第七章发酵工业制药课件

第七章 发酵工业制药第七章 发酵工业制药1 1一、概 述发酵工程 发酵工程又称为微生物工程，是利用微生物制发酵工程又称为微生物工程，是利用微生物制造工业原料与工业产品并提供服务的技术。发酵工造工业原料与工业产品并提供服务的技术。发酵工业中的化学反应是通过微生物完整细胞的综合生物业中的化学反应是通过微生物完整细胞的综合生物化学过程来实现的。发酵工业以某种特定的产物为化学过程来实现的。发酵工业以某种特定的产物为工艺的目的物，这就要求微生物细胞既能正常生长工艺的目的物，这就要求微生物细胞既能正常生长又能过量地积累目的产物。又能过量地积累目的产物。一、概 述发酵工程2 2一、概 述发酵工程的四个阶段：第一阶段：第一阶段：2020世纪以前时期，传统微生物的发酵过世纪以前时期，传统微生物的发酵过程来生产葡萄酒、酒、醋、酱、奶酪等食品。发现程来生产葡萄酒、酒、醋、酱、奶酪等食品。发现了发酵的本质。了发酵的本质。“一切发酵过程都是微生物作用的结一切发酵过程都是微生物作用的结果果”一、概 述发酵工程的四个阶段：3 3一、概 述发酵工程的四个阶段：第二阶段：第二阶段：1900-19401900-1940年期间，随着微生物培养技术年期间，随着微生物培养技术的不断进步，新的发酵产品不断问世。新产品有酵的不断进步，新的发酵产品不断问世。新产品有酵母、甘油、乳酸、柠檬酸、丁醇和丙酮等。母、甘油、乳酸、柠檬酸、丁醇和丙酮等。一、概 述发酵工程的四个阶段：4 4一、概 述发酵工程的四个阶段：第三阶段：第三阶段：发酵工业大发展时期，青霉素工业化成发酵工业大发展时期，青霉素工业化成功推动了发酵工业的发展。主要标志有深层培养、功推动了发酵工业的发展。主要标志有深层培养、生产大规模化，多种抗生素、氨基酸、核酸发酵成生产大规模化，多种抗生素、氨基酸、核酸发酵成功，甾体的微生物转化。采用纯种发酵，进行无菌功，甾体的微生物转化。采用纯种发酵，进行无菌操作，对操作条件有严格的控制，相应地采用较复操作，对操作条件有严格的控制，相应地采用较复杂的工艺和装备。杂的工艺和装备。一、概 述发酵工程的四个阶段：5 5一、概 述发酵工程的四个阶段：第四阶段：第四阶段：基因工程等高新技术应用阶段。基因工程等高新技术应用阶段。19531953年年沃森和克里克提出了沃森和克里克提出了DNADNA的双螺旋结构模型，与此的双螺旋结构模型，与此同时，科学家们发现细胞中的同时，科学家们发现细胞中的“质粒质粒”是能在细菌染是能在细菌染色体外进行自我繁殖的细胞质因子，可以说这就是色体外进行自我繁殖的细胞质因子，可以说这就是当今基因操作的起点。当今基因操作的起点。一、概 述发酵工程的四个阶段：6 6一、概 述发酵工程制药发酵工程制药 微生物发酵制药是利用微生物进行药物研究、生产微生物发酵制药是利用微生物进行药物研究、生产和制剂的综合性应用技术科学。微生物药物是指由和制剂的综合性应用技术科学。微生物药物是指由微生物在其生命活动中产生的具有生理活性的微生物在其生命活动中产生的具有生理活性的次级次级代谢产物及其衍生物代谢产物及其衍生物。这些具有生理活性的次级代。这些具有生理活性的次级代谢产物包括具有抗微生物感染和抗肿瘤作用的谢产物包括具有抗微生物感染和抗肿瘤作用的传统传统抗生素、酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂和抗抗生素、酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂和抗氧化物氧化物等。