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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一节、蛋白质的根本组成单位,第二节、蛋白质的分子结构,第三节、蛋白质的分类及性质,第四节、核酸的化学组成,第五节、核酸分子的结构,第六节、核酸的理化性质和别离提纯,第五章蛋白质与核酸,蛋白质是由天然氨基酸(Amino acid)通过肽键(Peptide bond)连接而成的生物大分子。,是一切生物体中普遍存在的生物大分子，是生物功能的主要载体。生物遗传形状存在于信息大分子DNA中是通过蛋白质来表现的。酶、调节蛋白、转运蛋白、贮存蛋白等,蛋白质种类繁多、各具一定的相对分子量一般在一万到一百万，甚至高达数百万、复杂的分子结构和特定的生物功能。,蛋白质,第一节、蛋白质的根本组成单位,一蛋白质的元素组成：,C,、,H,、,O,、,N,及少量的,S,和磷硒以及金属元素。 特点：,N,在各种蛋白质中的平均含量为,16%,， 用定氮法可测定蛋白质含量：,蛋白质含量,(g) =,蛋白质含氮量,6.25,二、蛋白质的组成单位,pro,的水解,1、完全水解：用浓酸、碱将蛋白质完全水解为氨基酸。,酸水解：无消旋作用，产物为L-氨基酸。,碱水解：多数氨基酸被破坏，有消旋现象。,2、局部水解： 一般用酶或稀酸在较温和条件下，将蛋白质分子切断，产物为分子大小不等的肽段和氨基酸。,蛋白酶：(内切酶、内肽酶胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶等。,一氨基酸的命名和结构特点,氨基酸amino acid, 简写aa)：蛋白质的根本组成单位，是含氨基的羧酸。天然蛋白质由20种氨基酸组成。通常用通俗命名如甘氨酸、丙氨酸。,构成蛋白质的氨基酸结构特点1蛋白质水解得到的氨基酸都是a-氨基酸，氨基都连接在a碳原子上，可用通式表示，R成为氨基酸侧链基团,2不同氨基酸在于R不同，除了R为H的甘氨酸外，其他氨基酸a碳原子都有手性，具旋光异构存在D和L型 ，构成天然蛋白质的氨基酸均为L型。,二氨基酸的分类,蛋白质氨基酸： 蛋白质中常见的20种氨基酸,稀有的蛋白质氨基酸：蛋白质组成中，除上述20种常见氨基酸外，从少数蛋白质中还别离出一些稀有氨基酸，它们都是相应常见氨基酸的衍生物。如4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸等。,非蛋白质氨基酸：生物体内呈游离或结合态的氨基酸。,生物体内常见氨基酸的分类,二十种常见蛋白质氨基酸的分类、结构及三字符号,据营养学分类,必需,非必需,据,R,基团化学结构分类,脂肪族A 中性、含羟基或巯基、酸性、碱性,芳香族,A(Phe,、,Tyr,、,Trp),杂环,(His,、,Pro),据,R,基团极性分类,极性,R,基团,AA,非极性R基团AA种,不带电荷种,据氨基、羧基数分类,一氨基一羧基,一氨基二羧基,(Glu,、,Asp),二氨基一羧基,(Lys,、,His,、,Arg),人的必需氨基酸,Lys,Trp,Phe,Val,Met,Leu,Ile,Thr,Arg,、,His,带电荷：正电荷种负电荷种,甘氨酸 Gly,G,丙氨酸 Ala,A,缬氨酸 Val,V,亮氨酸 Lue,L,异亮氨酸 Ile,I,中性脂肪族氨基酸,含羟基或硫脂肪族氨基酸,丝氨酸 Ser,S,苏氨酸 Thr,T,半胱氨酸 Cys,C,甲硫氨酸 Met,M,酸性氨基酸及酰胺,天冬氨酸 Asp,D,谷氨酸 Glu,E,天冬酰胺 Asn,N,谷氨酰胺 Gln,Q,碱性氨基酸,赖氨酸 Lys,K,精氨酸 Arg,R,组氨酸 His,H,杂 环氨基酸,杂环氨基酸,组氨酸 His,H,脯氨酸 Pro,P,芳香族氨基酸,苯丙氨酸 Phe,F,酪氨酸 Tyr,Y,色氨酸,Trg,W,三氨基酸的理化性质,1、物理性质,溶解度：水中溶解度差异较大， 不溶于有机溶剂。