第十二讲蛋白质分子设计课件

第十二讲蛋白质分子设计第十二讲蛋白质分子设计11.蛋白质分子设计的蛋白质分子设计的概念和意义概念和意义2.蛋白质设计的蛋白质设计的分类分类3.蛋白质设计的蛋白质设计的基础基础4.蛋白质分子设计的蛋白质分子设计的流程流程5.蛋白质分子设计蛋白质分子设计思路思路6.本节小结本节小结第一节 概述蛋白质分子设计的概念和意义第一节 概述2一、蛋白质分子设计的概念和意义一、蛋白质分子设计的概念和意义1 1、概念、概念l实现蛋白质实现蛋白质分子改造目标分子改造目标的的一整套方法、计划、措施和指导方针一整套方法、计划、措施和指导方针。l以蛋白质结构和功能的关系为基础，以蛋白质结构和功能的关系为基础，通过通过蛋白质模型蛋白质模型和和结构预测结构预测等方法，等方法，构建构建具有新功能具有新功能的蛋白质的蛋白质模型模型模型模型的技术的技术。l如何理解如何理解？分子设计包括：目标、思想、程序、方法、措施、验证和分析一系列过程。分子设计包括：目标、思想、程序、方法、措施、验证和分析一系列过程。u是蓝图是蓝图 如：建筑工程的设计蓝图如：建筑工程的设计蓝图 宏伟构思和诱人的前景宏伟构思和诱人的前景u是理论是理论 理论上的设计理论上的设计指导实践过程指导实践过程u是实践是实践 实践上的验证实践上的验证提出问题提出问题与建筑工程的蓝图不同与建筑工程的蓝图不同实施验收实施验收(也有豆腐渣工程也有豆腐渣工程不是设计的问题不是设计的问题)是设计是设计实践实践验证验证再设计再设计再实践再实践再验证的过程再验证的过程是一个是一个设计设计验证验证反复进行反复进行的过程。的过程。获得新功能蛋白质分子及其分子模型获得新功能蛋白质分子及其分子模型2 2、意义：（、意义：（通过通过分子设计分子设计、人工改造蛋白）人工改造蛋白）理论上：解析蛋白质结构和功能关系理论上：解析蛋白质结构和功能关系实践上：满足生产实践的需求实践上：满足生产实践的需求一、蛋白质分子设计的概念和意义3蛋白质分子设计蛋白质分子设计蛋白质分子设计蛋白质分子设计是是蛋白质工程领域蛋白质工程领域的的核心问题核心问题与与前沿领域前沿领域是一门新兴的研究领域，是众是一门新兴的研究领域，是众多学科的交叉多学科的交叉多学科的交叉多学科的交叉结构生物学、信息生物学、结构生物学、信息生物学、分子生物学、蛋白质化学、细胞生物学、免疫学等分子生物学、蛋白质化学、细胞生物学、免疫学等随其他学科的发展而不断地发展，其内容也在不断地更新。随其他学科的发展而不断地发展，其内容也在不断地更新。设计和实践成功的实例：设计和实践成功的实例：DNADNA结合蛋白结合蛋白、血红素结合蛋白、氧化还原活性蛋白、血红素结合蛋白、氧化还原活性蛋白理论上：理论上：理论上：理论上：解析解析解析解析蛋白质结构和功能关系蛋白质结构和功能关系蛋白质结构和功能关系蛋白质结构和功能关系？为什么组成天然蛋白质只？为什么组成天然蛋白质只2020种氨基酸，种氨基酸，却具有却具有高度多样性高度多样性，功能如此广泛又各不相同？，功能如此广泛又各不相同？蛋白质一级结构与高级结构的关系？蛋白质一级结构与高级结构的关系？蛋白质高级结构与功能的关系？蛋白质高级结构与功能的关系？蛋白质一级结构与功能的关系？蛋白质一级结构与功能的关系？2、意义、意义理论上理论上：蛋白质分子设计是蛋白质工程领域的核心问题与前沿领域理论上：解4天然蛋白的天然蛋白的缺陷缺陷生物进化过程中，自然选择了生物进化过程中，自然选择了数量众多数量众多、种类各异种类各异的天然蛋白质。的天然蛋白质。天然蛋白质在天然蛋白质在特定特定特定特定的条件下的条件下应用，应用，(适合于生物环境适合于生物环境)改造蛋白的优势改造蛋白的优势工业生产工业生产高温高压条件高温高压条件，其结构和功能改变，其结构和功能改变，达不到理想的效果达不到理想的效果。