实验一大肠杆菌培养与分离课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2008-10,苍南中学 许允文,*,1-1,什么是生物技术,=,应用自然科学及工程学原理，以,微生物体、动物体、植物体或其组成部分,作为生物反应器将物料进行加工，以提供产品来为社会服务的技术。,1-1什么是生物技术=,1,1-2,传统生物技术,传统,生物,技术指,主要,通过,微生物的,发,酵,来,生,产,商品,.,如,:,酱、醋、酒、面包、奶酪、酸奶等,1-2 传统生物技术传统生物技术指主要通过微生物的发酵来生,2,1-3,现代生物技术,一般而言，現代生物,技术,可以分成以下五,种,：,一、,细胞工程,二、,发酵工程,三、,蛋白质工程,四、,酶,工程,五、,基因工程,现代生物技术与传统生物技术的本质区别是,现代生物技术中用到了基因工程。,1-3 现代生物技术一般而言，現代生物技术可以分成以下五种：,3,选修,1,需学习的实验,（微生物的利用）,实验,1,大肠杆菌的培养和分离,实验,2,分离以尿素为氮源的微生物,（酶的应用）,实验,4,果汁中的果胶和果胶酶,实验,6 -,淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测,（生物工程在食品加工中的应用）,实验,8,果酒及果醋的制作实验,实验,10,泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定,（浅尝现代生物工程）,实验,11,植物的组织培养,选修1需学习的实验 （微生物的利用）,4,实验,1,大肠杆菌的培养和分离,第一部分,:,微生物的利用,实验1 大肠杆菌的培养和分离 第一部分 :微生物的利用,5,一、基础知识,1,微生物,2,培养基,3,无菌技术,二、实验操作,2,微生物的接种技术,1,操作步骤,一、基础知识1微生物2培养基3无菌技术二、实验操作2微生物的,6,特点：结构,简单,，形体,微小,，通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构。,微生物包括,病毒,细菌,放线菌,真菌,原生动物,原核生物界,原生生物界,真菌界,病毒界,是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称,一、基础知识,:,1.,关于微生物,:,用途：,90%,以上的微生物是对人类,有利的,。如抗生素多数来源放线菌和霉菌；酒由酵母菌发酵产生，腐乳由红曲霉和毛霉发酵制成；微生物也能消除环境污染，在新能源领域将发挥巨大作用。,特点：结构简单，形体微小，通常要用光学显微镜或电子显微镜才能,7,1,）放线菌,1,、结构：,单细胞原核,分支状的菌丝（基内菌丝、气生菌丝）,1）放线菌1、结构：,8,2,）病毒,2）病毒,9,SARS,病毒、 禽流感病毒,SARS病毒、 禽流感病毒,10,朊病毒（蛋白质病毒）,朊病毒（蛋白质病毒）,11,病毒的增殖：,病毒的增殖：,12,3,）真菌,3）真菌,13,如图是酵母菌电子显微镜下的形态结构,酵母菌和霉菌,青霉,如图是酵母菌电子显微镜下的形态结构酵母菌和霉菌青霉,14,4,）细菌的外形与大小,细菌：,单细胞不分枝的原核微生物,。,细菌细胞,微小而透明,，通常用适当染料,染色,（革兰氏染色）,后显微镜观察,图,1-1,常见的三种细菌典型形态,A.,球菌,B,.,杆菌,C.,弧菌,4）细菌的外形与大小细菌：单细胞不分枝的原核微生物。图1-1,15,*,细胞壁,成分：,肽聚糖,细胞壁有哪些功能？,固定细胞外形；,保护细胞免受外力的损伤；,阻拦大分子物质进人细胞,；,使细胞具有致病性及对,噬菌体的敏感性。,伤寒杆菌细胞壁中含毒素,*细胞壁成分：肽聚糖 保护细胞免受外力的损伤； ,16,芽孢,有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做,芽孢,。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸,3,小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌,.,芽孢 有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆,17,革兰氏染色：,代谢类型：,主要分布：,危害：,应用：,革兰氏阴性菌,异养兼性厌氧型,肠道,一般无害，少数有害,是基因工程中的主要受体菌之一,一、基础知识,:,2.,关于大肠杆菌,:,革兰氏阴性菌异养兼性厌氧型肠道一般无害，少数有害是基因工程中,18,二、微生物的培养,:,1),培养基的种类,:,按物理性质分,液体培养基：用于微生物的扩大培养,固体培养基：用于微生物的分离、鉴定、纯化,按功能分,普通培养基：,选择培养基：筛选,鉴别培养基：鉴定,伊红,美蓝培养基用于鉴别大肠杆菌,培养基（培养液）是,由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养,液。