白组学研究的进展和生物芯片技术的发展，,以下几个科学为题有助于进一步阐明癌基因与肿瘤的关系：,（,1,）基因与不同肿瘤细胞的信号传导；,（,2,）癌基因变异与肿瘤的易感性；,(3,）癌基因与不同个体肿瘤的生物学特性；,（,4,）癌基因与机体内外环境平衡调控的分子机制；,（,5,）癌基因表达时空性与细胞的更新换代；,（,6,）癌基因与肿瘤的临床病理学基因分型。,14,基因治疗概论,癌基因与肿瘤生物学的关键科学问题1,抑癌基因,在肿瘤发生中，有一种通过纯合缺失或失活而引以恶化的基因，被称,之为抑癌基因，这类基因在控制细胞生长、增殖及分化过程中起着十,分重要的负调节作用，并能潜在的抑制肿瘤生长，如果其功能失活或,出现基因缺失、突变等异常，可导致 细胞恶性转化而发生肿瘤。抑,癌基因的生物学功能与癌基因相反，他们是机体细胞在增殖、分化、,凋亡等生命过程中正和负两类调控信号，癌基因的调控属正信号，而,抑癌基因的调控属负信号范围。确定一种抑癌基因需要在理论上符合,三个条件：,（,1,）该恶性肿瘤的相应正常组织中该基因必须正常表达；,（,2,）该恶性肿瘤中这种基因应有功能失活、结构改变、表达缺陷；,（,3,）将这种基因的野生型导入基因异常的肿瘤细胞内，可部分或全,部改变其恶性表型。目前研究，还未发现任何一种抑癌基因的异常存,在与人类全部肿瘤中，均表现为不同频率的异常。,15,基因治疗概论,抑癌基因 15基因治疗概论,抑癌基因大多属于一类对细胞增殖产生负调控作用的基因及其产物，,其促癌作用一般是在两个等位基因都丢失或失活后才显示出来，,故发现和分离都比较困难。目前已被克隆的抑癌基因和未被可隆,的候选抑癌基因已达,30,余种，而且新的抑癌基因还在不断出现。,例如：,基因名称 染色体定位 基因产物定位 常见主要肿瘤,P53 17P13,细胞核 多种肿瘤,P16 9q21,细胞核 多种肿瘤,P19 19p13,。,2,细胞核 多种肿瘤,Rb 13q14,细胞核 视网膜母细胞瘤,APC 5q21,细胞膜 结肠癌,FHIT 3p14,。,2,细胞质 消化道肿瘤、肾癌、肺癌等,等等。,16,基因治疗概论,抑癌基因大多属于一类对细胞增殖产生负调控作用的基因及其产物，,以,p53,基因为例：,p53,基因是基因研究最为深入的肿瘤基因之一。人类肿瘤中约,50%,以上与,p53,基因变化有关，仅,1991,2002,年,1,月的相关文献超过,9800,余篇，,p53,基因也被,Science,杂志评为,1993,年的明星分之子。,P53,基因的结构和生物学特性,P53,基因全长约,20kb,，定位在人类染色体,17p13.1,，由,11,个外显子组,成，编码,393,个氨基酸组成的,53kb,的核内磷酸化蛋白，具有蛋白,质,-DNA,和蛋白质,-,蛋白质结合的功能。现已明确,p53,是细胞生长周,期中负调节因子，与细胞周期的调控、,DNA,修复、细胞分化、细,胞凋亡等重要的生物学功能有关。,P53,可正调节一些在细胞增殖周,期调控过程中起关键作用的基因，包括可调,CDK,活性的,p21,和,DNA,损伤导致的细胞生长受阻相关的,GADD45,基因。,P53,突变可影响与,DNA,相互作用的关键氨基酸，也可由于,p53,基因突变蛋白发生错误,重叠而不能与特定的,DNA,识别序列相互结合。,P53,在细胞内的核心,作用是介导,DNA,顺伤后的细胞应激反应，维持遗传稳定性。对细,胞周期的调节主要是在,G1/S,控制点起作用，以决定细胞是否启动,DNA,合成，而在另一些情况下，却决定细胞是否进行程序化死亡。,P53,的失活可使肿瘤细胞进一步出现基因组的不稳定性，突变型,p53,则具有癌基因的作用，促进细胞恶性化。,17,基因治疗概论,以p53 基因为例：17基因治疗概论,1,P53,基因异常与肿瘤,P53,基因的缺失或突变已被证实是许多肿瘤发生的原因之一。,自,1989,年以来，人们发现在多种不同类型的肿瘤中发现了,p53,基因的突变，其频率可达,50%,60%,，其突变的形式可,表现为点突变、缺失突变、插入突变、移码突变、基因重,排等。