为了更好地发挥蛋白质的作用，需要对蛋白质进行为了更好地发挥蛋白质的作用，需要对蛋白质进行人为人为改造。改造。如：药物、食品工业和污水处理中的如：药物、食品工业和污水处理中的酶、疫苗、生物传感器酶、疫苗、生物传感器等进行蛋白等进行蛋白分子设计改造，分子设计改造，发挥良好的作用发挥良好的作用。如：经改造如：经改造稳定性好的酶稳定性好的酶，可从，可从价格便宜价格便宜的的棕榈油中棕榈油中生产出生产出价格昂贵价格昂贵的的可可脂可可脂，创造很高的经济效益。，创造很高的经济效益。2、意义、意义实践上：实践上：天然蛋白的缺陷2、意义实践上：5如：荷兰一家公司设计了一种与如：荷兰一家公司设计了一种与漂白剂漂白剂一同起作用一同起作用的的去污酶去污酶（对酶上（对酶上两两个氨基酸个氨基酸修改，使这种酶具有修改，使这种酶具有较高抵抗力）较高抵抗力），在洗涤过程中不受破坏。，在洗涤过程中不受破坏。如：如：医学上医学上，蛋白质工程也具有广泛的应用前景。比如，用人工手段去，蛋白质工程也具有广泛的应用前景。比如，用人工手段去改造改造蛋白质蛋白质，开辟了，开辟了诊断诊断和和治疗癌症治疗癌症的的新新途径。途径。单链抗体单链抗体核素核素免疫影像？免疫影像？单链抗体单链抗体毒素毒素免疫治疗？免疫治疗？我国的蛋白质工程达到我国的蛋白质工程达到国际先进水平国际先进水平，如：重组人胰岛素如：重组人胰岛素和和溶血栓药物溶血栓药物、重组人尿激酶重组人尿激酶等。等。对这些蛋白质改造对这些蛋白质改造离不开离不开蛋白质分子设计。蛋白质分子设计。因此，蛋白质分子设计在因此，蛋白质分子设计在生产实践生产实践中具有重要意义中具有重要意义如：荷兰一家公司设计了一种与漂白剂一同起作用的去污酶（对酶上6 二、蛋白质设计的分类二、蛋白质设计的分类包括包括两种两种分类方式分类方式1 1、根据对蛋白质、根据对蛋白质改造的程度改造的程度分为分为三类三类第一类为第一类为“小改小改”，即通过，即通过定位突变定位突变或或化学修饰化学修饰来实现；来实现；第二类为第二类为“中改中改”，即不同蛋白质的，即不同蛋白质的结构域结构域进行进行拼接拼接组装，改变蛋白组装，改变蛋白质的功能特性的方法；质的功能特性的方法；如：蛋白质融合技术实现如：蛋白质融合技术实现第三类为第三类为“大改大改”，即，即全新设计全新设计具有具有特定功能特定功能的蛋白质的蛋白质仿生仿生2 2、根据、根据改造对象改造对象分为分为两类两类基于天然蛋白质结构的分子设计基于天然蛋白质结构的分子设计全新蛋白质的分子设计全新蛋白质的分子设计3 3、两种分类方法是统一的、两种分类方法是统一的 二、蛋白质设计的分类包括两种分类方式7 三、蛋白质设计的基础三、蛋白质设计的基础u理解（一级结构理解（一级结构高级结构高级结构功能的关系）功能的关系）蛋白质分子设计的基础蛋白质分子设计的基础u理解理解 结构是功能的基础结构是功能的基础蛋白质独特的蛋白质独特的性质和功能性质和功能是其是其特定特定结构的结构的反映反映。1 1、蛋白质、蛋白质、蛋白质、蛋白质一级结构一级结构一级结构一级结构是空间结构的是空间结构的是空间结构的是空间结构的基础基础基础基础（理解（理解2 2点）点）l每一种天然蛋白质生物学活性，决定于蛋白质的每一种天然蛋白质生物学活性，决定于蛋白质的结构结构特点特点20种种aa各具各具特殊特殊的侧链，的侧链，侧链侧链基团的基团的理化性质理化性质和和空间排布空间排布各各不相同不相同，可形成多种，可形成多种多样的多样的空间结构空间结构，具有，具有不同不同生物学活性。生物学活性。一级结构不同，蛋白质功能和活性存在差异，甚至完全不同。一级结构不同，蛋白质功能和活性存在差异，甚至完全不同。