第十六章药物分析中的新技术新方法课件

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第十六章 药物质量控制中现代分析中的技术与方法,第十六章 药物质量控制中现代分析中的技术与方法,1,手性分离色谱,手性分离色谱,2,一、手性药物的现状,手性药物（579）,药物（1992）,天然和半合成药物（556）,合成药物（1436）,非手性药物（857）,单一异构体（73）,外消旋体（506）,手性药物（547）,非手性药物（9）,单一异构体（537）,外消旋体 （10）,一、手性药物的现状手性药物（579）药物（1992）天然和半,3,二、手性药物对映体的药效学差异,1. 治疗作用完全依赖一种异构体,如：,S,(-)-甲基多巴,2. 药理作用差别不大 如：异丙嗪,3. 药理作用类似，但反应强度有差别,4. 药理与毒理作用存在“质”的区别,二、手性药物对映体的药效学差异,4,二、手性药物对映体的药动学差异,1. 吸收,2. 蛋白结合,3. 代谢,二、手性药物对映体的药动学差异,5,1. 间接法拆分对映异构体即衍生化试剂法（CDR）,2. 直接法拆分对映异构体,手性固定相法（CSP）,手性流动相添加剂法（CMP）,三、手性药物拆分的高效液相色谱法分类,采用非手性固定相,1. 间接法拆分对映异构体即衍生化试剂法（CDR） 手性固,6,四、拆分原理：,为了使对映体转化为化学和物理性质不同的非对映体，就要提供一种手性源（,CDR,） ，使待拆分的对映异构体（样品）、手性作用物（如固定相）和手性源之间形成一个非对映异构分子的络合物。,三点手性识别模式,四、拆分原理：,7,(,R,) SE+,(,R,) SA (,R,) SE (,R,) SA,(,S,) SA (,R,) SE (,S,) SA,1. CDR,(R) SE+(R) SA (R) SE (R),8,柱前手性衍生化法：对映体混合物以手性试剂作柱前衍生化，形成非对映体，然后以常规（偶见手性）固定相分离。 对手性衍生化试剂的要求：高光学纯度。 常用的手性衍生化试剂：羧酸衍生物类、胺类、异硫氰酸酯类、异氰酸酯类、萘衍生物类、光学活性氨基酸类、固相衍生化试剂。,柱前手性衍生化法：对映体混合物以手性试剂作柱前,9,第十六章药物分析中的新技术新方法课件,10,手性衍生化特点：,需要高光学纯度的手性衍生化试剂；,反应繁琐费时；,衍生化反应速率重现性较差,只需使用价格便宜、柱效较高的非手性柱,衍生化过程可同时纯化样品,手性衍生化特点：,11,柱前衍生化-反相高效液相色谱法,拆分酮洛芬对映异构体,S,-(,)-酮洛芬,R,-(-)-酮洛芬,柱前衍生化-反相高效液相色谱法S-()-酮洛芬,12,酮洛芬对映体的柱前衍生化示意图,酮洛芬对映体的柱前衍生化示意图,13,酮洛芬对映体的柱前衍生化方法,酮洛芬对照品溶液(1 mg/mL)0.1 mL,加入正己烷0.6 mL,二氯亚砜溶液,0.2 mL,75,1 h,冷却至室温,吹干后加入S-NEA溶液0.2 mL,5 min,振摇,加入2.0 mol/L H,2,SO,4,0.5 mL,混匀,吹干后溶解进样,二氯甲烷:乙醚,2,:,1,酮洛芬对映体的柱前衍生化方法酮洛芬对照品溶液(1 mg/mL,14,色谱条件,色谱柱：Hypersil C,18, 5,m, 150,5.0mm ID，,流动相：乙腈水-乙酸-三乙胺(55 : 45 : 0.1 : 0.02，v/v)，,流速： 1 ml/min,检测波长：254 nm,色谱条件,15,酮洛芬对映体衍生化物色谱图,R,S,酮洛芬对映体衍生化物的保留时间为t,R,=7.3 min，t,R,=8.5 min，分离度为1.9,酮洛芬对映体衍生化物色谱图RS酮洛芬对映体衍生化物的保留时间,16,2. CSP,利用手性固定相与对映体消旋物相互作用，其中一个与手性固定相生成不稳定的短暂的对映体复合物，使两种异构体在色谱柱上的保留时间不同，从而得到分离。,2. CSP,17,常用的手性固定相：,1. Pirkle型固定相,2. 合成多聚固定相,3. 环糊精键合固定相,常用的手性固定相：,18,特点,适用范围广,制备分离方便,定量分析的可靠性高,价格昂贵,特点适用范围广,19,奈基乙脲键合硅胶柱拆分苏氨酸（A）和苯丙氨酸（B）的,p,-溴代苯甲酰胺衍生物对映体色谱图,奈基乙脲键合硅胶柱拆分苏氨酸（A）和苯丙氨酸（B）的p-溴代,20,3. CMP,将手性试剂添加到流动相中，利用手性试剂与药物消旋物中各对映体结合的稳定常数不同，以及药物与结合物在固定相上分配的差异，实现对映体的分离。