常用临床生物化学检验技术课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Jilin medical college Department of Laboratory Medicine,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章,常用临床生物化学检验技术,临床,生化检验教研室 李 艳,.,第四章常用临床生物化学检验技术 临床生化检验教研室,1,常用临床生物化学检验技术,光谱分析技术: 最基本和最常用,电化学分析技术,电泳分析技术,层析和离心分析技术,自动化分析技术,.,常用临床生物化学检验技术光谱分析技术: 最基本和最常,2,教学目的和要求,掌握：分光光度技术的基本原理及定性和定量方法,自动生化分析仪的工作原理及参数设置,熟悉: 分光光度计的的基本结构,操作方法光源检查和波长校正,离心机相对离心力公式,了解：离心机、自动生化分析仪的类型,原子分光光度计的类型,其他光谱分析技术的基本原理及应用,.,教学目的和要求 掌握：分光光度技术的基本原理及定性和定量方,3,第一节 光谱分析技术,光谱分析技术指利用物质具有,吸收,光谱特点 发射 对物质进行定性,散射 定量,分析方法,。,定义：,利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散射光谱谱系的特征，来确定其性质、结构或含量的技术，称为,光谱分析技术,。,.,第一节 光谱分析技术 光谱分析技术指利用物质具有分析方法。,4,一、光谱分析分类,发射光谱: 火焰光度法,原子发射光谱法,荧光光谱法；,吸收光谱: 紫外分光光度法,可见光分光光度法,原子吸收分光光度法,红外光谱法；,散射光谱: 比浊法,.,一、光谱分析分类发射光谱: 火焰光度法.,5,光波于两个波峰或波谷之间的距离称为波长，其单位用纳米（nm）来表示。1nm=10,-9,m。,nm,A,.,光波于两个波峰或波谷之间的距离称为波长，其单位用纳米（nm）,6,波长 11000m 射频区,波长 0.1100cm 微波,波长 7601000nm 远红外射线,波长,400760nm,可见光,波长 200400nm 紫外光,波长 10200nm 远紫外光,波长 10,-,10nm x射线,波长 510,-3,0.14nm 射线,.,波长 11000m 射频区.,7,二、波长与颜色,不同波长光线的颜色,光的波长（nm） 颜 色 光的波长（nm）,颜 色,620 760,红 色,480 500,青 色,590 620,橙 色,430 480 蓝 色,560 590,黄 色,400 430 紫 色,500 560,绿 色,.,二、波长与颜色 不同波长光线的颜色.,8,三、互补色,把任意两种能合成白光的单色光，称为互光(或互补色)。,.,三、互补色把任意两种能合成白光的单色光，称为互光(或互补色,9,四、物质颜色与光的关系,溶液呈现不同的颜色，是由于溶液中的质点选择性地吸收某种颜色的光所引起的。,某溶液对各种颜色的透过程度相同，无色透明；,如对各种波长的光完全吸收,呈现黑色,如对各种波长光完全反射,呈灰色,若只让一部分波长的光透过，即溶液呈现是与它吸收的光完全互补的颜色。,硫酸铜溶液因吸收黄色，而呈蓝色；高锰酸钾溶液因吸收绿色，而呈紫色。,.,四、物质颜色与光的关系 溶液呈现不同的颜色，是由于溶液中的质,10,.,.,11,表3-2 物质的颜色和吸收光的颜色的关系,吸 收 光,颜 色,波 长（nm）,黄 绿,紫,400450,黄,蓝,450480,橙,青 紫,480490,红,青,490500,紫 红,绿,500560,紫,黄 绿,560580,蓝,黄,580600,青 蓝,橙,600650,青,红,650750,.,表3-2 物质的颜色和吸收光的颜色的关系吸 收,12,紫外-可见分光光度计,紫外分光光度计的波长范围：,190nm400nm,可见分光光度计的波长范围：,400nm800nm,紫外-可见分光光度计的波长范围：,200nm1000nm,.,紫外-可见分光光度计.,13,任何一种溶液，对不同波长的光的吸收程度是不相等的。,.,任何一种溶液，对不同波长的光的吸收程度是不相等的。 .,14,Lambert,-,Beer定律,当液层厚度不变时，溶液吸光度与溶液浓度成正比，称为Beer定律。,利用溶液颜色的深浅来测定溶液中物质含量的方法，称比色法。,A =KCL,A为吸光度；K吸光系数；L为溶液层厚度，称为光径；C 为溶液浓度。,.,Lambert- Beer定律当液层厚度不变时，溶液吸光度,15,.,.,16,光谱分析仪器的基本构造,.,光谱分析仪器的基本构造.,17,紫外-可见分光光度计,0.208,光源,单色器,吸收池,检测器,显示系统,.,紫外-可见分光光度计0.208光源单色器吸收池检测器显示系统,18,721分光光度计,.,721分光光度计 .,19,第三节,计算,方法,（一）计算公式,在标准溶液中：AsKsCsLs,在待测溶液中；AuKuCuLu,将两式相除可得：,.,第三节计算方法（一）计算公式 在标准溶液中：AsKsC,20,摩尔吸光系数(),根据Lambert-Beer定律，当液层厚度为cm，浓度单位为mol/L时，吸光系数,K,称为摩尔吸光系数(,),是特定波长下的吸光度值。,的意义是：是物质的特征性常数。在固定条件（入射光波长、温度等）下，特定物质的不变，这是分光光度法对物质进行定性的基础。