l每种蛋白质具有每种蛋白质具有特定的结构，特定的结构，执行其执行其特定的功能特定的功能甚至甚至一级结构上一级结构上个别个别aa变化变化 特定功能的特定功能的丧失或改变丧失或改变。最经典的例子：最经典的例子：镰刀型红细胞贫血病，即患者镰刀型红细胞贫血病，即患者Hb 2条条链链第第6位位GluValGluVal蛋白酶：个别蛋白酶：个别aa突变（关键突变（关键aa），酶活性丧失），酶活性丧失*要求：查找一级结构中个别氨基酸突变蛋白，功能改变的实例要求：查找一级结构中个别氨基酸突变蛋白，功能改变的实例 三、蛋白质设计的基础理解（一级结构高级结构功能的关系）82 2 2 2、蛋白质、蛋白质、蛋白质、蛋白质空间结构空间结构空间结构空间结构直接直接直接直接决定决定决定决定蛋白质的功能蛋白质的功能蛋白质的功能蛋白质的功能l一级结构一级结构不能不能完全完全了解了解蛋白质分子的生物学蛋白质分子的生物学活性活性和理化和理化性质性质多肽链并非呈线形伸展，而是折叠和盘曲多肽链并非呈线形伸展，而是折叠和盘曲构成特有的构成特有的稳定稳定稳定稳定的空间结构的空间结构的空间结构的空间结构蛋白质的蛋白质的生物学活性生物学活性和和理化性质理化性质主要决定于主要决定于空间结构空间结构的完整性的完整性？去折叠去折叠去折叠去折叠变性变性变性变性，一级结构未发生改变一级结构未发生改变功能完全丧失功能完全丧失空间结构的作用空间结构的作用？蛋白质去折叠的方法蛋白质去折叠的方法蛋白质去折叠的方法蛋白质去折叠的方法物理、化学因子物理、化学因子物理、化学因子物理、化学因子l蛋白的性质和功能，很难蛋白的性质和功能，很难仅用仅用蛋白质的蛋白质的一一级结构级结构级结构级结构的排列顺序来的排列顺序来解释解释l理解蛋白理解蛋白空间结构空间结构和和功能关系功能关系对蛋白质对蛋白质分子设计分子设计分子设计分子设计才是才是最重要的最重要的|蛋白质一级结构蛋白质一级结构高级结构高级结构功能关系，是蛋白质分子设计的基础功能关系，是蛋白质分子设计的基础2、蛋白质空间结构直接决定蛋白质的功能9蛋白质分子设计面临的挑战虽然虽然解析解析蛋白质的蛋白质的结构结构逐年增加，但依然逐年增加，但依然无法满足无法满足蛋蛋白质白质分子设计分子设计的需要？的需要？现有现有蛋白质的分子设计蛋白质的分子设计大多数大多数主要依据一级结构主要依据一级结构。一次性成功的把握很小一次性成功的把握很小？蛋白质分子设计面临的挑战虽然解析蛋白质的结构逐年增加，但依然10四、蛋白质分子设计的流程四、蛋白质分子设计的流程u蛋白质分子设计蛋白质分子设计庞大工程庞大工程u蛋白质分子设计程序蛋白质分子设计程序l构建构建原蛋白质模型原蛋白质模型l建立和优化建立和优化突变体突变体模型模型l获得蛋白质的突变体获得蛋白质的突变体l结构和功能分析验证结构和功能分析验证l l新的结构和功能的蛋白质新的结构和功能的蛋白质新的结构和功能的蛋白质新的结构和功能的蛋白质通常，需要几次循环才能达到目的通常，需要几次循环才能达到目的蛋白质分子设计流程蛋白质分子设计流程需要计算机专家、需要计算机专家、X X射线晶体学家、射线晶体学家、蛋白质化学家、生物技术专家相互配合蛋白质化学家、生物技术专家相互配合需要需要理论设计理论设计和和试验过程试验过程相结合，相结合，才能达到改造蛋白质的目的。才能达到改造蛋白质的目的。四、蛋白质分子设计的流程蛋白质分子设计庞大工程蛋白质分子11第十二讲蛋白质分子设计课件121、设计构建蛋白质突变体模型设计构建蛋白质突变体模型设计构建蛋白质突变体模型设计构建蛋白质突变体模型l收集素材收集素材构建构建原蛋白质模型原蛋白质模型：l掌握和了解掌握和了解蛋白质的一级结构、高级结构、功能域，理化特性、蛋白质的一级结构、高级结构、功能域，理化特性、结构和功能的关系、以及结构和功能的关系、以及同源蛋白同源蛋白的相关信息。的相关信息。