第十八章氨基酸已课件

第十八章氨基酸已1第十八章氨基酸已1概概 述述n氨基酸是构成蛋白成分。氨基酸是构成蛋白成分。n第一个用发酵法生产的氨基酸是谷氨酸。第一个用发酵法生产的氨基酸是谷氨酸。目前世界上可用发酵法生产的氨基酸有目前世界上可用发酵法生产的氨基酸有2020多种。多种。2概 述氨基酸是构成蛋白成分。2氨基酸的用途氨基酸的用途1.食品工业：食品工业：n强化食品强化食品(赖氨酸，苏氨酸，色氨酸于小麦中赖氨酸，苏氨酸，色氨酸于小麦中)n增鲜剂：谷氨酸单钠和天冬氨酸增鲜剂：谷氨酸单钠和天冬氨酸n苯丙氨酸与天冬氨酸可用于制造低热量二肽甜苯丙氨酸与天冬氨酸可用于制造低热量二肽甜味剂味剂(-天冬酰苯丙氨酸甲酯天冬酰苯丙氨酸甲酯)，此产品，此产品1981年获年获FDA批准，现在每年产量已达数万吨。批准，现在每年产量已达数万吨。2.饲料工业：饲料工业：n甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料。甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料。3氨基酸的用途3n必需氨基酸的木桶模式图必需氨基酸的木桶模式图4必需氨基酸的木桶模式图4553.医药工业：医药工业：n多种复合氨基酸制剂可通过输液治疗营养多种复合氨基酸制剂可通过输液治疗营养或代谢失调。或代谢失调。n苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气对骨髓肿瘤治疗有效，且副作用低。子气对骨髓肿瘤治疗有效，且副作用低。4.化学工业：化学工业：谷氨基钠作洗涤剂，丙氨酸谷氨基钠作洗涤剂，丙氨酸制造丙氨酸纤维。制造丙氨酸纤维。63.医药工业：6n生产氨基酸的大国为日本和德国。生产氨基酸的大国为日本和德国。n日本的味之素、协和发酵及德国的德固日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世界氨基酸生产的三巨头。沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能它们能生产高品质的氨基酸，可直接用于输液生产高品质的氨基酸，可直接用于输液制剂的生产。制剂的生产。n日本在美国、法国等建立了合资的氨基日本在美国、法国等建立了合资的氨基酸生产厂家，生产氨基酸和天冬甜精等酸生产厂家，生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。衍生物。7生产氨基酸的大国为日本和德国。7n国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司,湖北八峰氨基酸公司，但目前无论生产规模及产湖北八峰氨基酸公司，但目前无论生产规模及产品质量还难于与国外抗衡。品质量还难于与国外抗衡。n在在80年代中后期，我国从日本的味之素、协和发年代中后期，我国从日本的味之素、协和发酵以技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术和酵以技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术和仿造产品，仿造产品，1991年销售量为二千万瓶，年销售量为二千万瓶，1996年达年达六千万瓶，六千万瓶，主要厂家有无锡华瑞，北京费森尤斯，主要厂家有无锡华瑞，北京费森尤斯，昆明康普莱特，但生产原料都依赖进口。昆明康普莱特，但生产原料都依赖进口。