流感的相关知识及实验室检测参考ppt课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,0,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/1/13,0,流感的相关知识及实验室检测,陈宪楷,2018.5.24,1,流感的相关知识及实验室检测陈宪楷2018.5.241,流感的相关知识回顾,1,流感病毒的实验室检测,2,流感病毒亚型的鉴定,3,实验室检测的相关影响因素分析,4,C,流感病毒,2,2024/8/15,流感的相关知识回顾1流感病毒的实验室检测2流感病毒亚型的鉴定,流感的相关知识回顾,1,3,2024/8/15,流感的相关知识回顾132023/8/26,流感,是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。,人类的流行性感冒病毒(influenza,简称流感），,属正粘液病毒科，分 A（甲）、 B（乙）、,C,（丙）,三型，呈,球形,或,丝状,，是一种造成人类及动物患,流行性感冒的,负链RNA,病毒。,4,2024/8/15,42023/8/26,流感病毒的基因组,RNA,与,NP,构成,RNP,基因组由8个短的单链 RNA构成，包含11个基因，编码11个蛋白：,血凝素,(HA),神经氨酸酶,(NA),核蛋白,(NP), M1, M2，NS1, NS2（ NEP：核输出蛋白），PA, PB1（聚合酶基团1), PB1-F2和 PB2。,5,2024/8/15,流感病毒的基因组RNA与NP构成RNP基因组由8个短的单链,甲型流感,致病性强,哺乳类动物,（猪，鲸鱼，马，海豹和猫）或,禽类,都会被广泛感染,容易发生突发性变异，从而引起普遍性流感，,世界性大流行,丙型流感,以散在形式出现，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流行。,乙型流感,只会感染,人类,和海豹,有限的宿主导致不会发生重大突变，呈,局限性流行,NP,（核蛋白）和,MP,基质蛋白,(M1),抗原性稳定，具有型特异性，将流感,分 A（甲）、 B（乙）、 c（丙）三型,6,2024/8/15,甲型流感致病性强丙型流感以散在形式出现，主要侵袭婴幼儿，一般,甲乙型流感主要亚型,血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原结构极易发生变异，有亚型的特异性,，,是甲型流感病毒分亚型的主要依据,甲型流感,命名通常会遵照,HN的规则,命名，H代表血凝素，可分为16个亚型；N代表神经氨酸酶，有9个亚型。会季节性在人群中出现的亚型通常为,H1，2和3，以及N1和2,根据乙型流感病毒表面,血凝素蛋白的抗原特征,主要分为,B型(Yamagata)和B型(Victoria).,7,2024/8/15,甲乙型流感主要亚型血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原结构,根据国家流感中心报道，今年监测到的流感病毒以,甲型H1N1亚型,和,乙型（Yamagata）,系为主，并且总体上甲型H1N1亚型的比例,超过,B（Yamagata）系。甲型H3N2亚型和B（Victoria）系以低水平共同流行。,我国流感流行现状及亚型,不仅在中国，在欧洲一些国家和地区，今冬流行的流感病毒优势毒株是B型（Yamagata），这一毒株沉寂已久，普通人群对它的免疫基本缺失,8,2024/8/15,我国流感流行现状及亚型不仅在中国，在欧洲一些国家和地区，今冬,图. 中国流感病毒检出率及其亚型分布,9,2024/8/15,图. 中国流感病毒检出率及其亚型分布92023/8/26,流感的季节性流行,冬春季,夏季,冬春季,长江以南,长江以北,流感病毒在我国的活动规律南北存在明显的差异,。