目前已知的突变位点约有,3500,余种，大多数集中于,第,5,8,外显子。,P53,基因异常的另一个形势为等位基因的缺,失，特别是当一个等位基因发生突变时，另一个等位基因,便存在缺失的倾向，这种两个等位基因都缺失的现象在结,肠癌、乳腺癌发生频率较高。另外，,p53,基因甲基化状态的,变化也是较为常见的基因异常。,18,基因治疗概论,1 P53基因异常与肿瘤18基因治疗概论,1,P53,基因产物的研究进展,P53,蛋白具有与双链或单链,DNA,结合的能力，同时还具,有与,DNA,病毒编码产物结合的能力。,P53,基因突变和等,位基因缺失是导致,p53,蛋白表达异常的主要原因，由于,突变型,p53,蛋白的半衰期可延长至,6,12,小时，所以用抗,p53,蛋白的抗体通过免疫组化法检测肿瘤组织，过表达,常提示,p53,基因存在错义突变，应用这一方法可为一些,肿瘤如乳腺癌提供临床预后的指标。然而新近的研究表,明,，除突变性,p53,蛋白可以增加在细胞内积聚外，如果,以某种结合的方式存在，特别是与肿瘤性,DNA,病毒编码,产物结合，也可使细胞内,p53,蛋白集聚，含量增加，导致,其正常的负调节功能丧失。,19,基因治疗概论,1 P53基因产物的研究进展19基因治疗概论,1,P53,基因对细胞内基因转录的调节,P53,除可以与某些病毒癌蛋白结合外，还可以与细胞内的,转录因子结合，起到活化和调节作用，目前已发现,p53,激,活转录的基因有,107,种，抑制转录活性的基因有,54,种，其,中关系较为密切且进行较深入研究的相关基因有十几种。,激活转录：,Bax,、,Fas/Apol,、,CyclinG,、,GADD45,、,GD-AIF,、,HIC1,、,MCK,等。,抑制转录活型：,P21WAF1/CIP1,、,BcL2,、,C-myc,、,FGF,、,C-fos,、,HSP70,等。,P53,蛋白在调节细胞周期和基因稳定性方面的研究也有很,大进展。在细胞周期中，当,DNA,受到损伤后，便停止,DNA,的修复，使细胞停留在,G1,期，如损伤的,DNA,被修复，则可,进入,S,期，如果损伤严重而不能修复，则会出现程序性死亡,。野生型,p53,基因对控制细胞周期、维持细胞遗传稳定性具,有重要作用，认为可能是通过,GADD45,及,Mdm2,行使调节作用。,20,基因治疗概论,1 P53基因对细胞内基因转录的调节20基因治疗概论,INK4,基因家族,INK4,（,inhibitors of CDK4,）基因家族包括了,p16,、,p15,、,p18,及,p19,基因等。在细胞周期调控中具有十分重要的意义，这,类蛋白具有周期依赖性表达模式，特异性抑制,CDK,的激酶活,性，并参与某些组织细胞的分化、增殖的调节。,例：,p16,基因异常与肿瘤,p16,基因异常的主要表现特点以基因,缺失为主，且多为纯和性缺失，在肿瘤细胞系中可达,80%,以上，,在实体瘤中可达,70%,左右，而点突变发生率较低；不同肿瘤的,突变频率不同，同一肿瘤的不同分化程度其缺失和突变率也不,同，细胞株的基因异常高于实体瘤，基因异常总发生率高于其,他已知的抑癌基因。,P16,基因异常分布的瘤谱范围广，包括了人,类肿瘤的大部分类型，也包括散发性和具有遗传倾向的肿瘤。,在高级别的胶质瘤中，,P16,基因缺失达,71%,，而在二级胶质瘤中,为发现有丢失，在胶质瘤细胞株中可达,82%,，在实体瘤中平均,丢失率可达,55%,。,越来越多的证据表明,P16,作为一种新的抑癌基因。,21,基因治疗概论,INK4基因家族21基因治疗概论,六 肿瘤转移抑制基因,肿瘤转移机制的研究是肿瘤分子生物学研究的热点之一，与肿瘤,发生一样，肿瘤转移不仅有促转移基因的激活，也伴有转移抑制,基因的失活，肿瘤异质性理论为肿瘤转移抑制基因和相关基因的,发现提供了理论基础，并在细胞融合实验中得到证实。