,.,摩尔吸光系数() 根据Lambert-Beer定律，当液层,21,摩尔消光系数方法,值与入射光波长、溶液的性质等因素有关,如NADH在260nm时，,为15000,在340nm时，,为6220,.,摩尔消光系数方法 值与入射光波长、溶液的性质等因素有关.,22,2比较法(对比法),每次随同测定管制备一个标准管， 用已知浓度的标准液与待测液经相同条件处理，分别测定“标准管（S）”和“待测管（U）”的吸光度A,s,和A,u,，按下式计算待测物浓度：,.,2比较法(对比法)每次随同测定管制备一个标准管， 用已知浓,23,Cu=,AuCsLs,AsLu,AuCsVs,AsVu,A,u,A,S,C,s,V,s,1,Vu,.,Cu=AuCsLsAsLuAuCsVsAsVu,24,.,.,25,.,.,26,使用标准比较法必须遵守的条件,必须严格遵守朗伯-比尔定律,即吸光度与浓度成正比,每次测定时需要作标准管，二者同时操作所处环境的变化完全相同，误差就可以相互抵消。,标准与测定的浓度愈接近，误差就愈小。,缺点,每次需要作标准管，繁琐，浪费试剂。,结果需要计算，手续麻烦。,标准管与测定管浓度不能相差太大。,.,使用标准比较法必须遵守的条件 必须严格遵守朗伯-比尔,27,A,邻甲苯胺法测血糖，操作方法见下表,加入物（ml）,测定管（U）,标准管（S）,空白管（B）,血清,G标准液(5mmol/L,蒸馏水,邻甲苯胺,0.1,5.0,0.1,5.0,0.1,5.0,混匀 ,置沸水中,加热煮沸12min, 取出冷却,630nm比色,“B”管调“0”,测吸光度,A,0.3,0.2,0,.,A邻甲苯胺法测血糖，操作方法见下表加入物（ml）测定管（,28,计算：,.,计算： .,29,2标准曲线法,根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范围内与吸光度成正比关系。,配制一系列浓度的标准品溶液（浓度应包含高、中、低浓度范围），按标本处理方法作相同处理，在特定波长下测定吸光度，以标准液浓度为横座标,适用 反应结果比较恒定,标准溶液不易保存的情况下,.,2标准曲线法根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在,30,方法,一般至少选5个等间距浓度。,浓度范围在样品待测物浓度的l/22倍之间，,吸光度范围在0.051.0之间较为合适。,按规定条件与样品作同样处理，在特定波长(一般选择max)下测定它们的吸光度。,横坐标表示标准液浓度，纵坐标表示吸光度，若符合Beer定律，则各对应点可连成一直线并通过原点。如此绘出的曲线称为标准曲线,.,方法 .,31,在测得待测样品的吸光度后即可在标准曲线上查出待测物浓度。,.,在测得待测样品的吸光度后即可在标准曲线上查出待测物浓度。.,32,.,.,33,注意事项,标准曲线不宜长期应用,试剂纯度应足够高，溶液浓度应配制准确；,应重复测定35次，每次设置平行管，以保证良好的重复性；,坐标比例应适当选择，使绘出的直线与横坐标的夹角在45,o,左右。,标准曲线分类,标准曲线的拟合法可分为目测法和计算法两种。,.,注意事项标准曲线不宜长期应用.,34,标准曲线制备,比例的选择,最好是方块的即长与宽相等或纵：横=2:3。,一般是2525cm,2,或用纵:横=2:3，如2030cm,2,比例坐标纸，,浓度全距占多少格，A的全距也应占多少格,空白A等于0，则绘出的曲线通过原点，成45,o,角的直线，若曲线大于或小于45,o,都不能准确,.,标准曲线制备比例的选择 .,35,样品浓度的选择,一般包括待测样品的可能变异的最高值与最低值。例如血LDH比色法测定，正常波动范围在190437金氏单位，疾病时可能低至190金氏单位，高至750金氏单位，所以标准曲线浓度应从1251000金氏单位,一般原则是5种不同浓度，要求较高的一般选择67种。,浓度差距一般是等距或浓度差距相似，但应同时考虑样品浓度较集中的一段，差距可以小一些，如LDH可选择125、250、500、750、1000金氏单位。,.,样品浓度的选择一般包括待测样品的可能变异的最高值与最低值。,36,选点,例如金氏法测血LDH,试 管 B 1 2 3 4 5,金氏单位,0 125 250 500 750 1000,吸光度（A） 0,0.1 0.2,0.3,0.4 0.5,首先，确定浓度位置，因浓度一般是成倍增加，或者等级增加，容易确定。假设横轴（x）有效长度采用250格(25小格)则其位置为：,.,选点例如金氏法测血LDH.,37,金氏单位 0 125 250 500 750 1000,横坐标位置 0 50格 100格 150格 200格 250格,那么纵坐标的有效长度也应取250格，可以先把最高吸光度（A）定出位置。,A 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0,纵坐标位置 (格) 250 200 150 100 50,0,也可由以下两种方法确定：一种是求出1格相当于多少A,去除以欲确定的A,0.5/250 = 0.002 1格相当于,0.002A,0.4/0.002 = 200格,.,金氏单位 0 125 250,38,另一种,是求出0.01A相当多少格,去乘以欲确定位置的A，0.5:250 = 0.01:x,即0.01相当于5格。 ( 0.3/0.01 )5 = 150格0.3A相当于150格,浓度位置向右延伸,A位置向上延长，交点即为此座标点,若不能连成一条直线，有两个处理原则：, 通过原点，尽可能使直线通过更多的点, 若有两点不在一条直线上，则使直线从两点中间通过，不应使两点位于线段的一边,.,另一种是求出0.01A相当多少格,去乘以欲确定位置的A，0.,39,.,.,40,.,.,41,(6)标准曲线分类,分为目测法和计算法两种。,直视法,计算法 标准曲线为直线时，直线回归方程式表示：,直线回归分析是找出描述两个变量间关系的直线方程，以确定,一条最接近于各点的直线，使各点与该直线纵向距离平方和为最小。,这种方程式为直线回归方程，这条直线为回归直线。,.,(6)标准曲线分类分为目测法和计算法两种。,42,x为溶液中物质单位;,Y为推算吸光度估计值，是个变量；,a是截距；,b是回归系数，即斜率。,当x变动一个单位时，平均变动b个 单位，所以工作曲线的灵敏度由b决定,。,.,x为溶液中物质单位; .,43,直线回归分析的任务是找出描述两个变量间关系的直线方程，以确定一条最接近于各点的直线，使各点与该直线纵向距离平方和为最小。这种方程式为直线回归方程，这条直线为回归直线。,.,直线回归分析的任务是找出描述两个变量间关系的直线方程，以确定,44,回归方程所代表的直线在坐标平面上画出来，只须知道两点坐标就行。,这两点不宜离得太近，一般取一最小值和最大值的两点，将这两点连接成一直线，其余各点均散布在两旁,标准曲线适用的范围应只限于x值的实测范围以内，当测得待测样品的吸光度后，便可很快从此曲线查出其浓度值(图3-6)。,.,回归方程所代表的直线在坐标平面上画出来，只须知道两点坐标就行,45,公式及计算,只要算出斜率b和截距a即可求得直线回归方程,.,公式及计算只要算出斜率b和截距a即可求得直线回归方程 .,46,例如 赖氏法制备血清ALT标准曲线 。,编号,X,Y,X,2,XY,1,100,0.10,10000,10,2,200,0.18,40000,36,3,300,0.27,90000,81,4,400,0.35,160000,140,5,500,0.42,250000,210,合计,1500,1.32,550000,477,平均,300,0.264,X为ALT单位,Y为吸光度,.,例如 赖氏法制备血清ALT标准曲线 。XYX2XY1100,47,a=0.021,表示空白读数。,b=0.00081,表示本法的灵敏度。,即ALT变化一个单位时，吸光度A变化,0.00081,.,a=0.021表示空白读数。.,48,例题,测得未知血清中ALT的吸光度为0.050，根据回归方程式计算得：,此标本血清ALT为35.8单位，也可从回归曲线上查找。,.,例题此标本血清ALT为35.8单位，也可从回归曲线上查找。.,49,绘制回归曲线：选择两点，一般选择相距较远而在坐标纸上容易找到的两个点，如：,连接两点（100，0.102），(500，0.426)的一条直线即为回归线，此线向下延伸与Y轴相交一点，此点到原点之间的距离为截距a.,.,绘制回归曲线：选择两点，一般选择相距较远而在坐标纸上容易找,50,.,.,51,若测得一个未知血清ALT的A为0.3，求出ALT的浓度。,或在标准曲线求出ALT为344.4单位,。,.,若测得一个未知血清ALT的A为0.3，求出ALT的浓度。或在,52,3因数法,先配制出一系列浓度不同的标准溶液，分别测定其A，然后各自以其A除以浓度，得出单位浓度下的吸光度值。,测定条件不变时，此数是个常数(实际上就是吸收系数，但没有严格的条件要求，其数值还不能作为定性分析依据)；用K表示。然后求出K的平均值，此数的倒数值就是欲求的“计算因数”。被测试样的吸光度值一旦测得，乘上这个因数，得出试样的测定结果。,.,3因数法先配制出一系列浓度不同的标准溶液，分别测定其A，然,53,例：用双缩脲法测定血清蛋白质，先配制成已知浓度的蛋白质标准溶液：2g/dl，4g/dl, 6g/dl，8g/dl，10g/dl五种浓度。按该方法的测定程序，分别测出它们的吸光度，计算出因数值。,双缩脲法测定血清蛋白质,蛋白质标准液浓度,（g/L）,2 0.054 0.0270,4 0.108 0.0270,6 0.159 0.0265,8 0.214 0.0267,10 0.267 0.0267,.,例：用双缩脲法测定血清蛋白质，先配制成已知浓度的蛋白质标准,54,有一患者血清，用双缩脲法测得其吸光度A0.187，则该患者血清蛋白质含量为： 0.18737.4537g/dl=70g/L,该方法优点是计算简练, 查找测定结果十分方便.,缺点是因不绘制曲线，对于脱离光吸收定律的浓度范围不易直接观察到，对一定浓度的测定结果,可能有误差,。,.,有一患者血清，用双缩脲法测得其吸光度A0.187，则该患,55,3其它分析方法,差示法、多组份混合物分析和利用摩尔吸光系数分析等方法。,.,3其它分析方法差示法、多组份混合物分析和利用摩尔吸光系数分,56,小结,比色分析法定量计算。,波长的选择。,光谱检验技术分类的依据。,分光光度计的检测原理。,.,小结比色分析法定量计算。.,57,第二节 离心技术,.,第二节 离心技术.,58,一、离心技术,离心技术是现代生物学、遗传学、医学、检验学、化学、制药、食品工业节领域中不可缺少的分离纯化、分析手段。,1926年Svedberg试制了世界上策一台超速离心机,1940年Svedberg与Pederson总结了在此之前20年的研究成果，出版了超速离心一书,.,一、离心技术离心技术是现代生物学、遗传学、医学、检验学、化,59,离心技术,离心机是利用物质的高速旋转时产生强大的离心力，使置于该旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离的目的。