,成分区别：琼脂,二、微生物的培养:1)培养基的种类:按物理性质分液体培养基：,19,天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。,优点：,营养成分丰富，培养效果好,缺点：,来源受限,;,成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析,;,易发生支原体污染,;,根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。,合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。,优点：,标准化生产，组分和含量相对固定,;,成本低,缺点：,缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。,合成培养基,:,天然培养基：,天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。,20,不管哪种培养基，一般都含有,水,、,碳源,、和,氮源,、,无机盐,、,生长因子,等,营养物质，另还需要满足微生物生长对,pH,、,氧气,、,渗透压,要求,pH,值,细菌喜中性偏碱，霉菌喜中性偏酸,氧气的含量,如,:,培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件,2),培养基的成分：,它为微生物提供所需要的营养物质和生存环境。,不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、 无机盐、生长因,21,细菌喜荤，霉菌喜素,大肠杆菌配方：酵母提取物,0.5g,蛋白胨,0.5g,Nacl 0.5g,琼脂,1g,水,:50ml,3,）不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方：,维持一定的渗透压,霉菌培养基：一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁,细菌喜荤，霉菌喜素大肠杆菌配方：酵母提取物0.5g,22,三、无菌技术,1,、无菌技术的概念,无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。,成功地培养微生物的关键。,三、无菌技术1、无菌技术的概念 无菌操作泛指在培养微生物的,23,（,1,）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒 ；,（,2,）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌 ；,（,3,）为避免周围微生物污染，实验操作应在,酒精灯火焰附近,进行；,（,4,）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。,从制备培养基到接种与培养等全部实验过程要无菌操作,（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒 ；从制,24,（）,消毒定义：,2,、消毒与灭菌的概念及两者的区别,（,2,）灭菌的定义：,是指杀灭病原微生物的方法。,是指杀灭或清除环境中一切微生物（包括,芽胞,、,孢子,） 的方法。,（）消毒定义：2、消毒与灭菌的概念及两者的区别 （2）灭菌,25,1,、煮沸消毒法,:100,煮沸,5-6min,2,、巴氏消毒法：,70-75 ,下煮,30min,或,80 ,下煮,15min,（牛奶）,3,、化学药剂消毒法,:,用,70%,酒精进行皮肤消毒,;,氯气消毒水源,4,、,紫外线消毒（空气,）,(1),常用消毒的方法：,1、煮沸消毒法:100煮沸5-6min(1)常用消毒的方法,26,1,）干热灭菌法,灭菌的方法：,3,、常用的消毒与灭菌的方法,利用火焰将微生物杀死，或在,140160,的烘箱中加热,23,小时将微生物的营养体和芽孢杀死。,适用于金属或玻璃用具。,1）干热灭菌法灭菌的方法：3、常用的消毒与灭菌的方法利用火焰,27,2,）高压蒸气灭菌法：,100kPa,、,121 ,下维持,15-30min.,常用的灭菌法。,思考：,哪些用具可以用高压蒸汽灭菌法来灭菌？这些用具在灭菌前要如何处理？灭菌后还要如何处理？,2）高压蒸气灭菌法：常用的灭菌法。思考：,28,紫外线的光谱范围是,100400nm,，灭菌最有效的波长是,253.7nm,。,3,）紫外线灭菌法,4,）过滤灭菌法,注意：紫外光对人的皮肤、眼睛等会造成伤害，开启紫外灯后人必须离开。,5,）化学药剂灭菌法,有些化合物加热会分解，如,尿素,。