,高峰期,10,2024/8/15,流感的季节性流行冬春季冬春季长江以南长江以北流感病毒在我国的,1.,流感患者,2.,隐性感染者,1.,近距离飞沫传播,2.,接触传播,流感的流行病学,传染源,传播途径,病毒变异快,65岁以上老年人、,婴幼儿、,慢性病患者,反复感染,并发症,11,2024/8/15,1.流感患者1.近距离飞沫传播流感的流行病学传染源传播途径病,感染流感的一般临床表现：,流感一般急性起病，主要表现为发热(可达39-40)，伴畏寒、寒战、头痛、肌肉关节酸痛、极度乏力、食欲减退等全身症状，常有咽痛、咳嗽，可有鼻塞、流涕，也可有呕吐、腹泻等症状。,一般来讲，流感全身症状比普通感冒重。流感为,自限性疾病,，发病3-4天后体温逐渐消退，全身症状好转。重症病例可导致慢性基础病加重，也可出现病毒性肺炎、心脏和神经系统损伤等并发症。,12,2024/8/15,感染流感的一般临床表现：流感一般急性起病，主要表现为发热(可,流感病毒的实验室检测,2,13,2024/8/15,流感病毒的实验室检测2132023/8/26,流感病毒的实验室检测,采集标本类型：,常规特殊,咽拭子,鼻咽,/,呼吸道吸取物,鼻拭子,鼻洗液、含漱液,血清,呼吸道灌洗液,实验前处理,流感标本采集,采集时间：病人发病的,头,3,天,内采集，最好是,24h,内,14,2024/8/15,流感病毒的实验室检测采集标本类型：实验前处理流感标本采集14,咽拭子采集,咽拭子,用灭菌棉签（最好用聚丙烯纤维头的塑料杆拭子）擦拭,双侧咽扁桃体及咽后壁,，,将棉签头部浸入含,3-4ml,采集液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。,注意：采样前,1h,内不要进食和饮水，采样液中严禁加入抗生素,15,2024/8/15,咽拭子采集咽拭子152023/8/26,标本的处理和保存,标本采集后应立即放入适当的采样液中,低温保存,，常用的采样液有：PH 7.4-7.6的Hanks液或MEM,标本应在,4,保存,24,小时内,送至实验室，实验室对收到的标本最好,24,48,小时,内进行检测或接种。,如不能在48h内检测或接种，标本应置于-70保存,16,2024/8/15,标本的处理和保存标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存，,实验室生物安全要求,01,季节性流感病毒分离鉴定在生物安全,级实验室进行。,03,用灭活的抗原进行血清学检测时可以在生物安全,级实验室进行,流感病毒分离鉴定及其它检测过程中所有能够产生感染性气溶胶的过程必须在生物安全,级实验室的生物安全柜里操作。,02,03,17,2024/8/15,实验室生物安全要求01季节性流感病毒分离鉴定在生物安全级实,常见的流感病毒实验室检测方法,18,2024/8/15,常见的流感病毒实验室检测方法182023/8/26,检测方法,灵敏度,特异性,优点,缺点,分子诊断,（,RT-PCR,）,高,高,病毒含量低的标本检出率高，耗时短,培养法,（细胞培养法、鸡胚培养法）,低,高,在分子生物学问世前，一直是流感实验室诊断的金标准，至今仍不可取代,阳性检出率低，漏检率高，耗时长，技术要求高,快速试纸条法（金标法）,较低,较高,操作简单，耗时短，不需仪器设备，适用于快速筛查,存在假阴性，漏检率高，只能鉴定出流感病毒,A,、,B,型，不能进行亚型鉴定,血清学检测,（,血凝抑制试验,）,高,高,能够鉴定亚型,要求急性期和恢复期双份血清，对于季节性流感仅限于流行病学调查及回顾性诊断,19,2024/8/15,检测方法灵敏度特异性优点缺点分子诊断高高病毒含量低的标本检出,季节性流感检测流程,临床标本采集,接种,MDCK,细胞,接种鸡胚,红细胞凝集抑制试验，鉴定病毒,红细胞凝集试验,流感病毒核酸检测阳性,PCR,鉴定,20,2024/8/15,季节性流感检测流程临床标本采集接种MDCK细胞接种鸡胚红细胞,流感病毒亚型的鉴定,3,21,2024/8/15,流感病毒亚型的鉴定3212023/8/26,红细胞凝集试验,1,红细胞凝集抑制试验