,.,离心技术离心机是利用物质的高速旋转时产生强大的离心力，使置,60,一、离心机的种类,1离心速度,低速离心机 低于6 000 r/min以下,高速离心机 转速为10 00025 000 r/min,超速离心机转速超过30000 r/min。,.,一、离心机的种类1离心速度.,61,一、离心机的分类,2应用范围,制备型离心机 最大转速和最大相对离心力分为3 类：,普通离心机 转速6000rpm,最大RCF可达6000g,高速离心机 2.5万rpm , 最大RCF可达8.9万g,超速离心机 万8.5万rpm , 最大RCF可达51万g,常用于分离亚细胞结构。,分析型超速离心机 最大转速可7万rpm , 最大RCF可达50万g,水平式,角式,酶和蛋白质,.,一、离心机的分类2应用范围水平式酶和蛋白质.,62,二、 离心分离的原理,悬浮在某种特殊的液体介质中的生物样品，如细胞、细胞器、病毒和生物大分子等都称为颗粒。,每个颗粒都有一定的大小、形状、密度和质量。,当盛有颗粒悬浮浓的离心管放置在离心机转子内而高速旋转时,颗粒沉降的速度和时间主要取决于离心力、浮力和介质的摩擦力。,.,二、 离心分离的原理悬浮在某种特殊的液体介质中的生物样品，如,63,离心力,：颗粒沿圆周运动受到一个向外的拉力,离心力的大小等于离心加速度与颗粒质量的乘积。,重力,：颗粒在重力场中仍旧受到重力的作用,是颗粒重力与重力加速度的乘积。,摩擦力：,颗粒在介质中移动与介质分于间的摩擦阻力；,浮力,：是指被物体所排开的周围介质的重量。颗粒的浮力与离心力方向相反，为颗粒排开介质的质量与离心加速度的乘积。,二、 离心分离的原理,.,离心力：颗粒沿圆周运动受到一个向外的拉力,离心力的大小等于离,64,在离心场中，作用于颗粒上的力主要有离心力、浮力和摩擦阻力。,离心转子从静止状态加速旋转时，悬浮状态的颗粒密度大于周围介质的密度，则颗粒离开轴心方向移动，即发生沉降；,如果颗粒密度低于周围介质的密度，则颗粒朝向轴心方向移动，即发生漂浮。,.,在离心场中，作用于颗粒上的力主要有离心力、浮力和摩擦阻力。.,65,.,.,66,二、 离心分离的原理,.,二、 离心分离的原理.,67,.,.,68,二、 离心分离的原理,离心力作用沉降一物质绕一旋转中心作圆周运动时，受到一个向外的离心力,如果该物质与旋转中心没有稳固的牵系，就会沿着运动的切线方向向外离去。,以同一速度作圆周运动的不同质量物质，受到的离心力不同，向外离去的速度也不同。,离心机就是根据此原理而设计制造的。,.,二、 离心分离的原理离心力作用沉降一物质绕一旋转中心作圆周运,69,当离心机运转时，物质随之转动的角速度为，为保持物质匀速圆周运动，必须有一足够大的向心力来维持。根据牛顿定律，物质所受的向心力为,Fmavr,2,式中m为小球的质量,m=v, ar,2,v为物体体积,为溶液密度，r为运动半径，为角速度。,.,当离心机运转时，物质随之转动的角速度为，为保持物质匀速圆,70,二、 离心分离的原理,在离心加速度不变的情况下，颗粒的沉降速度主要决定于颗粒的直径大小和颗粒的形状，而颗粒的密度所起作用较小。,.,二、 离心分离的原理在离心加速度不变的情况下，颗粒的沉降速度,71,沉降系数,：颗粒在单位离心力场作用下的沉降速度，用s表示。,沉降系数的单位以1,10,-13,s=1Svedberg单位，以1S表示。,例如蛋白质的沉降系数为4.5S即4.5,10,-13,s，IgG为7S即7,10,-13,s等等。沉降系数的物理意义又是颗粒在离心力作用下从静止状态到达极限速度所经过的时间。,.,沉降系数：颗粒在单位离心力场作用下的沉降速度，用s表示。.,72,三、相对离心力（RCF）,RCF ：,为一个重量单位时的离心力,即作圆周运动的物质受的离心力与其重量之比。,RCF,(g) = 1.118,10,-5,x,(,rpm,),2,x 为离心机转子的半径，以cm为单位,rpm为离心机转速。,.,三、相对离心力（RCF）.,73,RCF与RPM换算, = 2 RPM/60 = 0.10472 RPM,RCF= r,2,/g=（,0.10472 RPM,）2r/g,r以毫米为单位时，,RCF=1.12r（RPM/1000）,2,RPM=1000（RCF/1.12r）,1/2,例：文献给出条件为80000g，,RPM=1000（80000/1.12r）,1/2,.,RCF与RPM换算 = 2 RPM/60 = 0.10,74,冷冻离心机构造图,.,冷冻离心机构造图.,75,左上：普通台式离心机。 左下：冷冻台式离心机。右：超速离心机。,.,左上：普通台式离心机。 左下：冷冻台式离心机。右：超速,76,J-30I,高速冷冻离心机,.,J-30I高速冷冻离心机.,77,用 途,1.,细菌，蛋白沉淀 - 核酸提取 - 细胞/亚细胞组份分离。,2. 动、植物病毒分离、血液血清提取及溶液中大、小颗粒不同组份的分离。,、,.,用 途1. 细菌，蛋白沉淀 - 核酸提取 - 细胞/亚细胞组,78,四、离心转子,固定角度转子,水平转子,垂直转子,区带转子,低速离心一般使用玻璃管，抗化学药品的性能极好，但一般较脆，不能承受3 000g以上的离心力。,聚丙烯和聚乙烯的共聚物制成的塑料管主要用于高速离心。