,通常用,G6,玻璃砂漏斗,来过滤。,问：玻璃砂漏斗在使用前后的处理？,如：,25,漂白粉溶液、红药水、,7075,酒精等。,紫外线的光谱范围是100400nm，灭菌最有效的波长是25,29,1.,无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,2.,请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。,（,1,） 培养细菌用的培养基与培养皿,（,2,） 玻棒、试管、烧瓶和吸管,（,3,） 实验操作者的双手,答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（,1,）、（,2,）需要灭菌；（,3,）需要消毒。,思考,1,1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外,30,四、实验设备和用品：,1,、灭菌锅或高压锅,四、实验设备和用品：1、灭菌锅或高压锅,31,2,、,250ml,的三角瓶、封口膜和橡皮圈,P22 P26,实验设备和用品：,3,、直径,90mm,的培养皿,1,、灭菌锅或高压锅,4,、接种环和玻璃三角刮刀,接种环,2、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈P22 P26实验设备,32,接种环,玻璃三角刮刀,接种环玻璃三角刮刀,33,2,、,250ml,的三角瓶、封口膜和橡皮圈,实验设备和用品：,3,、直径,90mm,的培养皿,1,、灭菌锅或高压锅,4,、接种环和玻璃三角刮刀,5,、恒温培养箱,2、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈实验设备和用品：3、直,34,恒温培养箱,恒温培养箱,35,2,、,250ml,的三角瓶、封口膜和橡皮圈,P22 P26,实验设备和用品：,3,、直径,90mm,的培养皿,1,、灭菌锅或高压锅,4,、接种环和玻璃三角刮刀,5,、恒温培养箱,6,、摇床,2、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈P22 P26实验设备,36,摇床,摇床,37,2,、,250ml,的三角瓶、封口膜和橡皮圈,实验设备和用品：,3,、直径,90mm,的培养皿,1,、灭菌锅或高压锅,4,、接种环和玻璃三角刮刀,5,、恒温培养箱,6,、摇床,7,、酒精灯和超净台,2、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈实验设备和用品：3、直,38,超净工作台,超净工作台,39,2,、,250ml,的三角瓶、封口膜和橡皮圈,P22 P26,实验设备和用品：,3,、直径,90mm,的培养皿,1,、灭菌锅或高压锅,4,、接种环和玻璃三角刮刀,5,、恒温培养箱,6,、摇床,7,、酒精灯和超净台,8,、一次性手套,9,、装有酒精棉球的广口瓶,2、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈P22 P26实验设备,40,广口瓶,广口瓶,41,2,、,250ml,的三角瓶、封口膜和橡皮圈,P22 P26,实验设备和用品：,3,、直径,90mm,的培养皿,1,、灭菌锅或高压锅,4,、接种环和玻璃三角刮刀,5,、恒温培养箱,6,、摇床,7,、酒精灯和超净台,8,、一次性手套,9,、装有酒精棉球的广口瓶,10,、镊子,11,、有棉塞的试管,2、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈P22 P26实验设备,42,有棉塞的试管,有棉塞的试管,43,五、大肠杆菌的培养与分离,实验目的,:,1,、进行大肠杆菌的,扩增,，利用,液体培养基,进行细菌培养操作。,2,、进行大肠杆菌的,分离,，利用,固体培养基,进行细菌的,划线培养,。,3,、说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理。,五、大肠杆菌的培养与分离实验目的:,44,1,培养基的配制,2,、灭菌,3,、分装：,4,、利用液体培养基进行大肠杆菌的扩大培养,5,、划线分离和培养,6,、菌种保存,操作步骤,1培养基的配制操作步骤,45,1,培养基的配制,计算,、,称量,溶化,调,pH,：,pH7.6,为什么要调,pH,值？