l数据来源：查阅文献和相关数据库。数据来源：查阅文献和相关数据库。对于已知结构蛋白质，同源建模法或对于已知结构蛋白质，同源建模法或直接构建模型直接构建模型。未知结构的蛋白质，要么未知结构的蛋白质，要么先解析其晶体结构先解析其晶体结构，要么根据，要么根据已知的氨基酸序列已知的氨基酸序列进行结进行结构构预测预测。l设计突变体设计突变体建立突变体模型建立突变体模型借鉴现有的经验（借鉴现有的经验（规则规则）改变蛋白质结构改变蛋白质结构：优化蛋白的：优化蛋白的 稳定性、抗氧化性、对重金属稳定性、稳定性、抗氧化性、对重金属稳定性、pH稳定性、酶学性质稳定性、酶学性质如：如：Hartley等（等（1986年）完成有关蛋白质一些年）完成有关蛋白质一些重要性质的重要性质的设计目标设计目标及及解决办法表解决办法表具有一定的参考价值。具有一定的参考价值。（Next）l考虑不同氨基酸对蛋白质二级结构的影响考虑不同氨基酸对蛋白质二级结构的影响（第七讲结构预测）第七讲结构预测）Chou和和Fasman对对29种蛋白种蛋白一级结构一级结构和和二级结构之间的二级结构之间的关系关系进行统计分析，发现：进行统计分析，发现：a螺旋螺旋最强生成者最强生成者：Glu、Met、Ala、Leu；最强破坏者最强破坏者：Gly、Pro；-折叠最强生成者：折叠最强生成者：Gly、Ala、Ser；-转角最强生成者：转角最强生成者：Gly、Pro、Asp、Ser；最强破坏者：；最强破坏者：Ile、Val、Leu。1、设计构建蛋白质突变体模型13蛋白质重要性质设计目标及解决办法蛋白质重要性质设计目标及解决办法设计目标设计目标解决办法解决办法Hartley et al.（1986）思考：为什么能改善蛋白性质思考：为什么能改善蛋白性质蛋白质重要性质设计目标及解决办法设计目标解决办法Hart142 2、建立和优化突变体模型、建立和优化突变体模型（能量优化以及蛋白质动力学分析）（能量优化以及蛋白质动力学分析）l利用利用能量优化能量优化以及以及蛋白质动力学蛋白质动力学分析的方法分析的方法预测预测 修饰后修饰后的蛋白质的结构的蛋白质的结构 将将预测结构预测结构与原始蛋白质的与原始蛋白质的结构比较结构比较 利用蛋白质结构利用蛋白质结构功能或结构功能或结构稳定性相关知识稳定性相关知识预测新蛋白可能预测新蛋白可能具有的性质和功能具有的性质和功能2、建立和优化突变体模型（能量优化以及蛋白质动力学分析）153 3、获得蛋白质突变体、获得蛋白质突变体蛋白质分子设计蛋白质分子设计仅停留仅停留在在理论层面理论层面上，没有试验证据，这种设计是上，没有试验证据，这种设计是没没有任何意义有任何意义的。的。根据设计，根据设计，合成蛋白质，合成蛋白质，或改造蛋白质突变体的或改造蛋白质突变体的基因序列基因序列，表达突变，表达突变体蛋白，然后分离、纯化得到所要求的蛋白质。体蛋白，然后分离、纯化得到所要求的蛋白质。获得突变体的方法和手段获得突变体的方法和手段（详见：详见：蛋白质纯化与克隆修饰）蛋白质纯化与克隆修饰）分子生物学方法分子生物学方法：获得基因、定点突变、导入宿主细胞、表达基：获得基因、定点突变、导入宿主细胞、表达基因的产物因的产物蛋白质蛋白质分离纯化分离纯化：采用分离纯化的方法：采用分离纯化的方法分离突变蛋白质分离突变蛋白质测试测试3、获得蛋白质突变体164 4、结构和功能分析、结构和功能分析蛋白质分子设计的流程蛋白质分子设计的流程对对纯化纯化的蛋白质突变体进行的蛋白质突变体进行结构和功能结构和功能的的分析和测试分析和测试，与与原原蛋白质比较，是否达到蛋白质比较，是否达到预期预期改造的目的。改造的目的。若得到的蛋白质突变体若得到的蛋白质突变体没有实现预期没有实现预期的功能，则需要的功能，则需要重新设计和改造重新设计和改造；若若达到预期达到预期，则获得一种具有特定功能的，则获得一种具有特定功能的新蛋白新蛋白。