目前已发,现并研究较多的肿瘤转移抑制基因主要有,nm-23,、,KAI1,等。,nm-23,基因定位与人类染色体,17q22,，编码区为,533bp,，产物为,152,个氨基酸组成的,17kd,核内及胞浆蛋白，与二磷酸核苷激酶（,NDPK,）,的氨基酸序列具有高度同源型。,nm-23,基因在肿瘤的研究主要是其,与肿瘤转移的关系，在乳腺癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌等许多,肿瘤研究中有报道。,nm-23,表达水平与肺癌转移呈负相关，,mRNA,水平在低转移癌细胞中比高水平转移癌细胞高,10,倍以上。,nm-23,与,肿瘤转移的关系除了与表达水平有关外，另一异常变化是等位基因,缺失或突变，在,64%,乳腺癌、,42%,肺癌、,20%,肾癌均存在等位基因,杂合性缺失。有关,nm-23,基因两种类型,H1,和,H2,在肿瘤转移中的作用，,较多的结果倾向于,nm-23H1,在抑制肿瘤转移中其主要作用。,22,基因治疗概论,六 肿瘤转移抑制基因22基因治疗概论,七 存在的问题及发展方向,Vogelstein,在对,p53,基因的研究中形象的将抑癌基因在细胞分化、,增殖过程中的作用比喻为汽车的刹车，刹车控制着汽车的行使,或停止，而抑癌基因通过对细胞周期、细胞凋亡的控制，使细,胞分裂、增殖处于一种平衡状态，抑癌基因一旦出现异常，这,一正常的调控功能丧失，细胞则会出现恶性转化。,人们在研究中逐步认识到，既有癌基因的作用，也有抑癌基因,的作用，在肿瘤的不同阶段和时期，有着不同基因的参与，是,肿瘤发生多步骤、多基因参与的生物学过程得到更为合理的解,释，各种相关肿瘤发生的分子模型也相继出现，如结肠癌、胃,癌、乳腺癌、肝癌等肿瘤发生的分子模型。,目前新的候选抑癌基因仍在不断出现，除对这些新基因进行克,隆、鉴定和功能研究外，对抑癌基因的生物学功能、抑癌作用,机制、与肿瘤易感性的关系、肿瘤细胞诱导分化和凋亡、信号,传导、基因调节网络以及肿瘤的基因治疗等方面都是极受关注,的研究领域。,23,基因治疗概论,七 存在的问题及发展方向23基因治疗概论,在对病人实施基因治疗之前,必须完成下列几项工作,:,1.,疾病的确认,2.,基因检测与克隆,3.,基因突变的鉴定,4.,基因突变与疾病病理表现的关系,5.,基因转移到靶细胞,6.,检测基因在靶细胞中的表达,及其蛋白质功能的测定,7.,基因转移有效性和安全性的检测系统,目前临床试用的几种基因治疗遗传性疾病,:,1.-,抗胰蛋白酶缺乏症,2.,慢性肉芽肿,3.,家族性高胆固醇血症,4.,范可尼氏综合症,5.,高雪氏病,6.,腺苷脱胺酶缺乏引起的免疫缺乏症,目前临床试用的几种基因治疗后天性疾病,:,1.,爱滋病,2.,周围动脉血管疾病,3.,类风湿性关节炎,4.,肿瘤,24,基因治疗概论,在对病人实施基因治疗之前,必须完成下列几项工作:24基因治,二,.,基因疾病的诊断方法,(,一,).,临床诊断 主要通过病史、查体和遗传家谱的分析,得出初步诊断,.,(,二,).,生化检查 蛋白质分析和酶学测定,(,三,).,分子生物学检查,1.,聚合酶链反应,(polymerase chain reaction,PCR),提取病人,DNA,后,经高温变性处理,使双链,DNA,分成二条单链,DNA,在特异性引物和,DNA,聚合酶作用下,以单链,DNA,为模板进行复制,.,经反复循环,可使,DNA,扩增几百倍,然后对,PCR,产物进行测定,.,如果用突变基因的引物进行扩增,只有在病人的,DNA,也有同样突变时才能扩增,而正常,DNA,不会扩增,.,2.,DNA,杂交,(DNA hybridization),将病人的,DNA,变成单链后,滴在硝酸纤维膜上,在加入带有放射性的已知突变基因,.,如果病人,DNA,带有相同的突变基因片断,可与之杂交,在纤维膜上出现放射性斑点,反之则无,.,25,基因治疗概论,二.