等。一、概 述发酵工程制药 7 7一、概 述微生物次级代谢产物的生物合成具有以下基本特性：微生物次级代谢产物的生物合成具有以下基本特性：微生物的次级代谢是微生物的生理、生化状态微生物的次级代谢是微生物的生理、生化状态 的体现，通常次级代谢产物是在菌体生长后的体现，通常次级代谢产物是在菌体生长后期期 开始形成，当培养液缺乏某种重要的营养物开始形成，当培养液缺乏某种重要的营养物质质 而使细胞生长繁殖受到限制时，次级代谢产而使细胞生长繁殖受到限制时，次级代谢产物物 的合成才被启动。的合成才被启动。一、概 述微生物次级代谢产物的生物合成具有以下基本特性：8 8一、概 述微生物次级代谢产物的生物合成具有以下基本特性：微生物次级代谢产物的生物合成具有以下基本特性：次级代谢的生物合成是以初级代谢产物为前体物，次级代谢的生物合成是以初级代谢产物为前体物，并受初级代谢的调节。当与次级代谢产物并受初级代谢的调节。当与次级代谢产物 生物合成有关的初级代谢受阻时，该次级代生物合成有关的初级代谢受阻时，该次级代谢谢 产物不能合成。产物不能合成。一、概 述微生物次级代谢产物的生物合成具有以下基本特性：9 9一、概 述微生物次级代谢产物的生物合成具有以下基本特性：微生物次级代谢产物的生物合成具有以下基本特性：一种微生物能够合成多种结构上完全不同的次一种微生物能够合成多种结构上完全不同的次 级代谢产物；相反，不同的微生物也可能合级代谢产物；相反，不同的微生物也可能合成成 相同的次级代谢产物。微生物菌种在分类学相同的次级代谢产物。微生物菌种在分类学上上 的位置与产生的次级代谢产物的结构之间没的位置与产生的次级代谢产物的结构之间没有有 明确的内在联系。明确的内在联系。一、概 述微生物次级代谢产物的生物合成具有以下基本特性：1010一、概 述微生物次级代谢产物的生物合成具有以下基本特性：微生物次级代谢产物的生物合成具有以下基本特性：合成次级代谢产物的酶系对底物的特异性不强，合成次级代谢产物的酶系对底物的特异性不强，进行次级代谢的产生菌往往同时合成多种结构进行次级代谢的产生菌往往同时合成多种结构 类似的次级代谢产物，而且代谢过程中液存类似的次级代谢产物，而且代谢过程中液存在在 着许多结构相似的次级代谢产物。着许多结构相似的次级代谢产物。一、概 述微生物次级代谢产物的生物合成具有以下基本特性：1111一、概 述微生物次级代谢产物的生物合成具有以下基本特性：微生物次级代谢产物的生物合成具有以下基本特性：在次级代谢产物的合成过程中，有时控制代谢产在次级代谢产物的合成过程中，有时控制代谢产物生成的基因不仅位于染色体上，也可位于染色物生成的基因不仅位于染色体上，也可位于染色体以外的遗传物质（如质粒）中，而且质粒在次体以外的遗传物质（如质粒）中，而且质粒在次级代谢产物生物合成中所起的作用要比在初级代级代谢产物生物合成中所起的作用要比在初级代谢产物生物合成大得多。正因为染色体外遗传物谢产物生物合成大得多。正因为染色体外遗传物质更容易受外界环境的影响而从细胞丢失，所以质更容易受外界环境的影响而从细胞丢失，所以造成了次级代谢产物生物合成的不稳定性。造成了次级代谢产物生物合成的不稳定性。一、概 述微生物次级代谢产物的生物合成具有以下基本特性：1212一、概 述微生物药物的分类：微生物药物的分类：a)a)抗生素类药物：抗生素类药物：抗生素是在低微生物浓度下能抑制抗生素是在低微生物浓度下能抑制b)b)或影响活的机体生命过程的次级代谢产物及其衍生或影响活的机体生命过程的次级代谢产物及其衍生物。