,光吸收性：可见光区无，紫外光区PheThyTrp有光吸收。,旋光性：AA的物理常数，与结构、PH值有关。,味感：不同味道(与构型有关)。,两性解离和等电点：AA在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。,2,、化学性质,氨基的化学反响:,与茚三酮 (ninhydrin) 的反响 定量反响,与亚硝酸的反响 Van Slyke定氮,与2,4-二硝基氟苯 (FDNB) 的反响 测序,与甲醛的反响 氨基滴定,与酰化基的反响 氨基保护基,与二甲基氨基萘磺酰氯 (DNS-Cl)的反响 测序,与荧光胺的反响 微量检测,与Edman试剂 (苯异硫氢酸) 和 测序,有色Edman试剂的反响,羧基的化学反响,Strecker降解:,弱氧化剂 (次氯酸钠, N-bromosuccin,imide) 作用下生成NH3和醛(RCHO),特殊条件下, 复原成氨基醇、氨基醛,与肼 (hydrazine) 的反响 C端氨基酸分析,侧链的化学反响,羟基: 酯化 (生物体内的磷酸化),巯基: 氧化复原,参考文献：Chemistry and Biochemistry of the amino acids, G.C.Barrett, Chapman and Hall,1985,1氨基和羧基共同参与的反响成肽反响,肽键又称酰胺键，,是多肽及蛋白子分子的,主要化学键。在蛋白质中,AA,通过肽键相连形成寡肽多肽，,以,AA,残基存在。,茚三酮,(,无色,),+,2与茚三酮的反响：Pro产生黄色物质，其它为蓝紫色。,a-AA和水合茚三酮加热生成有色物质，AA的定性或定量测定,加热,弱酸,NH,3,CO,2,RCHO,+,还原性茚三酮,+,2NH,3,+,还原性茚三酮,还原性茚三酮,3H,2,0,紫色化合物,第二节、蛋白质的分子结构,构型：指在立体异构体中取代原子或基团在空间的取向。,构象：指这些取代基团在单键旋转时可能形成的不同的立体异构体。,蛋白质的构象：指蛋白质特有的空间结构。,蛋白质结构有不同的组织层次,：,1952年丹麦人Linderstrom-Lang最早提出蛋白质的结构可以分成四个层次:,primary structure 一级结构： 氨基酸序列,secondary structure 二级结构： 螺旋,折叠,tertiary structure 三级结构：所有原子空间位置,quanternary structure 四级结构： 蛋白质多聚体,1969年正式将一级结构定义为氨基酸序列和双硫键的位置。,介于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构二级结构的组合和结构域在空间上相对独立这两个层次。,一、一级结构蛋白质分子的根本化学结构共价结构,一级结构专指氨基酸序列,提问：什么是蛋白质的一级结构，维持蛋白质一级结构的作用力是什么键？,肽键和,二硫键,1,、蛋白质的二级结构,(Secondary Structure),多肽链骨架,中原子的,局部空间,排列，,不涉及侧链,的构象，也就是该肽段主链骨架原子的相对空间位置。