蛋白质分子设计是一门蛋白质分子设计是一门试验性试验性科学，是科学，是理论理论设计设计过程与过程与实验过程实验过程相结合相结合的产物。的产物。理论设计理论设计与与实验过程实验过程两部分相辅相成，才构成了蛋白质两部分相辅相成，才构成了蛋白质分子设计的分子设计的全过程。全过程。再深入理解：再深入理解：（符合认识论的过程（符合认识论的过程实践实践认识认识再实践再实践再认识的过程）再认识的过程）学习与知识（学习与知识（知知知知识识识识）的应用过程（掌握规律、利用规律、改造自然、做自然的主人）的应用过程（掌握规律、利用规律、改造自然、做自然的主人）遇到问题、思考问题、采取对策、解决问题的过程遇到问题、思考问题、采取对策、解决问题的过程 做一个实验：设计做一个实验：设计实验实验再设计再设计再实验再实验 任何事情：仅仅停留在理论层面上是任何事情：仅仅停留在理论层面上是毫无意义毫无意义的的!认识具有能动性认识具有能动性意识对物质具有反作用意识对物质具有反作用只要精神不滑坡，办法总比问题多只要精神不滑坡，办法总比问题多体会体会深刻理解：深刻理解：试验性科学试验性科学=理论设计理论设计+实验验证实验验证4、结构和功能分析蛋白质分子设计的流程 蛋白质分子设计是17（一）获得原蛋白质的结构与功能信息（一）获得原蛋白质的结构与功能信息一级和高级结构、功能结构域、同源蛋白、基因、理化性质一级和高级结构、功能结构域、同源蛋白、基因、理化性质 （二）（二）建立原蛋白分子的结构模型建立原蛋白分子的结构模型（原蛋白结构模型）（原蛋白结构模型）模型来源：模型来源：PDBPDB或文献或文献实验测试三维结构实验测试三维结构衍射、衍射、NMRNMR预测：如：同源蛋白进行三维结构预测预测：如：同源蛋白进行三维结构预测 （三）（三）结构模型信息分析结构模型信息分析结构特点结构特点模体模体结构域结构域功能活性区域及分布功能活性区域及分布影响因素影响因素二硫键数目和位置二硫键数目和位置（四）（四）选择设计目标选择设计目标（依据和实践经验）（依据和实践经验）（确定（确定突变位点突变位点或或序列序列，功能区功能区 二硫键二硫键数目和位置）数目和位置）五、设计思路五、设计思路（9 9个步骤个步骤）（一）获得原蛋白质的结构与功能信息五、设计思路（9个步骤）18（五）突变体（序列）设计（五）突变体（序列）设计l设计的原则设计的原则1.1.充分考虑充分考虑氨基酸的氨基酸的极性极性，以，以利于利于形成形成特定特定的的空间结构空间结构-螺旋（螺旋（Leu GluLeu Glu），），-折叠（折叠（Val IleVal Ile），），-转角（转角（Pro Gly Asn)Pro Gly Asn)2.2.充分考虑充分考虑氨基酸的氨基酸的排列排列顺序顺序，以，以利于利于形成形成次级键次级键构成构成空间结构空间结构l设计的基本方法设计的基本方法（下周详细讲述下周详细讲述）1.1.序列最简化法序列最简化法：少数少数几个氨基酸几个氨基酸设计的序列，往往具有一定的设计的序列，往往具有一定的对称性和周期性对称性和周期性，从而减少设计的复杂性，并能检测到一些从而减少设计的复杂性，并能检测到一些蛋白质折叠的规律蛋白质折叠的规律和方式。和方式。2.2.模板组装合成法模板组装合成法：将将各种二级结构片段各种二级结构片段通过通过共价键共价键连接到一个连接到一个刚性的模板刚性的模板分子上，形成一定分子上，形成一定的的三级结构三级结构。绕过绕过了蛋白质三级结构中的了蛋白质三级结构中的氨基酸残基氨基酸残基来研究蛋白质中来研究蛋白质中长程作用力长程作用力，是研，是研究究蛋白质折叠蛋白质折叠和进行蛋白质和进行蛋白质全新设计全新设计规律摸索的规律摸索的有效手段有效手段。