物。c)c)氨基酸类药物：氨基酸类药物：主要针对用于治疗某些针对性的疾病。主要针对用于治疗某些针对性的疾病。d)d)核苷酸类药物：核苷酸类药物：肌苷酸、肌苷酸、5-5-酰苷酸等。酰苷酸等。e)e)维生素类药物：维生素类药物：维生素维生素B B2 2、维生素、维生素B B1212等。等。f)f)甾体类激素甾体类激素g)g)治疗酶及酶抑制剂：治疗酶及酶抑制剂：消化类酶抗肿瘤酶类等。消化类酶抗肿瘤酶类等。一、概 述微生物药物的分类：1313二、微生物药物的产生菌1.微生物药物生产中的优点：一、微生物种类繁多，并且生活环境条件复杂多一、微生物种类繁多，并且生活环境条件复杂多样，从而使得微生物在生理代谢上和遗传上存在样，从而使得微生物在生理代谢上和遗传上存在其它生物群类无法比拟的多样性，其生活过程中其它生物群类无法比拟的多样性，其生活过程中产生的代谢产物也因此多种多样，为我们寻找新产生的代谢产物也因此多种多样，为我们寻找新药物提供了充分的可能性。药物提供了充分的可能性。二、微生物药物的产生菌1.微生物药物生产中的优点：1414二、微生物药物的产生菌1.微生物药物生产中的优点：二、微生物生长快速，并且可以进行大规模的工二、微生物生长快速，并且可以进行大规模的工业化生产。业化生产。二、微生物药物的产生菌1.微生物药物生产中的优点：1515二、微生物药物的产生菌1.微生物药物生产中的优点：三、微生物的遗传背景简单，易于利用各种遗传三、微生物的遗传背景简单，易于利用各种遗传突变手段，改变微生物的代谢途径和调控方式，突变手段，改变微生物的代谢途径和调控方式，使得各种微生物的药用成分能够大量合成，开发使得各种微生物的药用成分能够大量合成，开发价廉物美的药物。价廉物美的药物。二、微生物药物的产生菌1.微生物药物生产中的优点：1616二、微生物药物的产生菌1.微生物药物生产中的优点：四、药物的疗效包括两个方面，一是治疗疾病的四、药物的疗效包括两个方面，一是治疗疾病的效果，二是药物的毒性大小。一个好的药物既要效果，二是药物的毒性大小。一个好的药物既要求疗效高，同时又要求毒性尽可能的低。微生物求疗效高，同时又要求毒性尽可能的低。微生物代谢产物的广泛多样性为筛选高效低毒药物提供代谢产物的广泛多样性为筛选高效低毒药物提供了可能性。并且，随着基因工程技术和组合生物了可能性。并且，随着基因工程技术和组合生物合成技术的发展，甚至能够利用微生物的代谢系合成技术的发展，甚至能够利用微生物的代谢系统生产出自然界原来不存在的统生产出自然界原来不存在的“人工人工”天然产物。天然产物。二、微生物药物的产生菌1.微生物药物生产中的优点：1717二、微生物药物的产生菌2.药源微生物：半个多世纪的微生物药物的筛选与开发，为半个多世纪的微生物药物的筛选与开发，为人们提供了大量的各种类型的天然化合物，占全人们提供了大量的各种类型的天然化合物，占全部发现的生物活性天然化合物的部发现的生物活性天然化合物的80%80%以上。在微以上。在微生物来源的生物活性天然化合物中大多数是由放生物来源的生物活性天然化合物中大多数是由放线菌（约占线菌（约占70%70%），尤其是链霉菌（占放线菌中），尤其是链霉菌（占放线菌中发现物质的发现物质的75%75%左右）中获得。左右）中获得。二、微生物药物的产生菌2.药源微生物：1818二、微生物药物的产生菌2.药源微生物：a)a)放线菌放线菌b)b)目前国际上已经描述和发表的放线菌有目前国际上已经描述和发表的放线菌有6060个个c)c)属、属、20002000多种。