,维持二级结构的力量为：,氢键,二、蛋白质的空间结构,肽链的骨干是由NHCHRCO单位规那么地、重复排列而成，称之为共价主链,(1) -螺旋结构-Helix ,(2) -折叠结构-sheet ,(3) -转角 - turn ,(4) 无规卷曲 (random coil),多肽链的二级结构主要有以下几种方式,螺旋,有左右手之分,1-螺旋结构特点,1) 主链绕中心轴按右手螺旋方向盘旋，侧链伸向螺旋外侧。每3.6 个氨基酸残基前进一圈，每圈前进距离是0.54nm(螺距，每个氨基酸残基占0.15nm。,2) 每个氨基酸残基的亚氨基与它前面第四个氨基酸残基的羰基氧原子形成氢键，氢键与螺旋轴近似平行。,2、-折叠结构(-片层结构),3、-转角,蛋白质分子的主链在盘曲折叠运行中，往往发生180度的急转弯，这种回折部位的构象，即所谓的-转角。,-转角是由4个连续的氨基酸残基组成的，第一个氨基酸残基的羰基氧原子与第四个氨基酸残基的亚氨基连接来稳定构象。,螺旋,折叠片,转角,无规卷曲,4、无规卷曲它是多肽主链不规那么、多向性地随机盘曲所形成的构象。球蛋白分子中常见的一种主链构象。,(1)、球状蛋白质分子的三级结构,球状蛋白质分子的二级结构不是活性分子的结构形式，需要在二级结构的根底上再盘曲折叠形成三级结构。,蛋白质分子的三级结构是指蛋白质分子在一、二级结构的根底上，借助于各种非共价键在三维空间盘曲、折叠成具有特定走向的紧密、近似球状的构象。,蛋白质分子的三级结构包括全部主链、侧链在内的所有原子的空间排部，但不包括肽链间的相互关系,球状构象给出最低的外表积和体积比，因而使蛋白质与环境的相互作用降到最小，最稳定。,2,、蛋白质的三级结构,(Tertiary structure),3.,蛋白质的三级结构,一条多肽链内二级结构单元的彼此组合后的固定结构,作用力,来自侧链基团,球状蛋白质分子三级结构的构象特征,(1)三级结构的构象近似球形。,(2)分子中的亲水基团大多相对集中在球形分子的外表，疏水基团相对集中在分子内部。,(3)三级结构构象的稳定性主要靠疏水的相互作用来维系。,(4)三级结构形成后，蛋白质分子的生物活性中心就形成了。在球形分子的外表往往有一个很深的裂隙，活性部位就在其中。,三级结构的典型例子是肌红蛋白,肌红蛋白的三级结构,维系蛋白质空间结构的化学键,氢键,(hydrogen bond),离子键,(,盐键,)(electrostatic interactions),疏水相互作用,(hydrophobic interaction),范德华力,(van der waals force),二硫键,(disulfide bond),A.三级结构中的作用力,包括二硫键、氢键、离子键、疏水作用力、范德华力,氢键,(,侧链间形成,),疏水作用,“非极性基团被极性水分子排挤相互聚拢作用力。,范德华力分子间作用力，受彼此距离影响,离子键（或盐键）,二硫键,肽键,二硫键,离子键,氢键,疏水键,范德华力,90kcal/mol,3kcal/mol,1kcal/mol,1kcal/mol,0.1kcal/mol,这四种键能远小于共价键，称,次级键,次级键微弱但却是,维持蛋白质三级结构中主要的作用力,原因何在,?,数量巨大！,键 能,2、纤维蛋白分子的结构,在纤维蛋白分子中螺旋肽链一般为平行排列,含大量的-螺旋，-折叠片，整个分子呈纤维状,角蛋白、丝心蛋白、胶原蛋白的结构都是如此。,广泛分布于脊椎和无脊椎动物体内，起支架和保护作用。,三条右手,-,螺旋 一个原纤维 大原纤维 纤维,角蛋白,3、球状蛋白质分子的四级结构,有些球状蛋白质分子是由两个或两个以上的、具有独立三级结构的肽链单位缔合而成的，这种蛋白质通常称为寡聚蛋白或多体蛋白multimeric protein。,寡聚蛋白分子中的每一个三级结构单位称为一个亚基(或亚单位subunit、单体monomer)。