基因疾病的诊断方法25基因治疗概论,3.,限制性内切酶,(restriction enzymes),用一种或几种限制性内切酶消化病人的,DNA,由于该酶具有特异性识别和裂解碱基序列的功能,可将,DNA,分解成特定长度的,DNA,片段,经过电泳,使,DNA,片断按大小排列成图谱,.,如果病人,DNA,有突变,及可增加或减少几个切点,某些部位就不能被内切酶切开,出现某些,DNA,片断的缺如或增多,根据这些异常的,DNA,片断序列图谱,可初步确定突变的部位,.,进一步可用,DNA,杂交,如果该部位能与带有放射性的突变基因杂交,则可做出诊断,.,如果能于正常基因杂交,则可否认诊断,.,必要时做,DNA,碱基序列分析,.,26,基因治疗概论,3. 限制性内切酶(restriction enzy,4.,单链构象多态分析,(single-strand conformation polymorphism,SSCP),将病人的,DNA,作为膜板,应用特异性引物和,32,P-dCTP,做,PCR,然后将,PCR,产物进行聚丙烯酸胺,/,尿素凝胶电泳分析,如果病人的基因有一个碱基丢失,使,PCR,产物的构象发生变异,在电泳中的速度就会与正常不一样,出现异常的显影带,从而得出诊断,.,5.,其它,随着分子生物学的不断发展,新的检测技术不断出现,如连接酶链反应,(Ligase Reaction,LCR),外显示扫描技术,(Exon scanning technique),等,.,27,基因治疗概论,4.单链构象多态分析(single-strand confo,三基因转移,基因转移可载体外或体内进行,.,体外基因转移是从病人体内选择适合的靶细胞,在体外进行培养和基因修饰,然后将被修饰基因的细胞送回病人体内,.,体内基因转移是通过一种媒介物,将正常基因输送给病人,.,这种媒介物可以亲和到病人体内的特定组织细胞,将正常基因送入靶细胞,.,基因转移的主要方法,:,1.,显微注射法,(Microinjection),应用特制的玻璃管,将基因片断直接注入到靶细胞核,.,一般说来,约有,1/4,的外界基因可在靶细胞中存活,并能表达其功能,.,目前西德的一家研究所应用计算机显微注射技术,每小时可注射,1500,个细胞,.,其缺点是操作比较复杂,被注入的基因可能随机整合到靶细胞染色体,结果可能会激活靶细胞的某些基因或使其失活,.,本法已用于动物,注射一种基因片断到卵细胞,达到转移基因的作用 。,28,基因治疗概论,三基因转移28基因治疗概论,2.,电涵法,将基因,DNA,和靶细胞放入低传导液的电极槽中,通过,10,15s,电压,0.25v.,通过电子打孔和细胞的胞饮作用,使基因进入细胞,.,3.,生物媒介法,(Biological vectors),利用生物媒介物传递基因的方法为生物媒介法,.,即将经重新改造的生物体基因片断作为媒介物,发挥正常的媒介功能,将正常基因传送到靶细胞,进行基因治疗,同时对机体靶细胞无害,.,理想的生物媒介物应具备以下四个条件,:,(1).,该生物媒介物比较容易亲和靶细胞,.,(2).,可将携带的基因送入靶细胞,并与靶细胞的基因组和,.,(3).,在靶细胞中,被生物媒介物传递的基因能够比较稳定的表达其功能,并且这种基因表达可被生理调节等,.,29,基因治疗概论,2.电涵法29基因治疗概论,(4).,对人体不产生不良作用,如感染,免疫和致癌等,.,病毒是目前广泛应用的一种比较理想的生物媒介物,主要包括腺病毒,腺相关病毒,逆转录,.,病毒和疱疹病毒等,.,他们几乎可以感染所有哺乳类动物细胞,.,其中腺病毒是,DNA,病毒,逆转录病毒是,RNA,病毒,.,基本程序,:,先用适当的限制性内切酶,切除病毒本身有害的,DNA,片断,然后将需要植入的,DNA,基因,嵌入病毒的,DNA,中,进行基因重组,形成携带正常基因的生物酶介物,.,用这种带有正常基因的病毒感染人体靶细胞,可使正常基因进入靶细胞,整合或不整合到靶细胞的染色体中,发挥正常基因的功能,治疗疾病,.,自,1984,年以来,科学家已将一些人类正常基因植入到病毒,并成功地用于动物试验和临床治疗,.,其中包括腺苷脱胺酶基因,-,球蛋白基因,粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因,葡糖脑苷脂酶基因,1,-,抗胰蛋白酶基因等,30,基因治疗概论,(4).