n据专家估计，到据专家估计，到2010年，世界氨基酸产值可达年，世界氨基酸产值可达50亿美元，占生物技术市场的亿美元，占生物技术市场的8%，国内的氨基酸，国内的氨基酸产值可达产值可达40亿元，占全国发酵产业总产值的亿元，占全国发酵产业总产值的12%。8国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司,湖北八峰氨基酸公司第一节第一节 氨基酸的生产氨基酸的生产一、氨基酸的生产方法一、氨基酸的生产方法（一）提取法：（一）提取法：生产氨基酸最早采用的生产生产氨基酸最早采用的生产方法。方法。将蛋白质原料酸水解，然后从水解将蛋白质原料酸水解，然后从水解液中抽提出氨基酸。液中抽提出氨基酸。（二）直接发酵法：（二）直接发酵法：利用微生物的作用直接将利用微生物的作用直接将粮食原料经过发酵生产氨基酸。粮食原料经过发酵生产氨基酸。野生菌株发酵、营野生菌株发酵、营养缺陷型突变发酵、抗氨基酸结构类似物突变株发酵、养缺陷型突变发酵、抗氨基酸结构类似物突变株发酵、抗氨基酸结构类似物突变株的营养缺陷型菌株发酵和营抗氨基酸结构类似物突变株的营养缺陷型菌株发酵和营养缺陷型回复突变株发酵。养缺陷型回复突变株发酵。9第一节 氨基酸的生产一、氨基酸的生产方法9（三）添加前体法：（三）添加前体法：利用微生物转化相应的氨基利用微生物转化相应的氨基酸的前体，成为相应的氨基酸。如：利用嗜甘酸的前体，成为相应的氨基酸。如：利用嗜甘油棒杆菌将甘氨酸转化为丝氨酸。油棒杆菌将甘氨酸转化为丝氨酸。（四）酶法：（四）酶法：利用微生物产生的酶来制造氨基酸。利用微生物产生的酶来制造氨基酸。如赖氨酸、色氨酸等可用此法。如赖氨酸、色氨酸等可用此法。（五）合成法：（五）合成法：用化学合成的方法制造氨基酸。用化学合成的方法制造氨基酸。DL-蛋蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。10（三）添加前体法：利用微生物转化相应的氨基酸的前体，成为相应氨基酸生产方法的比较氨基酸生产方法的比较合成法合成法发酵法发酵法酶法酶法原料原料石油石油碳源和氮源碳源和氮源底物和酶底物和酶产物浓度产物浓度高高低低高高产物类型产物类型DL-型型L-型型L-型型副产物副产物少少多多少少11氨基酸生产方法的比较合成法发酵法酶法原料石油碳源和氮源底物和名称名称制法制法名称名称制法制法L-缬氨酸缬氨酸发酵法、合成法发酵法、合成法L-半胱氨酸半胱氨酸抽提法抽提法L-亮氨酸亮氨酸抽提法、发酵法抽提法、发酵法L-酪氨酸酪氨酸抽提法抽提法L-异亮氨酸异亮氨酸发酵法发酵法甘氨酸甘氨酸合成法合成法L-苏氨酸苏氨酸发酵法发酵法DL-丙氨酸丙氨酸合成法合成法DL-蛋氨酸蛋氨酸合成法合成法L-丙氨酸丙氨酸发酵法发酵法L-蛋氨酸蛋氨酸合成法、酶法合成法、酶法L-丝氨酸丝氨酸发酵法发酵法L-苯丙氨酸苯丙氨酸合成法合成法L-谷氨酸胺谷氨酸胺发酵法发酵法L-色氨酸色氨酸合成法、发酵法合成法、发酵法L-谷氨酸谷氨酸发酵法发酵法L-赖氨酸赖氨酸发酵法、酶法发酵法、酶法L-脯氨酸脯氨酸发酵法发酵法L-精氨酸精氨酸发酵法、抽提法发酵法、抽提法L-羟基脯氨酸羟基脯氨酸抽提法抽提法L-组氨酸组氨酸发酵法、抽提法发酵法、抽提法L-鸟氨酸鸟氨酸发酵法发酵法L-天门冬氨酰天门冬氨酰发酵法发酵法L-瓜氨酸瓜氨酸发酵法发酵法L-天门冬氨酸天门冬氨酸酶法酶法12名称制法名称制法L-缬氨酸发酵法、合成法L-半胱氨酸抽提法L二、氨基酸产生菌的选育二、氨基酸产生菌的选育n氨基酸是细胞组分，受到严格的代谢调氨基酸是细胞组分，受到严格的代谢调节控制。节控制。n想让菌种积累大量的某一个氨基酸，必想让菌种积累大量的某一个氨基酸，必须打破微生物对该氨基酸的代谢调控。须打破微生物对该氨基酸的代谢调控。