,P21,1,）,50mlLB,液体培养基：蛋白胨,0.5g,，酵母提取物,0.25g,氯化钠,0.5g,加水至,50ml,调节,pH,2,）,50mlLB,固体培养基：蛋白胨,0.5g,，酵母提取物,0.25g,氯化钠,0.5g,加水至,50ml,，,再加,1g,琼脂，加热熔化,，调节,pH,LB,液体培养基,细菌的扩大培养,LB,固体培养基,细菌的划线分离,1培养基的配制计算、称量溶化调pH：pH7.6为什么,46,大肠杆菌菌种斜面,空白斜面,大肠杆菌菌种斜面空白斜面,47,2,、灭菌,取,2,个,250ml,的三角瓶,中分别装入,50mlLB,液体培养基,和,50mlLB,固体培养基,（刚配好，尚未凝固），加上,封口膜,，,培养皿,用,牛皮纸,包装后,再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为,100kPa,、温度为,121,，灭菌,15,30min,。,封口膜：既通气又不使菌进入,将,培养皿,用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在,160,170 ,下灭菌,2h,。,2、灭菌 取2个250ml的三角瓶中分别装,48,干烤箱,烘干培养皿,干烤箱烘干培养皿,49,消毒：,用肥皂将双手洗净，擦干，再用,酒精,(,体积分数为,75%),棉球擦拭双手。,注意：,一定要等手上的酒精挥发完毕后，再点燃酒精灯，否则，容易将手烧伤。,消毒：注意：,50,3,、分装,倒平板,待培养基冷却到,60 ,左右时，在酒精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本）,2d,后观察平板，无杂菌污染才可用来接种,.,3、分装 倒平板待培养基冷却到60 左右时，在酒精,51,3,、分装,倒平板,通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,3、分装 倒平板通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培,52,3,、分装,倒平板,倒后立即置于水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面,.,3、分装 倒平板倒后立即置于水平位置上，轻轻晃动，使,53,3,、分装,倒平板,既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染,.,3、分装 倒平板既可以使培养基表面的水分更好地挥发，,54,做好无菌检查工作：,将灭菌的培养基放入,37,的温室中培养,2448,小时，以检查灭菌是否彻底。,做好无菌检查工作：,55,注意事项：,分装时，三角瓶口、试管口、壁上不能沾有培养基,原因：,否则容易发生污染,转移已灭菌的培养基之前必需对培养皿灭菌,注意事项： 原因： 否则容易发生污染 转移已灭菌,56,4.,大肠杆菌的扩大培养,将斜面上培养的大肠杆菌,菌种,接种,到,灭菌后的液体培养基,中,使其在,37,摇床,培养,12,小时。,注意事项,:,1.,火焰旁,从斜面上用接种环取菌,;,2.,取菌前,接种环要,用酒精灯,灼烧,灭菌,冷却后方能取菌,;,3.,取菌后封口膜和棉塞复原,.,4. 大肠杆菌的扩大培养 将斜面上培养的大,57,放入,37,摇床振荡培养,12,小时,放入37摇床振荡培养12小时,58,5.,大肠杆菌的划线分离,分离方法,:,划线分离法和涂布分离法,分离方法：平板划线分离法,原理：,通过接种环在,固体培养基,表面,连续划线,的操作，将,聚集,的菌种,逐步稀释分散,到培养基的,表面,。在,数次划线,后，可以分离到,由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,，这就是菌落。,只能蘸一次,、,再次划线从上次末端开始,、划好,倒置,培养,1-2,天、划线,末端出现不连续,的,单个菌落,5. 大肠杆菌的划线分离分离方法:划线分离法和涂布分离法分,59,划线分离,平板划线法,划线分离平板划线法,60,不能使用脱脂棉，否则容易吸水，造成污染。,划线分离,平板划线法,不能使用脱脂棉，否则容易吸水，造成污染。 划线分离,61,一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；,二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。,划线分离,平板划线法,一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；,62,37C,恒温培养箱培养,12-24h,划线分离,平板划线法,37C恒温培养箱培养12-24h 划线分离平板,63,平板划线接种,灼烧接种环,冷却,划线,（第一区域）,蘸取菌液,灼烧接种环,冷却,划线,（第二区域）,灼烧接种环,冷却,划线,（第三区域）,灼烧接种环,冷却,划线,（第四区域）,灼烧接种环,冷却,划线,（第五区域）,灼烧接种环,平板倒置放置培养,平板划线接种灼烧接种环冷却 划线 蘸取菌液灼烧接种,64,平板划线分离法的注意事项：,1.,接种环,只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置,连续划线多次,.,2.,划线,首尾不能相接,3.,划线后,培养皿,倒置培养,1224h,平板划线分离法的注意事项：1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养,65,分离后,一个菌体便会形成一个菌落,这是,消除污染杂菌的通用方法,也是用于,筛选高表达量菌株,的最简便方法之一,分离后,一个菌体便会形成一个菌落,这是消除污染杂菌的通用方法,66,单菌落,单菌落,67,菌落,单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体,。