,3. CMP,21,常用的手性添加剂：,1. 配基交换型手性添加剂,2. 手性离子对络合剂,3. 环糊精添加剂,常用的手性添加剂：,22,特点,可采用普通的非手性固定相,不需对样品进行衍生化,手性添加物的可变范围较宽,特点可采用普通的非手性固定相,23,五、应用1对某些手性药物进行对映体的纯度检查；2生物体液中药物对映体的分离分析研究可探索血药浓度与临床疗效的关系；3在研制手性药物过程中，可分别评价单个对映体的效价、毒性、不良反应、药动学性质；4必要时，可进行手性药物对映体的制备分离（或拆分）。,五、应用1对某些手性药物进行对映体的纯度检查；2生物,24,高效毛细管电泳,（HPCE）,高效毛细管电泳,25,HPCE是经典电泳技术与现代微柱分离相结合的一种快速、高效的液相分离技术。具有以下特点：,1. 高效,2. 高速,3. 微量,4. 低消耗,HPCE是经典电泳技术与现代微柱分离相结合的一种快速,26,高压电源,毛细管恒温系统,检测器,数据处理系统,毛细管,缓冲液/样品,缓冲液,（+）,(),毛细管电泳装置示意图,高压电源毛细管恒温系统检测器数据处理系统毛细管缓冲液/样品缓,27,（一）基本原理：,v,=,v,eo,+,v,ep,= (,eo,+,ep,),E,v,eo：,电渗流速度,eo：,电渗流淌度,v,ep：,电泳流速度,ep：,电泳流淌度,E：,电场强度,（一）基本原理：,28,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,(),(+),电渗的产生,+,29,(),(+),+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,毛细电泳中不同组分的迁移示意图,()(+)+,30,（二）主要分离模式,1. 毛细管区带电泳（CZE）,2. 胶束动电毛细管色谱（MECC）,3. 毛细管凝胶电泳（CGE）,4. 毛细管等电聚焦（CIEF）,（二）主要分离模式,31,模式,缓冲液体系,分离机理,CZE,自由缓冲液,离子淌度,MECC,胶束缓冲溶液,疏水性/离子性,相互作用,CGE,凝胶缓冲溶液,分子大小和,荷电数目,CIEF,两性电解质,等电点,模式缓冲液体系分离机理CZE自由缓冲液离子淌度MECC胶束,32,毛细管区带电泳,最基本、最广泛的分离模式。,适用于所有具有不同淌度的荷电粒子的分离，但不能中性物质及质荷比相同的组分。,毛细管区带电泳,33,2. 胶束动电毛细管色谱,用离子胶束溶液代替简单的缓冲溶液，使中性组分可按其疏水性的不同及在两相间的分配系数的不同而分离。采用手性分配相，可用于手性化合物的分离。,2. 胶束动电毛细管色谱,34,3. 毛细管凝胶电泳,凝胶的网络结构对溶质具有分子筛的作用，可分离质荷比相同但分子大小不同的组分。,在分子生物学和蛋白质化学上有着十分广泛的应用。,3. 毛细管凝胶电泳,35,4. 毛细管等电聚焦,根据蛋白质的等电点不同而进行分离。,A,A,A,A,A,A,B,B,B,B,B,B,C,C,C,C,D,D,D,D,D,E,E,E,E,E,F,F,AA,AA,BB,BB,CC,CC,DD,DD,EE,EE,FF,FF,pH梯度,高,低,4. 毛细管等电聚焦AAAAAABBBBBBCCCCDDDD,36,应用：,1. 监测药物生产过程,如：监测青霉素发酵液中有关物质的量,应用：,37,青霉素发酵液的高效毛细管电泳图,1. 青霉素G钠 ；2. 6-APA ；3. 对羟基苯乙酸 ；,4. 邻羟基苯乙酸 ；5. 苯乙酸,青霉素发酵液的高效毛细管电泳图,38,2. 中药成分分析,如：黄酮及其甙类分析,2. 中药成分分析,39,黄芩中6种黄酮类成分的,胶束电动毛细管色谱分离图,1.汉黄芩甙；2. 黄芩素；3.黄芩甙；4. 千层子素；5. 汉黄芩素；6.内标水杨酸；7.白杨素,黄芩中6种黄酮类成分的,40,3. 手性拆分,4. 体内分析,3. 手性拆分,41,质谱法及其应用,进样系统,离子源,质量分析器,检测器,控制和数据处理系统,真空系统,质谱法及其应用进样系统离子源质量分析器检测器控制和数据处理系,42,一、离子源及离子化技术,1、EI（电子轰击离子化）,V,加速电压,试样蒸汽,阴极,阳极,电子束,离子,x,y,z,电子轰击质谱示意图,一、离子源及离子化技术V加速电压试样蒸汽阴极阳极电子束离子x,43,优点：,灵敏度高，有丰富的碎片离子信息和成熟的离子开裂理论，是结构分析、鉴定的有力手段；重现性好，有标准图谱，可以通过谱库检索对未知物进行结构鉴定。