如选育营养缺陷型或氨基酸类似物抗性如选育营养缺陷型或氨基酸类似物抗性突变，可以减弱或消除氨基酸终产物阻突变，可以减弱或消除氨基酸终产物阻遏。遏。第一节第一节 氨基酸的生产氨基酸的生产13二、氨基酸产生菌的选育第一节 氨基酸的生产13（一）氨基酸产生菌的分离（一）氨基酸产生菌的分离n氨基酸生产菌的要求：氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单楚，代谢途径比较简单1.产生菌的来源：产生菌的来源：采样分离；一般为细菌采样分离；一般为细菌（棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌）；分离时要抑制真杆菌属的棒型细菌）；分离时要抑制真菌（菌（50g/mL匹匹马菌素）菌素）2.分离方法：分离方法：平板分离平板分离二、氨基酸产生菌的选育二、氨基酸产生菌的选育14（一）氨基酸产生菌的分离二、氨基酸产生菌的选育143.筛选方法筛选方法关键：关键：设计一种适合氨基酸产生的设计一种适合氨基酸产生的生产培养基生产培养基n根据其生物合成知识设计，如谷氨酸的根据其生物合成知识设计，如谷氨酸的生产需生物素；蛋氨酸的前体为生产需生物素；蛋氨酸的前体为-甲基甲基硫基硫基-羟基丁酸等。羟基丁酸等。确定一种大规模筛选的确定一种大规模筛选的氨基酸检测方法氨基酸检测方法二、氨基酸产生菌的选育二、氨基酸产生菌的选育153.筛选方法二、氨基酸产生菌的选育15氨基酸检测方法：氨基酸检测方法：A.A.平板培养平板培养+覆盖培养基（含氨基酸鉴定菌）覆盖培养基（含氨基酸鉴定菌）产生菌在氨基酸生产培养基上生长产生菌在氨基酸生产培养基上生长高强度紫外线照射高强度紫外线照射倒入氨基酸测定培养基（含氨基倒入氨基酸测定培养基（含氨基酸鉴定菌酸鉴定菌氨基酸缺陷型）氨基酸缺陷型）培养：培养：菌落周围氨基酸鉴定菌生长菌落周围氨基酸鉴定菌生长16氨基酸检测方法：产生菌在氨基酸生产培养基上生长高强度紫外线照B.B.可逆抑制测定法可逆抑制测定法例：例：L-苯丙氨酸产生菌的筛选苯丙氨酸产生菌的筛选-2噻吩丙氨酸是枯草噻吩丙氨酸是枯草杆菌的抑制剂，而杆菌的抑制剂，而L-苯丙氨酸专一解除此苯丙氨酸专一解除此抑制。抑制。苯丙氨酸产生菌在生产培养基上生长苯丙氨酸产生菌在生产培养基上生长倒入培养基（含指示菌（枯草）倒入培养基（含指示菌（枯草）和抑制剂和抑制剂-2噻吩丙氨酸）噻吩丙氨酸）培养：培养：菌落周围指示菌生长菌落周围指示菌生长苯丙氨酸测定培养基苯丙氨酸测定培养基17B.可逆抑制测定法-2噻吩丙氨酸是枯草杆菌的抑制剂，而L-C.液体培养基中氨基酸产生菌的检测液体培养基中氨基酸产生菌的检测a.过滤除菌发酵液（含该菌产生的过滤除菌发酵液（含该菌产生的AA）+氨基酸氨基酸测定培养基（含氨基酸鉴定菌测定培养基（含氨基酸鉴定菌该该AA缺陷缺陷）37，16-23h，测定细胞密度或浊度。，测定细胞密度或浊度。b.发酵培养基（不接种产生菌）发酵培养基（不接种产生菌）+已知浓度的特已知浓度的特定氨基酸样品定氨基酸样品+鉴定菌鉴定菌37，16-23h，测定，测定细胞密度或浊度。细胞密度或浊度。18C.液体培养基中氨基酸产生菌的检测18（二）氨基酸营养缺陷型突变株的选育方（二）氨基酸营养缺陷型突变株的选育方案案1.配制以下培养基配制以下培养基2.诱变与营养缺陷型突变株的分离诱变与营养缺陷型突变株的分离3.营养要求的测定营养要求的测定二、氨基酸产生菌的选育二、氨基酸产生菌的选育19（二）氨基酸营养缺陷型突变株的选育方案二、氨基酸产生菌的选育1.