对人体不产生不良作用,如感染免疫和致癌等.30基因,四,.,靶细胞的选择,造血细胞,成纤维细胞,肝细胞,内皮细胞,角化细胞和上皮细胞均可作为基因治疗的靶细胞,选择哪一种细胞为靶细胞的依据为,:,1.,疾病累计的主要部位,2.,靶细胞来源的难易 程度,3.,体外培养的成活率和存活时间,4.,接受正常基因的能力,5.,新的正常基因在靶细胞中能否正常表达和持续时间,.,举例说明如下,:,(1).,骨髓细胞,骨髓成液态,存在与骨髓腔,抽取容易,组织培养骨髓细胞增殖很快,.,病人麻醉下,从髂骨多次抽取骨髓,500800mL,与肝素混合防止凝集,然后加入组织培养液进行培养,.,选择适当的方法对培养中的骨髓细胞进行基因修饰,在将携带新基因的骨髓细胞输回病人,.,本法适合治疗血液和免疫系统疾病,近来则试用治疗肿瘤,.,31,基因治疗概论,四.靶细胞的选择 31基因治疗概论,(2).,肝细胞,肝细胞是中间代谢的关键组织,存在很多肝脏特异性酶和辅助因子,很多遗传病和代谢性疾病与肝脏有关,.,从患者取得肝细胞,让携带正常基因的病毒进行感染和基因修饰,然后经过腹膜或皮下注射,或从肝胆管、门静脉注入,向输入种子一样,使修饰后的肝细胞在肝脏组织中再生,新基因表达,纠正代谢紊乱,.,本法提纯较困难,修饰后的肝细胞移植回体内的存活率低,.,五第一例基因治疗,腺苷脱氨酶缺乏症（,adenosine deaminase deficiency,）,1990,年,9,月,14,日对一位腺苷脱氨酶缺乏症的女童进行首例基因治疗,.,该病是一种遗传性疾病,多见于儿童,发病率在欧美为,10,万分之一,亚洲较少见,.,临床表现为严重免疫力下降,.,腺苷脱氨酶是一种细胞内酶,在核酸代谢中起重要作用,使淋巴细胞中的脱氧腺苷脱氨成为脱氧肌苷,最后代谢为尿酸,排出体外,.,当腺苷脱氨酶缺乏时，脱氧腺苷不能脱氨，在细胞内大量堆积，造成淋巴细胞死亡，机体免疫功能下降。,32,基因治疗概论,(2).肝细胞32基因治疗概论,过去对本病无有效治疗办法，病人多于几岁或十几岁时死于不可控制的感染。近十余年，科学家陆续获得四项研究成果，为本病的基因治疗奠定了基础。,1.,发现腺苷脱氨酶基因位于染色体,20,的长臂。,2.1983,年腺苷脱氨酶基因被克隆。,3.,应用逆转录病毒可将该基因送入缺乏腺苷脱氨酶基因的淋巴细胞。,4.,新输入的腺苷脱氨酶基因可在原来没有此基因的淋巴细胞中表达，恢复正常功能。,以上四项成果已成为进行其它基因治疗前的四种类似的必要条件。,治疗步骤：体外基因修饰,/,骨髓移植法,1,麻醉下，从病人髂嵴抽取骨髓液，分离淋巴细胞。,2.,将病人的淋巴细胞与携带腺苷脱氨酶基因的逆转录病毒混合培养，经“病毒感染”使腺苷脱氨酶基因进入淋巴细胞。,33,基因治疗概论,过去对本病无有效治疗办法，病人多于几岁或十几岁时死于不可控制,3,.,清洗淋巴细胞，去除多于的病毒。应用报告基因等方法筛选带有腺苷脱氨酶基因的淋巴细胞，检测细胞内外的腺苷脱氨酶含量。确定腺苷脱氨酶基因在淋巴细胞中有满意表达后，将带有此基因的淋巴细胞输回病人体内。,4.,密切观察病人各项免疫指标的变化，必要时重复。,经基因治疗后，该女孩的免疫功能本恢复。本病治疗成功，有力推动了基因治疗的进展。,34,基因治疗概论,3.清洗淋巴细胞，去除多于的病毒。应用报告基因等方法筛选带有,小 结：,1,。在对病人基因治疗前，需要完成哪些工作？,2,。目前，临床试用基因治疗的遗传性疾病,和后天性疾病是哪些？,3,。简述第一例基因治疗,-,腺苷脱氨酶缺乏,症的概况？,35,基因治疗概论,小,谢 谢！,36,基因治疗概论,谢 谢！36基因治疗概论,