,2,流感病毒亚型的鉴定,22,2024/8/15,红细胞凝集试验1红细胞凝集抑制试验2流感病毒亚型的鉴定222,流感病毒亚型的鉴定流程,红细胞凝集试验,4,个凝集单位配制“回滴”,红细胞凝集抑制试验,判定流感病毒型别,23,2024/8/15,流感病毒亚型的鉴定流程红细胞凝集试验4个凝集单位配制“回滴”,红细胞凝集试验（,HA,）,MDCK,细胞或鸡胚收获的标本分离物首先用鸡、豚鼠或人红细胞进行红细胞凝集试验（,HA,），确定病毒滴度,原理：流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白,（,HA,）含有能结合并识别红细胞表面含,唾液酸的,糖蛋白或脂蛋白结构,，许多哺乳动物和禽的红细胞表面均含有这两种成分。因此流感病毒能与其结合并识别，产生凝集现象。当血清中有,特异性抗体,与病毒血凝素结合后，可以抑制凝集现象出现,24,2024/8/15,红细胞凝集试验（HA）242023/8/26,红细胞,鸡,火鸡,豚鼠,人,O,型血红细胞,马,适用范围,流感和禽流感病毒,流感和禽流感病毒,流感病毒,流感病毒,禽流感病毒,终浓度（）,0.5,（,1%,）,0.5,（,1%,）,0.,7,5,（,1.5%,）,/0.5,（,1%,）,0.75,（,1.5%,）,/0.5,（,1%,）,0.5,（,1%,）,孔底部形状,U,或,V,型,U,或,V,型,U,型,U,型,U,型,孵育时间,30min,30min,45,min,45,min,60min,细胞对照,细胞沉积成圆点状，倾斜时细胞向下流成泪滴状,细胞沉积成圆点状，倾斜时细胞向下流成泪滴状,细胞沉积成环状,细胞沉积成环状,细胞沉积成环状,25,2024/8/15,红细胞鸡火鸡豚鼠人O型血红细胞马适用范围流感和禽流感病毒流感,A,H,B,C,D,E,F,G,100ul,病毒液,50u,l,50ul,50u,l,50u,l,50u,l,50u,l,50u,l,50u,l,50u,l,50u,l,50ul,50u,l,稀释完病毒液后加入,50ul,红细胞悬液,50ulPBS,稀释病毒,加入配制好的红细胞悬液,充分混匀，置室温孵育,30-60,分钟,观察记录结果,操作简图,26,2024/8/15,AHBCDEFG100ul病毒液50ul50ul50ul50,病毒,原液,1:2,1:128,HA:,32,HA,128,HA:4,27,2024/8/15,病毒1:21:128HA: 32HA128 HA:4272,红细胞凝集试验（,HA,）结果判读,HA,滴度,8,，进行红细胞凝集抑制（,HI,）试验；,若传,1,2,代后，,HA,滴度仍,8,者，可应用核酸检测方法进行鉴定,HA,滴度,60 岁、体温在 38.0 38.9之间，流感病毒阳性检出率高于其他组；,参考文献,李珺,，,刘亚楠,，,田国保,等,.,临床实验室流感病毒检测的相关影响因素分析,J.,国际病毒学杂志,2017,，,24,（,5,）：,331-335 ISTIC,张杰 ，武晶晶 等.不同温度和不同放置时间对总RNA提取浓度和纯度的影响,J,实验技术与管理,.2013,11,-,有文献报道：不同的放置时间和温度会影响RNA提取的质量浓度，但对RNA纯度和完整性无明显影响。,41,2024/8/15,2体温年龄标本储存温度其他因素31- 有研究发现：年龄 6,建议,关于如何提高我院流感检出率,42,2024/8/15,建议关于如何提高我院流感检出率422023/8/26,B,未检测送检标本应在,4,保存，防止,RNA,降解,C,金标法阴性的可疑流感病人，建议医生进一步选择灵敏度更高的核酸检测，以防漏检,D,对于高危人群，应在发病后尽早采样，必要时可采用多部位、多次取样检测,以提高,流感病毒阳性检出率,A,组织培训，规范取材，保证送检标本质量,43,2024/8/15,B未检测送检标本应在4保存，防止RNA降解C金标法阴性的可,THANKS,44,2024/8/15,THANKS442023/8/26,