配制以下培养基配制以下培养基基本培养基基本培养基(MM)：能满足野生型菌株正常生能满足野生型菌株正常生长的培养基；长的培养基；完完全全培培养养基基(CM)：能能满满足足各各种种营营养养缺缺陷陷型型生生长长的的培培养养基基，如如牛牛肉肉膏膏蛋蛋白白胨胨培培养养基基、麦麦芽芽汁培养基等；汁培养基等；补补充充培培养养基基(SM)：在在基基本本培培养养基基中中加加入入相相应应的的营营养养成成分分，以以满足足相相应营营养养缺缺陷陷型型菌菌株株生生长的的合成合成培养基培养基。201.配制以下培养基202.诱变与营养缺陷型突变株的分离诱变与营养缺陷型突变株的分离诱变：诱变：物理诱变、化学诱变物理诱变、化学诱变 淘汰野生型：淘汰野生型：抗生素（青霉素）法抗生素（青霉素）法 检出缺陷型：检出缺陷型：影印法、点种法、夹层法等影印法、点种法、夹层法等 检出检出原理：原理：利用固体培养基，缺陷型在利用固体培养基，缺陷型在CM上生长良好，上生长良好，在在MM上则不生长，而野生型都能生长。上则不生长，而野生型都能生长。212.诱变与营养缺陷型突变株的分离213.营养要求的测定营养要求的测定n利用补充培养基利用补充培养基(SM)（在基本培养基中（在基本培养基中加入相应的氨基酸成分）。加入相应的氨基酸成分）。223.营养要求的测定22（三）氨基酸结构类似物抗性突变株的选（三）氨基酸结构类似物抗性突变株的选育育1.目的：目的：解除氨基酸的反馈抑制和阻遏解除氨基酸的反馈抑制和阻遏2.突变株形成原因：突变株形成原因：参看课本参看课本P3563.氨基酸结构类似物氨基酸结构类似物二、氨基酸产生菌的选育二、氨基酸产生菌的选育23（三）氨基酸结构类似物抗性突变株的选育二、氨基酸产生菌的选育对氟苯丙氨酸对氟苯丙氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸D-D-精氨酸精氨酸精氨酸精氨酸乙硫氨酸乙硫氨酸异亮氨酸异亮氨酸-氨基氨基-羟基戊酸羟基戊酸（AHV)AHV)苏氨酸苏氨酸S-S-（2-2-氨基乙基）氨基乙基）-L-L-半半胱氨酸胱氨酸(AEC)(AEC)赖氨酸赖氨酸结构类似物结构类似物目标产物目标产物24对氟苯丙氨酸苯丙氨酸D-精氨酸精氨酸乙硫氨酸异亮氨酸-氨基（四）细胞透性改变突变株的选育（四）细胞透性改变突变株的选育1.目的：目的：使胞内的代谢产物迅速渗漏出去，解除末使胞内的代谢产物迅速渗漏出去，解除末端产物的反馈抑制。端产物的反馈抑制。2.方法方法:透性酶（诱发突变）透性酶（诱发突变）生理学手段生理学手段直接抑制膜的合成或使膜受缺直接抑制膜的合成或使膜受缺损（生物素缺陷型）损（生物素缺陷型）膜缺损突变株膜缺损突变株 油酸缺陷型、甘油缺陷型油酸缺陷型、甘油缺陷型添加适量的青霉素添加适量的青霉素 二、氨基酸产生菌的选育二、氨基酸产生菌的选育25（四）细胞透性改变突变株的选育二、氨基酸产生菌的选育25三、氨基酸发酵的代谢控制三、氨基酸发酵的代谢控制（一）发酵条件控制（一）发酵条件控制（二）生产菌株的稳定（二）生产菌株的稳定26三、氨基酸发酵的代谢控制26（一）发酵条件控制（一）发酵条件控制控制因子控制因子发酵转换发酵转换氧氧乳酸或琥珀酸乳酸或琥珀酸谷氨酸谷氨酸 （通气量不足）（通气量不足）（通气量（通气量充足充足）NH4+-酮酮戊二酸戊二酸谷氨酸谷氨酸谷酰胺谷酰胺 （减少）（减少）（适量适量）（过量）（过量）pHN-乙酰谷酰酸乙酰谷酰酸谷氨酸谷氨酸 （酸性）（酸性）（中性或微碱性（中性或微碱性7-8）磷酸磷酸缬氨酸缬氨酸谷氨酸谷氨酸 （高浓度磷酸）（高浓度磷酸）生物素生物素乳酸或琥珀酸乳酸或琥珀酸谷氨酸谷氨酸 （饱和）（饱和）（限量（限量-亚适量亚适量）表表 谷氨酸谷氨酸产生菌因培养条件的代谢变化产生菌因培养条件的代谢变化3335；34-3727（一）发酵条件控制控制因子发酵转换氧乳酸或琥珀酸谷氨酸Nn谷氨酸谷氨酸发酵罐的培养基装量比为发酵罐的培养基装量比为0.7，接种量为，接种量为0.5%1%，前期温度为，前期温度为3335，后期为后期为3638，通气，通气1 0.110.13(V/V)，发酵，发酵12 h后后开始流加尿素。