它比玻璃管能承受较高的离心力，同时可以高温消毒，耐酸耐碱耐盐和抗化学药品。,.,四、离心转子.,79,左图：不同离心机的不同转头,右图：超速离心机的不同转头,.,左图：不同离心机的不同转头.,80,五、离心方法,主要有三大类型：,差速离心,密度梯度离心,沉降平衡离心。,.,五、离心方法.,81,五、离心方法,1差速离心法,通过逐步增加相对离心力，使一个非均相混合液内形状不同的大小颗粒分步沉淀。,.,五、离心方法1差速离心法.,82,五、离心方法,2密度梯度离心法,。,离心前，离心管内先装入分离介质（如蔗糖、甘油等），使形成连续的或不连续的密度梯度介质，然后加入样品进行离心，分为：,速度区带离心法。,预制梯度等密度离心法。,自成梯度等密度离心法。,.,五、离心方法2密度梯度离心法。.,83,五、离心方法,（1）速度区带离心法。,离心前，离心管内先装入蔗糖、Percoll等密度梯度介质,待分离样品铺在梯度液的顶部，同梯度液一起离心,利用各颗粒在梯度液中沉降速度或漂浮速度的不同，使具有不同沉降速度的颗粒处于不同密度的梯度层内，达到彼此分离的目的。,本法可分离各种细胞、病毒、染色体、脂蛋白、DNA和RNA等生物样品。,.,五、离心方法（1）速度区带离心法。.,84,（ 2）预制梯度等密度离心法,离心前预先配制管底浓而管顶稀的密度梯度介质，,介质有蔗糖、CsCl、Cs,2,SO,4,等,样品一般铺在梯度液顶上，如需挟在梯度液中间或管底部，则需调节样品液密度。离心后,不同密度的样品颗粒到达与自身密度相等的梯度层，即达到等密度的位置而获得分离。,.,（ 2）预制梯度等密度离心法离心前预先配制管底浓而管顶稀的密,85,（3）自成梯度等密度离心法,某些密度介质经过离心后会自成梯度，例Percoll，可迅速形成梯度。,样品可和梯度介质先均匀混合，离心开始后，梯度介质由于离心力的作用逐渐形成管底浓而管顶稀的密度梯度，,带动原来混合的样品颗粒也发生重新分布，到达与其自身密度相等的梯度层里，即达到等密度的位置而获得分离。,.,（3）自成梯度等密度离心法某些密度介质经过离心后会自成梯度，,86,3沉降平衡离心法,根据被分离物质的浮力密度差别进行分离,所用的介质起始密度约等于被分离物质的密度,介质在离心过程中形成密度梯度,被分离物质沉降或上浮到达与之密度相等的介质区域中停留并形成区带。,.,3沉降平衡离心法根据被分离物质的浮力密度差别进行分离.,87,.,.,88,.,.,89,六、离心事故,离心机转头损坏的原因,（操作或使用不当所造成的）,过速,腐蚀,金属疲劳,不平衡,.,六、离心事故离心机转头损坏的原因.,90,第三节 层析技术,(chromatography technology),又称色谱技术、色层分离技术。,.,第三节 层析技术(chromatography tech,91,第三节 层析技术,气相色谱(gas chromatography，GC),高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC),薄层层析(thin layer chromatography，TLC),薄膜层析(thin memberane chromatography),亲和层析(affinity chromatography),凝胶层析(gel chromatography),离子色谱,超临界流体色谱,色谱-质谱联用,色谱-红外光谱联用,.,第三节 层析技术气相色谱(gas chromatograp,92,一、层析的概念与分类,（一）基本概念,层析法,是利用混合物中各组份的理化性质（吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等）的差异，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相，从而以不同速度移动而分离。,.,一、层析的概念与分类（一）基本概念.,93,（二）层析法分类,1按固定相和流动相所处的状态分类,分为液相层析法和气相层析法两大类。,2按层析分离机制分类,吸附层析法,分配层析,离子交换层析,凝胶层析,亲和层析,.,（二）层析法分类1按固定相和流动相所处的状态分类 .,94,3按操作形式不同分类,柱层析,薄层层析,纸层析,薄膜层析,.,3按操作形式不同分类.,95,二、高效液相层析法,(High Performance Liqiud Chromatography; HPLC),高效液相层析法是用特制微粒（10um）充填的层析柱作为固定相，通过高压使液体流动相快速通过层析柱而达到快速有效分离液相中各种物质的层析技术。,.,二、高效液相层析法(High Performance Li,96,HPLC,分离效果好、分析速度快，检测灵敏度高等特点。,蛋白质、糖类、核酸、氨基酸、生物碱、类固醇和类脂等大分子以及高分子聚合物度能用HPLC测定。,.,HPLC分离效果好、分析速度快，检测灵敏度高等特点。.,97,输液系统、进样分离系统、检测系统和数据处理系统等部分组成。,流动相用一高压泵输入，由于流动相液体中常溶有微量气体，脱去其中气体是很有必要的。,HPLC,.,输液系统、进样分离系统、检测系统和数据处理系统等部分组成。H,98,进样可以是注射器进样，也可以是进样阀进样。,HPLC使用的检测器最多应用的是紫外或紫外-可见分光检测器、荧光检测器、示差检测器和电化学检测器等。,.,进样可以是注射器进样，也可以是进样阀进样。.,99,1.,液固吸附层析法,：,在色谱柱中填充固体吸附剂。