放线菌是已发现产生微生物多种。放线菌是已发现产生微生物药物药物d)d)最多，同时也是药物研究最多的生物类群。最多，同时也是药物研究最多的生物类群。其中其中e)e)最重要的是链霉菌属。此外，还有产生放线最重要的是链霉菌属。此外，还有产生放线菌素菌素f)f)、庆大霉素的小单胞菌属、产生利福霉素等、庆大霉素的小单胞菌属、产生利福霉素等的诺的诺g)g)卡菌属、以及稀有放线菌属。卡菌属、以及稀有放线菌属。二、微生物药物的产生菌2.药源微生物：1919二、微生物药物的产生菌2.药源微生物：放线菌产生的抗生素放线菌产生的抗生素1.1.在所有已发现的抗生素中，由它产生的抗在所有已发现的抗生素中，由它产生的抗生素生素2.2.占一半以上，其中又以链霉菌属产生的抗生占一半以上，其中又以链霉菌属产生的抗生素为素为3.3.最多。诺卡式菌属、小単孢菌属次之。这类最多。诺卡式菌属、小単孢菌属次之。这类抗生抗生4.4.素中主要有氨基糖苷类，如链霉素；四环类，素中主要有氨基糖苷类，如链霉素；四环类，如如5.5.四环素；大环内酯类，如红霉素；多烯类，四环素；大环内酯类，如红霉素；多烯类，如制如制6.6.霉菌素；放线菌素类，如放线菌霉菌素；放线菌素类，如放线菌D D等。等。二、微生物药物的产生菌2.药源微生物：2020二、微生物药物的产生菌2.药源微生物：b)b)细菌细菌 芽孢杆菌属和假单孢杆菌属主要的生物活性芽孢杆菌属和假单孢杆菌属主要的生物活性次级代谢产物是肽类。如枯草芽孢杆菌产生的杆次级代谢产物是肽类。如枯草芽孢杆菌产生的杆菌肽等。菌肽等。二、微生物药物的产生菌2.药源微生物：2121二、微生物药物的产生菌2.药源微生物：细菌产生的抗生素细菌产生的抗生素1.1.有细菌产生的抗生素的主要来源是粘多有细菌产生的抗生素的主要来源是粘多糖菌糖菌2.2.、枯草杆菌、芽孢杆菌等。属这类抗生素的、枯草杆菌、芽孢杆菌等。属这类抗生素的有多有多3.3.粘菌素等。粘菌素等。二、微生物药物的产生菌2.药源微生物：2222二、微生物药物的产生菌2.药源微生物：c)c)真菌真菌 是第一个应用于临床的抗生素是第一个应用于临床的抗生素-青霉素的产生青霉素的产生菌，并从此进入了抗菌治疗的抗生素时代。在真菌，并从此进入了抗菌治疗的抗生素时代。在真菌中还发现了头孢菌素、灰黄霉素等，以及真菌菌中还发现了头孢菌素、灰黄霉素等，以及真菌药物如环孢菌素等。药物如环孢菌素等。二、微生物药物的产生菌2.药源微生物：2323二、微生物药物的产生菌2.药源微生物：真菌产生的抗生素真菌产生的抗生素1.1.在真菌的四个纲中，不完全菌纲中的青在真菌的四个纲中，不完全菌纲中的青霉菌霉菌2.2.属和头孢菌属等分别产生一些很重要的抗生属和头孢菌属等分别产生一些很重要的抗生素，素，3.3.如青霉素、头孢菌素。其次为担子纲菌。藻如青霉素、头孢菌素。其次为担子纲菌。藻纲菌纲菌4.4.和子囊菌纲产生的抗生素很少。和子囊菌纲产生的抗生素很少。二、微生物药物的产生菌2.药源微生物：2424二、微生物药物的产生菌2.药源微生物：d)d)稀有放线菌稀有放线菌 特点：生长速度比较缓慢；营养需求较为复特点：生长速度比较缓慢；营养需求较为复杂；比较缺乏孢子分化的能力；不能稳定地保存杂；比较缺乏孢子分化的能力；不能稳定地保存。它是指除常见的链霉菌以外的其他放线菌，而。它是指除常见的链霉菌以外的其他放线菌，而不是一个具体的分类学单元。不是一个具体的分类学单元。放线菌生物学研究和资源开发受分离条件和技术放线菌生物学研究和资源开发受分离条件和技术的限制。