维持发酵液开始流加尿素。维持发酵液pH在在7.0以上，以上，pH下降后再次流加尿素，需要流加下降后再次流加尿素，需要流加35次。次。n提取：发酵液用盐酸调到提取：发酵液用盐酸调到pH4.04.5，初结晶，初结晶，2 h后调后调pH3.03.2，降温结晶，虹吸去上层，降温结晶，虹吸去上层，下层经离心处理的粗谷氨酸，收率可达到下层经离心处理的粗谷氨酸，收率可达到80%。精制：粗谷氨酸溶于适量水，用活性炭脱色，精制：粗谷氨酸溶于适量水，用活性炭脱色，加入碳酸钠，中和成盐，再进一步精制得到谷加入碳酸钠，中和成盐，再进一步精制得到谷氨酸成品。氨酸成品。28谷氨酸发酵罐的培养基装量比为0.7，接种量为0.5%1%，n谷氨酸的生物合成途径大致是：谷氨酸的生物合成途径大致是：葡萄糖经糖酵葡萄糖经糖酵解解(EMP途径途径)和己糖磷酸支路和己糖磷酸支路(HMP途径途径)生成丙生成丙酮酸，再氧化成乙酰辅酶酮酸，再氧化成乙酰辅酶A(乙酰乙酰COA)，然后，然后进入三羧酸循环，生成进入三羧酸循环，生成-酮戊二酸。酮戊二酸。-酮戊二酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条件存在的条件下，生成谷氨酸。当生物素缺乏时，菌种生长下，生成谷氨酸。当生物素缺乏时，菌种生长十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸发酵。十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸发酵。因此，一般将生物素控制在亚适量条件下，才因此，一般将生物素控制在亚适量条件下，才能得到高产量的谷氨酸。能得到高产量的谷氨酸。29谷氨酸的生物合成途径大致是：葡萄糖经糖酵解(EMP途径)和己（二）生产菌株的稳定（二）生产菌株的稳定防止回复突变（以赖氨酸发酵为例）：防止回复突变（以赖氨酸发酵为例）：1.增加遗传标记增加遗传标记如双缺陷型如双缺陷型(hom-+met-)2.除除定期纯化定期纯化外，尽可能用外，尽可能用遗传标记明显遗传标记明显、回复回复率低的菌株率低的菌株3.营养充分营养充分(AA)，防止回复突变株占优势，防止回复突变株占优势4.添加药剂添加药剂防止回复突变株生长（如赖氨酸防止回复突变株生长（如赖氨酸产生菌比回复突变株对红霉素的敏感性低，）产生菌比回复突变株对红霉素的敏感性低，）30（二）生产菌株的稳定30优先合成优先合成反馈抑制反馈抑制阻遏阻遏O-琥珀酸高琥珀酸高丝氨酸丝氨酸天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酰磷酸天冬氨酸天冬氨酸-半醛半醛高丝氨高丝氨酸酸二氢吡啶二氢吡啶-2，6-二羧酸二羧酸赖氨酸赖氨酸高丝氨酸高丝氨酸磷酸磷酸苏氨酸苏氨酸蛋氨酸蛋氨酸异亮氨酸异亮氨酸高丝氨酸脱高丝氨酸脱氢酶氢酶hom天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶31优先合成反馈抑制阻遏O-琥珀酸高丝氨酸天冬氨酸天冬氨酰磷一、赖氨酸的生物合成途径一、赖氨酸的生物合成途径n微生物的赖氨酸生物合成存在两条不同的途径，微生物的赖氨酸生物合成存在两条不同的途径，即二即二氨基庚二酸途径与氨基庚二酸途径与-氨基已二酸途径。