（五）突变体（序列）设计19（六）构建和预测突变体模型（六）构建和预测突变体模型初步检验初步检验初步检验初步检验修正设计结构模型修正设计结构模型 二级结构预测方法：二级结构预测方法：依据信息论和概率统计（依据信息论和概率统计（Chou FasmanChou Fasman法；法；GarnierGarnier方法；方法；CohenCohen方法）方法）三级结构预测方法和三级结构预测方法和构象搜索构象搜索方法方法：依据基团之间相互作用的依据基团之间相互作用的能量最低原理能量最低原理 研究者具备的素质：研究者具备的素质：硬件（计算机软件、高质量立场）；软件（结构化学、物化和背景知识）；专业知识硬件（计算机软件、高质量立场）；软件（结构化学、物化和背景知识）；专业知识 （七）获得新设计的蛋白质（七）获得新设计的蛋白质（合成新设计的蛋白质）（合成新设计的蛋白质）l多肽化学合成法（固相合成技术）获得新蛋白质多肽化学合成法（固相合成技术）获得新蛋白质l基因工程手段：基因工程手段：PCRPCR等基因操作等基因操作-构建突变体构建突变体-表达表达-分离纯化分离纯化-新蛋白质。新蛋白质。（八）新蛋白质的检验（八）新蛋白质的检验 是否有多聚态？是否与设计吻合？是否有三级结构？功能活性？是否有多聚态？是否与设计吻合？是否有三级结构？功能活性？（九）完成新蛋白质的设计（九）完成新蛋白质的设计 反复设计反复设计 反复修改反复修改反复试验反复试验 达到预期目标达到预期目标纸上谈兵纸上谈兵纸上谈兵纸上谈兵成本低廉成本低廉成本低廉成本低廉（六）构建和预测突变体模型初步检验修正设计结构模型纸上谈20本节小结本节小结1、蛋白质分子设计：、蛋白质分子设计：通过蛋白质模型和结构预测来构建具有新功能的蛋白质通过蛋白质模型和结构预测来构建具有新功能的蛋白质2 2、分子设计分类：、分子设计分类：根据对蛋白质根据对蛋白质改造的程度、改造的程度、根据根据改造对象改造对象分为分为两类两类不同，蛋白质分子设计不同，蛋白质分子设计分为分为三类三类3、掌握蛋白质分子设计的程序、掌握蛋白质分子设计的程序建模建模 优化优化 获得突变体获得突变体 结构和功能分析结构和功能分析4、掌握蛋白质设计思路、掌握蛋白质设计思路（试验性科学试验性科学=理论设计理论设计+实验过程）实验过程）获得蛋白质结构与功能信息获得蛋白质结构与功能信息建立分子设计的结构模型建立分子设计的结构模型结构模型信息分析结构模型信息分析选择设计目标选择设计目标突变序列设计突变序列设计预测结果预测结果初步检验正确度初步检验正确度修正设计结构模型修正设计结构模型获得新蛋白质（合成新设计的蛋白质）获得新蛋白质（合成新设计的蛋白质）新蛋白质的检验新蛋白质的检验新一轮蛋白质的设计新一轮蛋白质的设计本节小结1、蛋白质分子设计：通过蛋白质模型和结构预测来构建具21第二节第二节 部分氨基酸的突变部分氨基酸的突变部分氨基酸的突变部分氨基酸的突变又称又称“小改小改”，是基于对是基于对已知蛋白质已知蛋白质的局部改造的局部改造。是是目前目前蛋白质工程中使用最广泛的方法。蛋白质工程中使用最广泛的方法。思路思路：设计设计目标目标分子分子基因基因序列或序列或cDNA序列序列定点定点突变突变载体载体系统系统宿主宿主细胞细胞表达表达特定改变特定改变的蛋白质分子的蛋白质分子突变体与野生型蛋白性质突变体与野生型蛋白性质比较比较目的目的：改变蛋白质的改变蛋白质的性质性质和提高蛋白质和提高蛋白质活性活性蛋白质的蛋白质的热稳定热稳定性、性、酸碱稳定性酸碱稳定性、增加增加活性活性、减少减少副作用副作用、提高提高专一性专一性阐明蛋白质的阐明蛋白质的结构和功能结构和功能的关系的关系关键的问题关键的问题：如何恰当地选择要突变的位点（如何恰当地选择要突变的位点（aa残基）。