,菌落是鉴定菌种的重要依据。,菌落单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个,68,问题讨论,1.,为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,问题讨论 1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧,69,2.,在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.,在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,4.,在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,2. 在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线,70,2,、涂布分离法,:,是指将培养的菌液稀释一定的倍数,然后取一定量稀释液加在固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上,.,2、涂布分离法:是指将培养的菌液稀释一定的倍数,然后取一定量,71,2,、涂布分离法,2、涂布分离法,72,思考：划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？,划线分离：,方法简单，但单菌落较难分开。,涂布分离：,单菌落更易分开，但操作复杂。,平板稀释涂布法,平板划线法,思考：划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？划线分离：方法简单，,73,五、培养,将接种后的培养皿放入恒温箱内，在,37,下培养,12-24h,。,若在连线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离,五、培养若在连线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离,74,微生物的恒温培养,微生物的恒温培养,75,菌种的保存,1,、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于,4,冰箱保存。,2,、长期保存：甘油冷冻管藏法,菌种的保存 1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长,76,1.,如何操作才可以尽量避免被杂菌污染,?,(1),胆大心细，操作快捷。（,2,）注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。（,3,）注意微生物生长条件，如,PH,、渗透压、温度等。细菌喜碱，喜蛋白质，喜,37,度；霉菌喜酸，喜糖，喜,25-30,度,1.如何操作才可以尽量避免被杂菌污染?(1)胆大心细，操作快,77,2.,在培养后如何判断是否有杂菌污染,?,（,1,）,菌落的形态,看，是否湿润，透明，粘稠，颜色等。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。,（,2,）,显微镜观察其形态、大小,、看是否有菌丝、孢子、芽孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。,（,3,）上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化学和进一步的形态观察，如用,革兰氏染色法,等。,2.在培养后如何判断是否有杂菌污染?（1）菌落的形态看，是否,78,3.,进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置,?,恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成水滴留在盖上；如果正放，则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目的。,3.