前者存在于细氨基已二酸途径。前者存在于细菌、绿藻和高等植物之中，后者存在于酵母霉菌之中。菌、绿藻和高等植物之中，后者存在于酵母霉菌之中。生产上生产上用谷氨酸棒杆菌、北京棒杆菌、黄色短杆菌等用谷氨酸棒杆菌、北京棒杆菌、黄色短杆菌等细菌。细菌。n理想的产生菌应为理想的产生菌应为hom+AECr+AHVr高丝氨酸脱氢酶（高丝氨酸脱氢酶（hom）S-（2-氨基乙基）氨基乙基）-L-半胱氨酸半胱氨酸(AEC)赖氨酸结构类似物赖氨酸结构类似物-氨基氨基-羟基戊酸羟基戊酸(AHV)苏氨酸结构类似物苏氨酸结构类似物第二节第二节 赖氨酸发酵赖氨酸发酵32一、赖氨酸的生物合成途径第二节 赖氨酸发酵323333二、赖氨酸发酵的研究二、赖氨酸发酵的研究1.防止回复突变（第一节已述及）防止回复突变（第一节已述及）2.发酵控制发酵控制（菌种、工艺不同而异）（菌种、工艺不同而异）n碳源：碳源：糖蜜、葡萄糖、蔗糖等。糖蜜、葡萄糖、蔗糖等。n氮源：氮源：硫酸铵、尿素、氨水、玉米浆、麸皮水解液、豆硫酸铵、尿素、氨水、玉米浆、麸皮水解液、豆饼水解液等。饼水解液等。n发酵前期发酵前期：菌体生长期，很少产酸（：菌体生长期，很少产酸（0-20h）。n产酸期：产酸期：至放罐至放罐n工艺控制：工艺控制：温度温度32、补氨控制、补氨控制pH6.5-7.5、种龄和种、种龄和种量、供氧、维生素量、供氧、维生素B1、生物素、营养盐等。、生物素、营养盐等。34二、赖氨酸发酵的研究34n控制氧的重要性：控制氧的重要性：供氧不足，将导致乳酸积累，供氧不足，将导致乳酸积累，并可能导致赖氨酸生产受到不可逆抑制。（与细并可能导致赖氨酸生产受到不可逆抑制。（与细胞膜透性有关）胞膜透性有关）npH控制：控制：补氨补氨n添加某些物质添加某些物质培养基培养基菌种生长代谢状态优菌种生长代谢状态优可以提高可以提高赖氨酸合成量。赖氨酸合成量。第三节 苏氨酸发酵（自学）第四节 异亮氨酸、亮氨酸发酵（自学）35控制氧的重要性：供氧不足，将导致乳酸积累，并可能导致赖氨酸生思考题：思考题：1.氨基酸的生产方法氨基酸的生产方法 2.氨基酸产生菌的选育筛选的关键。氨基酸产生菌的选育筛选的关键。3.筛选氨基酸产生菌的检测方法？请详细叙述。筛选氨基酸产生菌的检测方法？请详细叙述。4.工业生产中某氨基酸高产菌株的筛选，经常选育工业生产中某氨基酸高产菌株的筛选，经常选育其它代谢相关氨基酸营养缺陷型突变株。其选育其它代谢相关氨基酸营养缺陷型突变株。其选育原理是什么（高产原因）？请详细叙述筛选方案。原理是什么（高产原因）？请详细叙述筛选方案。5.细胞透性改变突变株的选育的目的是什么？如何细胞透性改变突变株的选育的目的是什么？如何使产生菌的细胞透性增加？使产生菌的细胞透性增加？6.在氨基酸发酵生产中，一般情况下均使用营养缺在氨基酸发酵生产中，一般情况下均使用营养缺陷型的生产菌株。为了菌株在发酵过程中的稳定陷型的生产菌株。为了菌株在发酵过程中的稳定性，如何防止产生菌发生回复突变？性，如何防止产生菌发生回复突变？36思考题：36谷氨酸棒状杆菌合成谷氨酸的途径谷氨酸棒状杆菌合成谷氨酸的途径葡萄糖葡萄糖中间代谢产物中间代谢产物酮戊二酸酮戊二酸谷氨酸谷氨酸抑制抑制过多过多切断切断减少减少谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶NH4+原因：原因：生物素是生物素是脂肪酸生脂肪酸生物合成中物合成中酶的辅基酶的辅基，此酶，此酶可催化物质反应，最终与可催化物质反应，最终与合成细胞膜磷脂的主要成合成细胞膜磷脂的主要成分分脂肪酸有关。脂肪酸有关。