,待测组分通过色谱柱时，不断地被吸附剂吸附和被流动相解吸附。,基于不同组分被吸附和被解吸附的行为差异，从而达到分离的目的。,、常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、弗罗里硅土、分子晒等。,.,1. 液固吸附层析法：.,100,2.,液液分配层析法,：系在固体填充颗粒上涂上一层薄薄的固定液，待测组分在固定相和流动相之间进行连续的分配萃取，由于其在两相间的分配系数不同而达到分离目的。,.,2. 液液分配层析法：系在固体填充颗粒上涂上一层薄薄的固定,101,3. 离子交换层析法,在色谱柱中填充离子交换树脂。带电离子随流动相经色谱柱时，与带有异性电荷的树脂有一定的亲和力而得以适当保留。,由于各种离子与树脂的亲和力不同，其保留行为也不同，从而得以分离。,.,3. 离子交换层析法.,102,高效液相层析法是目前最好的血药浓度监测方法，,每次只能测定一种药物，至多只能测定一类药物，无法测定性质不同的药物。,高效液相层析法用于常规血药浓度监测，只适用于少量、常用的某些特定药物，大大限制了它的推广应用。,.,高效液相层析法是目前最好的血药浓度监测方法，.,103,第四节临床生化自动化分析,李艳,.,第四节临床生化自动化分析李艳.,104,教学目标和要求,掌握：,自动生化分析仪的分析方法类型及其 特点，连续监测法的理论K值，必选的分析参数。,熟悉：,分立式自动生化分析仪的基本结构，分析参数，影响分析仪分析速度的因素和分析仪性能指标。,了解：,某些分析参数的特殊意义，分析仪的工作过程和操作方法，干片式分析仪的结构和分析原理，常用分析仪的分析性能。,.,教学目标和要求.,105,自动生化分析仪,由电脑控制，将生化分析中的取样(sampling)、加试剂、混匀、保温反应、检测(detect)、结果计算、可靠性判断、显示和打印、以及清洗(cleaning)等步骤组合在一起自动进行操作的分析仪器。,.,自动生化分析仪由电脑控制，将生化分析中的取样(sam,106,自动生化分析技术的应用,提高了临床生化检验质量和速度；,减轻检验人员的劳动强度；,节约样品和试剂；,增加检验项目；,提高检测精密度，减少实验误差；,并且有利于临床检验标准化的实现,。,.,自动生化分析技术的应用.,107,自动生化分析仪按其工作方式不同分为,连续流动式,(continuousstreaming movementstyle)或管道式：已很少用,离心式,(centrifugation style) ：已很少用,分立式,(discretestyle)：应用最广泛,干片式,(drying style) ：急诊多用,.,自动生化分析仪按其工作方式不同分为连续流动式(continu,108,一、 分立式自动生化分析仪的结构,完全,模仿手工操作,方式设计，各部分结构对应手工操作的每个步骤包括取样、加试剂、混匀、孵育、检测、结果计算、器材清洗等 。,.,一、 分立式自动生化分析仪的结构 完全模仿手工操作方,109,一、基本结构,（一）样品盘或样品架,样品盘,（specimen disc）：放置待测样品的转盘，可放置一定数量的,样品杯（specimen cup）,或不同规格的,采血试管,，,通过样品盘的转动来控制,不同样品的进样。,.,一、基本结构 （一）样品盘或样品架 .,110,样品架,（specimen stock）：每个样品架可放数只样品杯或采血试管（多为5只或10只）。样品架的移动通过,样品传送带,来进行。样品架 上 的,条形码,（barcode）或编,码孔可识别样品,架,号,及样品,位置号,。,.,样品架（specimen stock）：每个样品架可,111,样品架的优点,随着样品架移动及样品的被检测，可不断追加已放置样品杯或采血试管的样品架；,通过样品架的,移动能将样品传,送到另一个,分析,模块,（analysis,die-block）甚至,另一台分析仪上,再进行分析。,.,样品架的优点随着样品架移动及样品的被检测，可不断追加已放置,112,（二）试剂室和试剂瓶,转盘式试剂室,（reagent chamber）：内装放置试剂瓶的转盘，一般可放置20种以上具有一定形状的塑料试剂瓶，大型分析仪可放置3045种试剂瓶。,试剂瓶容量一,般为10100ml。,通过试剂转盘的,转动来选用不同,试剂。,.,（二）试剂室和试剂瓶 转盘式试剂室（reagent,113,试剂架式试剂室,：可放置容量为250ml500ml的任意形状的试剂瓶，试剂瓶不能转动，但每个试剂瓶内引出一条,试剂管路,及其喷嘴，即每种试剂均有专用的加试剂装置，因而不同试剂间无,交叉污染,。,但试剂管路较长使试剂存在一定的死体积，因而适宜用于使用频率高、消耗试剂量大的检测项目。,.,试剂架式试剂室：可放置容量为250ml500ml的,114,大型分析仪同时备有,第一试剂室,和,第二试剂室,，即具备对同一检测项目添加两次试剂的功能，个别分析仪还具有加入第三试剂的功能。,对有条形码装置的仪器可将带条形码的试剂瓶放在试剂室转盘,上的任意位置，仪,器能自动识别试剂,的种类、批号和有,效期。试剂室均具,有,冷藏装置,，可将,试剂保存在410。,.,大型分析仪同时备有第一试剂室和第二试剂室，即具备对同,115,（三）反应杯和反应盘,反应杯,（reaction cup）是样品与试剂进行化学反应的场所，同时用作比色杯。由透光特性好的硬塑料或石英玻璃制成。比色杯光径不同分析仪有0.50.7厘米不等，大多数分析仪在计算时将其折算为1厘米光径。