的限制。二、微生物药物的产生菌2.药源微生物：2525二、微生物药物的产生菌2.药源微生物：f)f)海洋微生物海洋微生物 海洋微生物种类高达海洋微生物种类高达100100万种以上，其次生代万种以上，其次生代谢产物的多样性也是陆生微生物无法比拟的。但谢产物的多样性也是陆生微生物无法比拟的。但人工培养的海洋微生物只有几千种，不到总数的人工培养的海洋微生物只有几千种，不到总数的1%1%。二、微生物药物的产生菌2.药源微生物：2626二、微生物药物的产生菌2.药源微生物：g)g)极端微生物极端微生物 极端微生物是在特殊环境（如高温、低温、极端微生物是在特殊环境（如高温、低温、高盐、高压等）中形成的一类特殊的微生物。目高盐、高压等）中形成的一类特殊的微生物。目前发现的极端微生物主要包括嗜（酸、盐、碱、前发现的极端微生物主要包括嗜（酸、盐、碱、热、冷、压）菌等。由于它们具有特殊的基因结热、冷、压）菌等。由于它们具有特殊的基因结构、特殊的生命过程及产物，并对人类解决一些构、特殊的生命过程及产物，并对人类解决一些重大问题如生命起源及演化等有很大的帮助。重大问题如生命起源及演化等有很大的帮助。二、微生物药物的产生菌2.药源微生物：2727二、微生物药物的产生菌2.药源微生物：h)h)黏细菌黏细菌 黏细菌是一类高等的原核生物，具有复杂的黏细菌是一类高等的原核生物，具有复杂的多细胞行为和形态发生。在原核生物种，按已发多细胞行为和形态发生。在原核生物种，按已发现生物活性物质的数量，黏细菌仅排在放线菌和现生物活性物质的数量，黏细菌仅排在放线菌和芽孢杆菌之后。目前从黏细菌中已发现大约芽孢杆菌之后。目前从黏细菌中已发现大约360360多多种活性物质，约占微生物来源总数的种活性物质，约占微生物来源总数的3.5%3.5%。二、微生物药物的产生菌2.药源微生物：2828三、优良菌种的选育一、微生物药物产生菌菌种选育的必要性和重要性一、微生物药物产生菌菌种选育的必要性和重要性1.1.必要性必要性a.a.经诱变剂处理的细胞中只有一部分是突变型菌株，经诱变剂处理的细胞中只有一部分是突变型菌株，而有害突变往往占有很大比例；而有害突变往往占有很大比例；b.b.从自然界筛选得来的菌株，药物代谢合成能力均从自然界筛选得来的菌株，药物代谢合成能力均很低，野生型菌株由于长时间生长在非最适条件很低，野生型菌株由于长时间生长在非最适条件下，产物浓度很低，对于工业生产来说，如果不下，产物浓度很低，对于工业生产来说，如果不进行菌种改良，势必造成生产成本过高。进行菌种改良，势必造成生产成本过高。三、优良菌种的选育一、微生物药物产生菌菌种选育的必要性和重要2929三、优良菌种的选育一、微生物药物产生菌菌种选育的必要性和重要性一、微生物药物产生菌菌种选育的必要性和重要性2.2.重要性重要性a.a.菌种选育是提高单位产量和改进产品质量的重要菌种选育是提高单位产量和改进产品质量的重要措施；措施；b.b.能够改变菌种的某些遗传性能，使之更适合于工能够改变菌种的某些遗传性能，使之更适合于工业生产，例如抗噬菌体的菌株、能利用廉价发酵业生产，例如抗噬菌体的菌株、能利用廉价发酵原料或需氧量较小的菌株等。原料或需氧量较小的菌株等。三、优良菌种的选育一、微生物药物产生菌菌种选育的必要性和重要3030三、优良菌种的选育二、选育方法二、选育方法1.1.自然选育自然选育 不经过人工处理，利用微生物的自然突变进行菌不经过人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。