残基）。解决问题的手段解决问题的手段：通过蛋白分子设计通过蛋白分子设计分析蛋白质中分析蛋白质中残基的性质残基的性质，借，借助于已有的蛋白质三维结构或分子模型分析。助于已有的蛋白质三维结构或分子模型分析。（详见以下五方面阐述）（详见以下五方面阐述）第二节 部分氨基酸的突变部分氨基酸的突变又称“小改”，22部分氨基酸改造部分氨基酸改造从以下从以下五方面五方面选择选择“突变突变”位点位点针对不同的针对不同的情况和目的情况和目的，采取，采取5 5种不同的改造方法种不同的改造方法根据根据结构信息结构信息确定突变的位点（碱基）确定突变的位点（碱基）随机突变随机突变 缺失突变和接头分区突变缺失突变和接头分区突变根据蛋白质的根据蛋白质的同源性同源性确定确定功能残基功能残基选择翻译后修饰选择翻译后修饰位点位点突变突变部分氨基酸改造从以下五方面选择“突变”位点23一、根据一、根据结构信息结构信息确定确定突变位点突变位点突变位点突变位点l已知已知高级高级结构结构的蛋白：的蛋白：（X X射线晶体或射线晶体或NMRNMR谱高分辨率）谱高分辨率）u根据氨基酸根据氨基酸残基残基在蛋白质结构上的在蛋白质结构上的位置位置来推测其功能来推测其功能。u如果已知如果已知蛋白质蛋白质及其及其配基复合体配基复合体的结构（包括受体、底物、辅酶和抑制剂），的结构（包括受体、底物、辅酶和抑制剂），掌握了活性掌握了活性部分，对这些部分，对这些aaaa改造，这种方法则更有效。改造，这种方法则更有效。WhyWhy？与配基相互作用（与配基相互作用（形成氢键、离子键或疏水作用）的形成氢键、离子键或疏水作用）的aaaa残基残基，根据其与，根据其与配基基团配基基团的的距离距离和和取向取向而确定而确定突变哪个突变哪个突变哪个突变哪个aaaa。用用定点突变的方式定点突变的方式替换这些残基，验证这些替换这些残基，验证这些残基残基是否参与结合。是否参与结合。l这种方法是理解和证明这种方法是理解和证明酶专一性酶专一性和和催化活性催化活性基础。基础。一、根据结构信息确定突变位点24二、随机突变二、随机突变l l什么是？什么是？什么是？什么是？物理和化学诱变剂物理和化学诱变剂（射线照射、化学试剂）（射线照射、化学试剂）突变株突变株如：如：E.coliE.colil l定向进化技术？定向进化技术？定向进化技术？定向进化技术？体外随机突变体外随机突变体外随机突变体外随机突变l技术优势技术优势：能非常容易地产生大量突变体。：能非常容易地产生大量突变体。l分析原则分析原则：突变分析突变分析l真正真正有功能的保守的有功能的保守的氨基酸氨基酸不能忍受不能忍受不能忍受不能忍受各种类型的突变。各种类型的突变。l如果如果突变突变，仅蛋白分子发生了结构的改变，没有破坏蛋白质的，仅蛋白分子发生了结构的改变，没有破坏蛋白质的功能功能，则该突变位，则该突变位点的残基对点的残基对结构和功能结构和功能的的维系维系可能可能可能可能不是不是很重要的。很重要的。l突变分析的目的突变分析的目的：对突变蛋白分子进行分析，确定对突变蛋白分子进行分析，确定突变位点突变位点和和功能的关系功能的关系突变体突变体制备缺乏控制制备缺乏控制，制备和，制备和分析大量突变体分析大量突变体，才能，才能获得可解释的数据获得可解释的数据如：如：不同位置上不同位置上的氨基酸残基的的氨基酸残基的几种不同的替换几种不同的替换，究竟哪一个是特异性的替换，究竟哪一个是特异性的替换特异特异性地影响蛋白功能性地影响蛋白功能获得新的优良性质的蛋白质获得新的优良性质的蛋白质掌握新蛋白结构和功能的关系掌握新蛋白结构和功能的关系l缺点：缺点：需要获得需要获得大量的分析突变体大量的分析突变体，才能，才能解释究竟解释究竟哪一个突变是特异性哪一个突变是特异性。