,.,（三）反应杯和反应盘 反应杯（reaction cu,116,反应盘,（reaction disc）：100只或更多的反应杯围成一圈组成。在测定过程中反应盘作恒速的圆周运动，在静止时向反应杯中加入样品、试剂或进行搅拌混匀，当反应盘恒速圆周运动经过检测窗口的比色杯可进行吸光度检测。,.,反应盘（reaction disc）：100只或更多,117,（四）取样和加试剂装置,1,取样装置,（sampling assembly）：,由取样针、取样臂、取样管路、取样注射器和阀门组成，能定量,吸取样品并加入到反,应杯。,不同分析仪的取样,容量有不同的范围，,一般为235l，步,进0.1微升不等。,.,（四）取样和加试剂装置 1取样装置（sampling a,118,取样针设有电子,液面感应器,，取样针于样品上方下降，一旦接触到样品液面即停止下降而开始吸样。适用于不同的采血试管上机测定,.,取样针设有电子液面感应器，取样针于样品上方下降，一旦,119,多数加样装置设有,防撞功能,，遇到阻碍时取样针立即停止运动并报警。某些取样针还设有,阻塞报警功能,，当取样针被样品中的凝块、纤维蛋白等物质阻塞时，机器会自动报警、冲洗取样针，并跳过当前样品，进行下一个样品的取样检测,。,.,多数加样装置设有防撞功能，遇到阻碍时取样针立即停,120,取样针防交叉污染（,crossing,contamination,）措施,绝大多数采用,水洗方式,（又有瀑布式和涌泉式之分），在吸取另一个样品前对接触样品的样品针内外壁进行冲洗；,也有采用,化学惰性液,（chemical inertiafluid）膜的方式来隔绝样品与取样针内外壁之间的接触。,.,取样针防交叉污染（crossing contaminati,121,2加试剂装置,加试剂装置用于定量吸取试剂加入反应杯，可加入试剂容量一般为20350l。步进15微升不等，取样精度在1微升左右。,注射器方式,：组成部件与取样装置类似，其液面感应系统能检测并提示,试剂剩余量,。,灌注式,：具有许多条试剂管路及其喷嘴，每种试剂单独使用一条试剂管路和喷嘴，不存在各试剂间的交叉污染。,.,2加试剂装置 加试剂装置用于定量吸取试剂加入反应杯，可,122,大型自动生化仪多具有两组加试剂装置，可分别从两个试剂室吸取同一个检测项目的,第一试剂,和,第二试剂,，大多数分析仪所有检测项目加入第二试剂的时间点统一固定为1个或2个点，也有分析仪有3个加入时间点可供选择。,.,大型自动生化仪多具有两组加试剂装置，可分别从两个试剂,123,（五）,混匀与,搅拌装置,反应杯里的样品与试剂通过,搅拌棒,搅拌而充分混匀，搅拌棒的形状为扁平棒状或扁平螺旋状，表面的疏水材料能防止反应液被搅拌棒所携带。其工作方式大多为,旋转式搅拌,，也有,震动式搅拌,方式。也设置了防止搅拌棒在不同反应液之间携带交叉污染的清洗措施。,.,（五）混匀与搅拌装置 反应杯里的样品与试剂通过搅拌棒搅,124,（六）温控和定时系统,温控系统,使反应杯浸浴在恒温环境：,恒温,循环水浴方式,：温度传递速度快，保养要求较高。,恒温,空气浴方式,：温度传递速度不如恒温水浴循环方式，保养简单。,温度控制器能使循环水或循环空气的温度控制在规定温度0.1。规定温度可有37和30两种选择，一般固定在37。,.,（六）温控和定时系统 温控系统使反应杯浸浴在恒温环境：,125,定时系统,：,不同分析仪对检测吸光度的,间隔时间,有不同的规定，,反应时间,应该设定为此间隔时间的倍数。总反应时间一般限制在8.5-10min内，个别分析仪可以设定为15或22min等。,.,定时系统：.,126,（七）光路和检测系统,自动生化分析仪以,紫外可见分光光度法,为其中心和主要的检测手段，与一般分光光度计一样，其光路和检测系统由,光源,、,单色器,和,检测器,组成。,.,（七）光路和检测系统 自动生化分析仪以紫外可见分光光,127,1光源（,light source,）,一般为,卤素钨丝灯,（halogentungsten filamentlamp），也有采用长寿命的,氙灯,（xe lamp），要求在340800nm波长范围内能发射出稳定且较平坦的光能。,.,1光源（light source） 一般为卤素钨丝灯,128,2单色器（,monochromato,）,干涉滤光片,（interference filter）分光系统：常带有340、380、405、500、550、600、660nm等几种滤光片，各滤光片固定在转盘上，以,转盘旋转的方式来选择波长,。这种分光系统在半自动和小型自动分析仪中常用，且不能同一时刻进行多波长检测。,光栅,（raster）分光系统：常在340（或293）800nm范围内选择1013种固定的单色光。,.,2单色器（monochromato） 干涉滤光片（i,129,前分光和后分光方式,光栅分光有前分光和后分光两种方式，光源首先经过单色器分光，然后透射到比色溶液的方式为,前分光,。目前以后分光方式为多见，其优点是单色器中没有转动部分，双波长在同一时刻检测，因而提高了检测的精度和速度。,.,前分光和后分光方式 光栅分光有前分光和后分光两种方式，,130,光源先透过比色杯中的反应液再照射到光栅上，经色散后所有固定单色光同时通过各自的光纤传输到对应的检测器，微处理器按该分析项目的分析参数，,后分光方式,选择其中一个或两个波长（双波长方式）的吸光度值，用于分析结果的计算。