进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置?恒温培养时，培养基中,79,4.,实验完成后,接种过细菌的器皿应如何处理,?,所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后再洗涤（特别是培养基）；使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃,4.实验完成后,接种过细菌的器皿应如何处理?所有接触过菌的器,80,5.,如果分离的是转基因的大肠杆菌,如何保证不被普通的大肠杆菌所污染,?,转基因用的质粒不是细菌中原有的，而是经过改造的，通常加入了抗性基因的,DNA,序列，所以可用含有相应抗生素的培养基对菌体进行培养。,5.如果分离的是转基因的大肠杆菌,如何保证不被普通的大肠杆菌,81,实验一大肠杆菌培养与分离课件,82,细菌的革兰氏染色,革兰氏染色法是一种用于细菌的染色法。此法将细菌分为两类，即,革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,。所谓革兰氏阳性菌就是用革兰氏染液染色后，再用脱色液处理，细菌仍保留染色液的颜色；革兰氏阴性菌则相反。这两种菌的,差别在于细胞壁的成分不同,。,大肠杆菌属于革兰氏阴性菌,细菌的革兰氏染色 革兰氏染色法是一种用于细菌的染色法,83,根据细菌所利用的,能源和碳源,的不同将细菌分为两大营养类型。,自养菌,:,异养菌,:,腐生菌,寄生菌 大部分病原菌,细菌的营养类型,光能自养型,:,光合细菌,化能自养型,:,硝化细菌,铁细菌,硫细菌,大肠杆菌属于异养兼性厌氧菌,能源不同,碳源不同,根据细菌所利用的能源和碳源的不同将细菌分为两大营养类型。细菌,84,选择培养基,加入青霉素的培养基,:,分离酵母菌、霉菌等真菌,加入高浓度食盐的培养基,:,分离金黄色葡萄球菌,不加氮源的无氮培养基,:,分离固氮菌,不加含碳有机物的无碳培养基,:,分离自养型微生物,加入青霉素等抗生素的培养基,:,分离导入了目的基因的受体细胞,加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶,核苷的培养基,:,分离杂交瘤细胞,选择培养基加入青霉素的培养基: 分离酵母菌、霉菌等真菌,85,芽孢,有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做,芽孢,。芽孢的,壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力,。例如，有的细菌的芽孢，煮沸,3,小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌,.,芽孢 有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆,86,实验一大肠杆菌培养与分离课件,87,伊红美蓝培养基鉴别大肠杆菌的原理：当,大肠杆菌,分解,乳糖,产酸时细菌带正电荷被染成红色，再与美蓝结合形成紫黑色,菌落,，并带有绿色金属光泽。而产气杆菌则形成呈棕色的大,菌落,。,在碱性环境中不分解,乳糖,产酸的细菌不着色，,伊红,和美蓝不能结合，故沙门氏菌等为无色或琥珀色半透明,菌落,。金葡菌在此培养基上不生长。,常用的,伊红,美蓝,乳糖,培养基，可用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在,大肠杆菌,等细菌。如果有,大肠杆菌,，因其强烈分解,乳糖,而产生大量的,混合酸,，菌体带,H+,，故,菌落,被染成深紫色，从菌落表面的,反射光,中还可以看到金属光泽。,伊红美蓝培养基鉴别大肠杆菌的原理：当大肠杆菌分解乳糖产酸时细,88,1,、高压蒸气灭菌：,100kPa,、,121 ,下维持,15-30min.,2,、灼烧灭菌,3,、紫外线灭菌,4,、过滤灭菌,5,、化学灭菌,灭菌的方法：,1、高压蒸气灭菌：100kPa、121 下维持15-30m,89,4),培养基的配制与灭菌,配制培养基,调整,pH,灭菌,倒平板,大肠杆菌：中性偏碱,4)培养基的配制与灭菌配制培养基大肠杆菌：中性偏碱,90,三、细菌的分离：,原理,:,不同的细胞具有不同的菌落特征,;,有些微生物对抗生素、高盐等具有抗性的特点。,方法,:,划线法,选择培养基培养,三、细菌的分离：,91,实验一大肠杆菌培养与分离课件,92,第一区域,第二区域,第三区域,第四区域,第五区域,划线分离法,注意事项,:,1.,接种环,只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置,连续划线多次,.,2.,划线,首尾不能相接,3.,划线后,培养皿,倒置培养,1224h,第一区域第二区域第三区域第四区域第五区域划线分离法注意事项:,93,实验一大肠杆菌培养与分离课件,94,