-把把生物素生物素的浓度控制在的浓度控制在亚适量亚适量的情况下，才能分的情况下，才能分泌大量的谷氨酸。泌大量的谷氨酸。改变细胞膜的透性改变细胞膜的透性37谷氨酸棒状杆菌合成谷氨酸的途径葡萄糖中间代谢产物酮戊二酸黄色短杆菌合成赖氨酸的途径黄色短杆菌合成赖氨酸的途径高丝氨酸高丝氨酸脱氢酶脱氢酶天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶天冬氨酸天冬氨酸高丝氨酸高丝氨酸甲硫氨酸甲硫氨酸中间产物中间产物中间产物中间产物苏氨酸苏氨酸 赖氨酸赖氨酸？改变微生物的遗传特性改变微生物的遗传特性-应用应用营养缺陷营养缺陷型型菌株解除反馈调菌株解除反馈调节节 高丝氨酸缺陷型高丝氨酸缺陷型菌株不能合成高丝氨菌株不能合成高丝氨酸酶，故不能合成高酸酶，故不能合成高丝氨酸，也不能合成丝氨酸，也不能合成苏氨酸和甲硫氨酸。苏氨酸和甲硫氨酸。在在补给适量的高丝氨补给适量的高丝氨酸酸的条件下的条件下,就可产生就可产生大量的赖氨酸。大量的赖氨酸。？抑制抑制过量过量苏氨酸苏氨酸 赖氨酸赖氨酸38黄色短杆菌合成赖氨酸的途径高丝氨酸脱氢酶天冬氨酸激酶天冬氨酸影印法影印法完全培养基完全培养基影印接种影印接种基本培养基基本培养基营养缺陷型营养缺陷型39影印法完全培养基影印接种基本培养基营养缺陷型39菌丝 过滤法筛选营养突变株基本培养基 接入微生物孢子 （含营养突变株）涂布均匀后培养长出菌丝体（野生型）菌丝过滤得营养突变株40菌丝 过滤法基本培养基 接入微生物孢子涂布均匀后培养长限量补充培养法 微量蛋白质的完全培养基上 小菌落是营养缺陷型突变株41限量补充培养法 微量蛋白质的完全培养基上41夹层培养法及结果小菌落是第二次长起来的（营养缺陷型）42夹层培养法及结果小菌落是第二次长起来的（营养缺陷型）42 逐个检出法涂布培养基本培养基上不长菌落完全培养基上长出菌落含诱变剂的液体培养基菌种营养缺陷型43 逐个检出法涂布培养基本培养基上不长菌落完全培养基上长出菌落（三）基因突变自发性和不对应性的证明（三）基因突变自发性和不对应性的证明变变 量量 试试 验验 涂涂 布布 试试 验验 影印培养试验影印培养试验 44（三）基因突变自发性和不对应性的证明变 量 试 验 涂 布 大肠杆菌稀释培养物大肠杆菌稀释培养物10ml10ml(培养前先分成培养前先分成50小管小管)(在同一个大管中作整体培养在同一个大管中作整体培养)2 3 7 1 4 4 3 5 抗噬菌体菌落数抗噬菌体菌落数 抗噬菌体菌落数抗噬菌体菌落数变量试验变量试验 甲管甲管乙管乙管噬菌体起淘汰原始未突变株和鉴别抗噬菌体突变株的作用。噬菌体起淘汰原始未突变株和鉴别抗噬菌体突变株的作用。（10mL）（10mL）45大肠杆菌稀释培养物1010(培养前先分成50小管)(在同一个涂布试验涂布试验 涂布敏感菌涂布敏感菌5104个个共共12个平板个平板5104个菌落个菌落5000个细菌个细菌/菌落菌落喷入喷入T1保温保温重新涂布后重新涂布后 喷入喷入T1保温保温6个平板共个平板共353个菌落个菌落 6个平板共个平板共28个菌落个菌落噬菌体的加入只起鉴别抗噬菌体的自发突变是否发生。噬菌体的加入只起鉴别抗噬菌体的自发突变是否发生。E.coli46涂布试验 涂布敏感菌5104个5104个菌落喷入T1保温影印培养影印培养无药无药培养基培养基含药含药培养基培养基影印培养试验影印培养试验 原始敏原始敏感菌种感菌种证明微生物的抗药性突变是在接触药物前自发产生的，证明微生物的抗药性突变是在接触药物前自发产生的，且这一突变与相应的药物毫不相干。且这一突变与相应的药物毫不相干。E.coli47影印培养无药含药影印培养试验 原始敏证明微生物的抗药性突变是