,.,光源先透过比色杯中的反应液再照射到光栅上，经色散后所,131,3检测器（,detector,）,由光敏二极管及放大电路组成，可按设定的间隔时间连续测定各反应杯的吸光度值。,.,3检测器（detector） 由光敏二极管及放大电路组成,132,（八）数据处理系统,具有多种数据处理功能。,计算测定结果,判断结果准确性,保存各种数据,自我诊断功能,.,（八）数据处理系统 具有多种数据处理功能。 .,133,（九）清洗系统,反应杯,清洗装置,：一个反应杯内的反应和检测结束后，该反应杯就被冲洗系统及时冲洗。,清洗过程：由废液针吸取反应杯内废液，加入,清洗剂,（detergent）冲洗并抽干后，再经数次去离子水冲洗及抽干，然后做,杯空白,的吸光度检查，若通过检查则此反应杯可继续循环使用；更高级的仪器带有风干技术。如果不能通过，分析仪将提示该反应杯异常，并跳过此反应杯使用下一个反应杯，或提示更换反应杯。,.,（九）清洗系统 反应杯清洗装置：一个反应杯内的反应和,134,样品针、试剂针和搅拌棒清洗,一般在用于下一个样品、试剂或反应杯前即清洗一次，此时多数为去离子水冲洗，在一批检测完成后，则自动进行清洗剂清洗。,清洗剂可配有1至3种可供选择，除一种常规清洗剂外，其它1至2种可按设定对试剂针、样品针或反应杯进行补充清洗。,.,样品针、试剂针和搅拌棒清洗 一般在用于下一个样品、,135,二、组合式自动分析仪,（一）,组合式自动生化分析仪,将相同或不同的两台或两台以上的分析部分，即,分析模块,进行组合连接，采用样品架方式使样品通过传输线在不同分析模块间进行传递并检测。各分析模块所分析项目的组合提高了分析效率，这些分析模块除了基于紫外-可见光谱分析原理的分析模块外，还有基于,离子选择电极,的电解质分析模块，甚至还可组合建立在,免疫发光,分析原理的免疫分析模块。,.,二、组合式自动分析仪 （一）组合式自动生化分析仪.,136,组合式分析仪,.,组合式分析仪.,137,（二）实验室自动化系统,（,laboratory automation system,，,LAS,）,包括,样品前处理系统,、,样品输送系统,和,各样品分析系统,。不同功能的各模块以同一标准来连接，通过计算机控制运行。随着检测样品量的增加，只需添加需要的新模块，将其安装连接，即可扩大处理能力。这样可避免同类硬件和功能的重复投资，节省占地面积所需的基础投入。当一模块发生故障时，其余模块仍在运行，在24小时内任意时间对模块进行交替保养维护，不影响日常工作。,.,（二）实验室自动化系统 （laboratory autom,138,样品前处理系统,能独立工作，由样品投入部、离心分离部、开栓部、在线分注部、非在线分注部、贴条码部、盖栓部、样品分注收存部、样品接收部等模块构成前处理系统，每一模块既是系统的部分，又是独立的单元，可根据不同需要选择使用，具有灵活性和扩展性。,也可通过样品输送部分与样品分析系统连接，组成类似工业领域的生产流水线，从而实现了从采血到报告的实验室的全自动化。,.,样品前处理系统 能独立工作，由样品投入部、离心分离部、,139,第二节 生化自动化分析方法概要,一、分析方法分类,（一）,终点法,（end assay）,被测物质在反应过程中完全被转变为产物，到达反应终点，根据终点吸光度的大小求出被测物浓度，称为终点法。该法称为平衡法更为恰当。从,时间-吸光度曲线,来看，到达反应终点或平衡点时，吸光度将不再变化。终点法参数设置简单，反应时间一般较长，精密度较好。,.,第二节 生化自动化分析方法概要 一、分析方法分类.,140,终点时间的确定,根据时间-吸光度曲线来确定，,根据被测物反应终点，结合干扰物的反应情况来确定。,.,终点时间的确定根据时间-吸光度曲线来确定，.,141,1,一点终点法,（one point end assay）,在反应到达终点，即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值，用于计算结果。,结果计算公式：待测物浓度C,U,=（待测吸光度A,U,试剂空白吸光度A,B,）K,K为校准系数,.,1一点终点法（one point end assay）,142,图,4-3,一点终点法反应曲线,A,单试剂一点终点法,B,双试剂一点终点法,.,图4-3一点终点法反应曲线 A单试剂一点终点法,143,2,两点终点法,（two point end assay）,在被测物反应或指示反应尚未开始时，选择第一个吸光度，在反应到达终点或平衡时选择第二个吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果。,计算公式为：,C,U,=（待测吸光度A,2,待测吸光度A,1,）K。,.,2两点终点法（two point end assay）,144,图,4-4,两点终点法反应曲线,A,单试剂两点终点法,B,双试剂两点终点法,.,图4-4两点终点法反应曲线 A单试剂两点终点法,145,该法能有效地消除溶血(hemolysis)、黄疸（icterus）和脂浊（lipo-turbid）等样品本身光吸收造成的干扰。,图4-5 血红蛋白、胆红素和脂浊的光吸收曲线,.,该法能有效地消除溶血(hemolysis)、黄疸（i,146,（二）固定时间法,（fixed-time assay）,指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，这两点的吸光度差值用于结果计算。有时也称此法为两点法 。,计算公式与两点终点法相同，,C,U,=(A,2,-A