种选育的过程称为自然选育。自然选育可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳自然选育可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产水平、提高产物产量的目的。但是自然选育存定生产水平、提高产物产量的目的。但是自然选育存在效率低和进展慢的缺点。在效率低和进展慢的缺点。三、优良菌种的选育二、选育方法3131三、优良菌种的选育二、选育方法二、选育方法2.2.诱变育种诱变育种 是用不同的诱变剂处理微生物的细胞群体，以诱是用不同的诱变剂处理微生物的细胞群体，以诱发各种遗传突变，然后采用简便、快速和高效的筛选发各种遗传突变，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中选出所需要的突变株。发酵工业中使用的方法，从中选出所需要的突变株。发酵工业中使用的高产菌株，几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产高产菌株，几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产性能的菌株，故至今仍是菌种改良的主要方法。性能的菌株，故至今仍是菌种改良的主要方法。三、优良菌种的选育二、选育方法3232常用诱变剂及其类别物理诱变剂物理诱变剂 化学诱变剂化学诱变剂 生物诱变剂生物诱变剂紫外线紫外线快中子快中子X X射线射线射线射线激光激光与碱基反应的物质与碱基反应的物质 碱基类似物碱基类似物 在在DNADNA中插入中插入 或缺失碱基或缺失碱基 硫酸二乙酯（硫酸二乙酯（DESDES）2-2-氨基嘌呤氨基嘌呤 吖啶类物质吖啶类物质甲基磺酸乙酯（甲基磺酸乙酯（EMSEMS）5-5-溴尿嘧啶溴尿嘧啶 吖啶类氮芥衍生物吖啶类氮芥衍生物亚硝基胍（亚硝基胍（NTGNTG）8-8-氮鸟嘌呤氮鸟嘌呤亚硝酸（亚硝酸（NANA）羟胺羟胺噬菌体噬菌体三、优良菌种的选育常用诱变剂及其类别物理诱变剂 化学诱3333三、优良菌种的选育二、选育方法二、选育方法3.3.杂交育种杂交育种 是将两个基因型不同的亲株的某些遗传信息，通是将两个基因型不同的亲株的某些遗传信息，通过杂交重组于同一重组体中，形成新的遗传型个体的过杂交重组于同一重组体中，形成新的遗传型个体的过程。传统的杂交育种在真核微生物中可以通过有性过程。传统的杂交育种在真核微生物中可以通过有性杂交及准性杂交两种途径；在原核微生物中则可通过杂交及准性杂交两种途径；在原核微生物中则可通过结合杂交进行。结合杂交进行。三、优良菌种的选育二、选育方法3434三、优良菌种的选育二、选育方法二、选育方法4.4.重组重组DNADNA技术在微生物药物菌种改良研究中的应用技术在微生物药物菌种改良研究中的应用a.a.提高微生物药物的单位产量提高微生物药物的单位产量b.b.阻断支路代谢，增加有效组分的含量阻断支路代谢，增加有效组分的含量c.c.构建能产生半合成抗生素中间体的基因工程菌构建能产生半合成抗生素中间体的基因工程菌d.d.构建产生新化合物的基因工程菌构建产生新化合物的基因工程菌三、优良菌种的选育二、选育方法3535三、优良菌种的选育出发菌株自然分离纯化斜面培养制备单孢子悬液诱变剂处理稀释涂平板培养，计数突变株分离初筛复筛突变性能检测筛选出高产菌株保存诱变育种示意图三、优良菌种的选育出发菌株自然分离纯化斜面培养制备单孢子悬液3636