,所谓蛋白质分子的四级结构是指,就是指寡聚蛋白分子中亚基与亚基之间的立体排布及相互作用关系。,亚基的数目和类型也是四级结构研究的内容。,四级结构的稳定靠非共价键联系：主要包括疏水作用主要，其次还有离子键、氢键、范德华力来维系。,血红蛋白的四级结构,三、多肽、蛋白质结构与功能的关系,一、多肽的一级结构与功能,生物体中存在多种活性肽，如：生长激素、加压素、催产素等。,1,、核糖核酸酶的可逆变性,二、蛋白质的一级结构决定高级结构,牛核糖核酸酶的一级结构,二硫键,天然状态，有催化活性,尿素、,-,巯基乙醇,去除尿素、,-,巯基乙醇,非折叠状态，无活性,2、蛋白质前体的激活,无活性的前提称为“原，如酶原、胰岛素原,（切除冗余及其它变化）,前体蛋白,（一级结构冗余，高级结构错误，因此无生物活性）,活性蛋白,（具有正确的一级结构和高级结构，因此具有生物活性）,适合环境,镰刀状贫血病：血液中大量出现镰刀红细胞，患者因此缺氧窒息,正常细胞 镰刀形细胞,它是最早认识的一种分子病。它是由于遗传基因突变导致血红蛋白分子结构的突变。,3,、分子病,这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病,正常型,-,Val-His-Leu-Thr-Pro-,Glu,-Lys -,链,谷氨酸,镰刀型,-,Val-His-Leu-Thr-Pro-,Val,-Lys,-,链,缬氨酸,谷Aa极性 缬Aa非极性,由于缬氨酸上的非极性基团与相邻非极性基团间在疏水力作用下相互靠拢，并引发所在链扭曲为束状，整个蛋白质由球状变为镰刀形，与氧结合功能丧失，导致病人窒息甚至死亡。,三、蛋白质空间结构与功能的关系,1、血红蛋白的变构效应与运输氧的功能,变构现象,p72,外因通过改变蛋白质构象引起蛋白质功能变化的现象。,血红蛋白,(,R),relaxed state,(,T),tense state,血中氧分子的,运送,：,Lung,氧,分,子,Hemoglobin,Myoglobin,Muscle,静脉,动脉,环境氧高时,Hb,快速吸收氧分子,环境氧低时,Hb,迅速,释放,氧分子,释放氧分子后,Hb,变回,T state,任何一,个亚基,接受,氧,分子,后,，,会增进,其它,亚基,吸附,氧,分子的能力,2,、蛋白质变性,一些物理或化学因素会破坏蛋白质空间结构，导致蛋白质生物活性丧失，同时引起某些物理性质和化学性质的变化，如溶解度降低、发生沉淀等现象称为,蛋白质变性。,天然蛋白质和变性蛋白在一级结构上相同，生物活性丧失。,变性蛋白质分子恢复其天然构象，称为复性。,变性因素：加热,/,加压,/,射线,/,强酸,/,强碱,/,有机溶剂等,第三节、,蛋白质的分,类及性质,一、分类,1、按组成分：单纯蛋白、结合蛋白,单纯蛋白只含氨基酸。,结合蛋白除蛋白局部外还含有非蛋白成分辅基共价键结合，如免疫球蛋白/细胞色素C等。,2、按形状分：纤维状蛋白、球状蛋白,纤维蛋白：多结构蛋白难溶于水构成支架，如胶原蛋白。,球状蛋白：多溶于水，酶/转运蛋白/激素/免疫球蛋白等。,二、蛋白质的理化性质,一蛋白质的两性解离与等电点,蛋白质中可解离,酸性基团,Glu,的,-COOH,Asp,的,-COOH,Tyr,的酚羟基,Cys,的-,SH,碱性基团,Lys,的,-NH2,His,的咪唑基,Arg,的,-,胍基,蛋白质分子的总解离,蛋白质的等电点,蛋白质溶液在特定的,pH,下，,其分子所带的正、负电荷相等，净电荷为零，这一,pH,称为,(,用,PI,表示,),。