,缺点：,样品须汽化后才可离子化,适用化合物：,易挥发、热稳定化合物。,优点：,44,2、CI（化学离子化）,软电离技术,优点：,可以得到较强的准分子离子峰，有利于分子量的测定,缺点：,样品须汽化后才可离子化,适用化合物：,易挥发、热稳定化合物,2、CI（化学离子化）,45,3、FAB（快原子轰击离子化） 软电离技术,优点： 样品不须汽化；既给出化合物的分子量信息，又给出结构信息。,适用范围广，仪器商品化较早，普及率高。,缺点： 重现性差，灵敏度较EI低。,适用化合物：,极性、高分子量、非挥发性及热不稳定化合物。,3、FAB（快原子轰击离子化） 软电离技术,46,+,+,+,+,+,快原子枪,样品靶,原子束,质量分析器,二次离子束,快原子轰击质谱示意图,+快原子枪样品靶原子束质量分析器二次离子束快原子轰击,47,4、MALDI（基质辅助激光解吸离子化）,软电离技术,优点：,通常只给出分子离子峰（或准分子离子峰）。,适用化合物：,蛋白质、多肽、寡核苷酸等生物大分子,4、MALDI（基质辅助激光解吸离子化）,48,5、API（大气压离子化）,软电离技术,（1）ESI（电喷雾离子化）,特点：,能够产生多电荷离子。,适用化合物：,对生物大分子及其他分子量大的化合物的分析较有利。,5、API（大气压离子化）,49,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,毛细管,+ 4kV,含离子的液滴,随液滴蒸发，电场加强，离子向表面移动,离子从表面蒸发,离子蒸发机理,+,50,（2）APCI（大气压化学离子化）,最软的电离方式之一,特点：,一般只给出化合物的分子量信息，通过源内CID（碰撞诱导分解）可同时获得结构信息。,适用化合物：,与ESI比较，更适于分析极性及分子量小（1000 amu）的化合物。,（2）APCI（大气压化学离子化）,51,反应气等离子体,Corona放电,电极,真空,样品,+,溶剂,雾化气,加热管,APCI电离原理,反应气等离子体Corona放电电极真空样品雾化气加热管APC,52,二、质量分析器及质量分离原理,1、扇型磁场质谱仪,2、四极质谱仪,3、飞行时间质谱仪,4、离子阱质谱仪,二、质量分析器及质量分离原理,53,核磁共振光谱分析法,核磁共振光谱广泛用于化合物的结构分析，而其在化合物的定量分析中的应用则是比较新的内容，日益受到重视。,核磁共振光谱分析法 核磁共振,54,1定量参数：峰面积或峰高。,2定量的特点：1）对于确定的核（质子），其信号强度与产生该信号的核（质子）的数目成正比，而与核的化学性质无关。2）利用内标法或相对比较法分析混合物中某一化合物时，物需该化合物的纯品作为对照标准。,1定量参数：峰面积或峰高。2定量的特点：1）对于确定,55,3）峰很窄，远小于各化合物之间的化学位移的差值，因而混合物中不同组分的信号之间很少发生明显的重叠。4）方法简单快速、准确、专属性高，不破坏被测样品，可选择性的测定混合药物或药物制剂中的组分乃至药物的立体异构体。,3）峰很窄，远小于各化合物之间的化学位移的差值，因而混合物中,56,3测定方法：选择一个合适的峰作为测量峰。（1）内标法（绝对测量法） 内标法为NMR定量分析最常用的方法，它与GC的内标法相似，在样品溶液中，直接加入一定量内标物质后，NMR光谱测定，将样品指定基团上的质子引起的共振峰面积进行比较，当样品与内标均经精密称重时，则样品的绝对重量（Wu）可由下式求得：,3测定方法：选择一个合适的峰作为测量峰。（1）内标法（绝,57,Wu Au Eu Au Eu,- = - - Wu = Ws- -,Ws As Es As Es,Wu,百分含量 = -100%,W,Wu Au Eu,58,（2）相对测量法 当不能获得样品的纯品或合适的内标时，可用相对测量法进行分析。操作方法与内标法相同。计算相对含量是以指定基团上一个质子引起的吸收峰面积（A1 / n1）和杂质基团上一个质子引起的吸收峰面积（A2 / n2）进行比较，按下式计算：,（2）相对测量法 当不能获得样品的纯品或合适的内标时，可用,59,A1 / n1,样品的相对含量 = - 100%,A1 A2,- + -,n1 n2,60,