,蛋白质纯化方法,等电点沉淀法,蛋白质电泳,离子交换法,蛋白质两性解离与等电点特性的应用,静电排斥力的缺乏,蛋白质之间的聚集,等电点,沉淀,几种常见电泳,等电聚焦,纸电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳,OFarrell,的双向电泳,银染结果,考马斯亮染色为蓝色,二胶体性质,蛋白质水溶液为亲水胶体。,不能通过半透膜；,分子周围有双电子层和水化层，有利于稳定,pr,胶体系统。,超滤,透析,切向流过滤模式,去除机制 - 外表孔径拦截,进料 液,滤出液,回流液,膜,产品,产品,污染物,蛋白质的膜别离技术,透析,三沉淀反响,机理：1利用pr两性电离性质。,2许多化学试剂可减少pr与水的亲和力,盐析、醇、酸、重金属离子、生物碱等,1、概念蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的、相对的，假设改变环境条件，破坏其水化膜和外表电荷，蛋白质亲水胶体便失去稳定性，发生絮凝沉淀的现象，就称为蛋白质的沉淀作用。,蛋白质的沉淀可分为,不变性沉淀用于别离活性的天然蛋白质产品酶、抗体等。,变性沉淀用于生物制品中除去蛋白质。,2、沉淀的方法,(1) 等电点沉淀法,(2) 盐溶与盐析分级盐析,盐溶在盐浓度很低时，蛋白质的溶解度随着盐浓度的增加而增加，这种现象称为蛋白质的盐溶。,盐析在蛋白质溶液中参加高浓度的中性盐后，它与蛋白质胶体粒子竞争水份，使蛋白质胶体粒子外表的水化层破坏而失去稳定性，同时降低了蛋白质与水的亲和力而使蛋白质沉淀的现象。,不同的蛋白质的带电性质、分子量不同，水膜厚度不同，故盐析所需的盐浓度也不同。,等电点沉淀的蛋白质溶液中参加NaCl后沉淀溶解盐溶Salting-in,盐溶,蛋白质分子在等电点时，容易互相吸引，聚合沉淀；参加盐离子会破坏这些静电相互作用，使分子散开而溶于水,盐析,向蛋白质溶液中参加大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出盐析Salting out,蛋白质分子外表的疏水区域，聚集了许多水分子，盐浓度高时，这些水分子被盐抽出水化层被破坏，暴露出的疏水区域，它们发生相互作用而沉淀。,NH42SO4,一般来讲，分子量越大的蛋白质分子，越容易盐析，所需盐浓度也越低。因此，对于不同分子大小的蛋白质，可采用不同的盐浓度进分级沉淀。,常用的盐是,(NH,4,),2,SO,4,(3) 有机溶剂沉淀法,一些极性的有机溶剂(如乙醇、丙酮等)能破坏蛋白质胶粒的水化层，使疏水基团暴露使蛋白质沉淀。,(4) 重金属盐沉淀法,蛋白质在碱性溶液中带负电，可与重金属离子如Zn+2、Cu+2、Hg+2、Pb+2、Fe+3等作用，产生重金属蛋白盐沉淀。,(5) 热变性沉淀法,(6) 生物碱试剂沉淀法,生物碱试剂如单宁酸、钼酸、钨酸、三氯醋酸等具有酸性，而蛋白质在酸性溶液中带正电荷，故能与带负电的酸根相结合，成为溶解度很小的盐类。,四呈色反响,反响 试剂 颜色 反响基团,双缩脲反响 NaOH,稀CuSO4 紫或粉 2个以上肽链,Millon反响 米龙硝酸，亚硝酸 红色 酚基,黄色反响 HNO3及NH3 黄、橘黄 苯环,乙醛酸反响 乙醛酸H2SO4 紫红 吲哚,坂口反响 次氯酸钠,萘酚，NaOH 红色 胍基,Folin酚试剂反响 CuSO4磷钨酸-钼酸 兰色 酚基,茚三酮反响 茚三酮 紫兰色 游离氨羧基,五、蛋白质的紫外吸收性质,一般蛋白质在,280nm,波长具有最大吸收，这是由于蛋白质分子中的,Trp,、,Tyr,和,Phe,存在共轭双键的缘故。,
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