二、随机突变25 三、缺失突变分析和接头分区突变三、缺失突变分析和接头分区突变用能识别序列中多个位点的限制性内切酶用能识别序列中多个位点的限制性内切酶消化基因，并分离各个片段。消化基因，并分离各个片段。为了产生为了产生分散的分散的缺失缺失缺失缺失，在重新连接之前用，在重新连接之前用外外切核酸酶切核酸酶消化线性消化线性DNADNA。为了产生为了产生分散的分散的插入插入插入插入，可以将合成，可以将合成DNADNA的小的小片段（接头）连接到切割位点上。片段（接头）连接到切割位点上。通过重叠通过重叠PCRPCR方法，分别导入基因中方法，分别导入基因中l缺失突变？基因中缺失突变？基因中缺失缺失1 1个或几个碱基造成的突变。个或几个碱基造成的突变。l接头分区突变？在整个基因各个位置上插入小量的核苷酸，观察蛋白质功能。接头分区突变？在整个基因各个位置上插入小量的核苷酸，观察蛋白质功能。l用途：快速确定用途：快速确定基因编码序列长度基因编码序列长度；功能上；功能上重要的结构域重要的结构域。l操作方法：利用经典的重组操作方法：利用经典的重组DNADNA技术，在体外很容易地构建。技术，在体外很容易地构建。l操作原理：操作原理：转座子诱变也是其中的一种方式转座子诱变也是其中的一种方式 三、缺失突变分析和接头分区突变用能识别序列中多个位点的限制26l举例：举例：基因调节区基因调节区DNA序列序列重要元件重要元件的的定位定位。u如：如：HIV逆转录酶逆转录酶p66亚基亚基（包括两个更小的亚基（包括两个更小的亚基p51和和p15），两），两个小亚基有什么作用呢？用个小亚基有什么作用呢？用接头插入接头插入突变分析。突变分析。u聚合酶功能聚合酶功能 位于位于N端，编码端，编码p51亚基，亚基，RNase H功能则位于功能则位于C端，端，编码编码pl5亚基。亚基。u鉴定鼠和人鉴定鼠和人粒细胞粒细胞巨噬细胞巨噬细胞集落刺激因子集落刺激因子(GM-CSF)关键的关键的活性区域活性区域。l突变突变目的目的：u了解基因的了解基因的长度和不同区域的功能长度和不同区域的功能和作用和作用快速扫描快速扫描编码序列的长度编码序列的长度并并鉴定功能上重要鉴定功能上重要的结构域的结构域，u进一步以进一步以单一氨基酸替换单一氨基酸替换的方法进行的方法进行更精细的分析更精细的分析。举例：基因调节区DNA序列重要元件的定位。27 四、利用蛋白质的四、利用蛋白质的同源性同源性确定功能确定功能残基残基？：通过序列同源性比对分析，确定？：通过序列同源性比对分析，确定突变位点突变位点的方法。的方法。我们知道我们知道每个残基每个残基的的功能功能信息，能够通过比对分析信息，能够通过比对分析不同种属的不同种属的同源同源蛋白质蛋白质的序列获得。的序列获得。两种假设两种假设（用于定点突变技术分析蛋白质）（用于定点突变技术分析蛋白质）同源蛋白结构域中：同源蛋白结构域中：保守的残基保守的残基和和非保守的残基非保守的残基。保守残基保守残基可能参与相同可能参与相同功能功能，或者在维持相同，或者在维持相同结构结构中发挥关键作用。中发挥关键作用。在同源蛋白质中在同源蛋白质中差异很大的残基差异很大的残基可能不重要，或者在蛋白质可能不重要，或者在蛋白质分子分子识识别别方面发挥重要作用方面发挥重要作用。设计实验验证（假设）设计实验验证（假设）四、利用蛋白质的同源性确定功能残基？：通过序列同源性比对分281、保守残基的突变保守残基的突变l蛋白激酶蛋白激酶家族基因分析家族基因分析，2个个Asp完全保守完全保守，Brenner推测有推测有重要作用重要作用，见下图。，见下图。l酵母菌酵母菌突变验证，突变验证，Ala替换替换Asp。替换替换Asp210，kcat下降下降300倍，而与倍，而与底物结合底物结合的的Km值则不受影响值则不受影响。推测推测Asp210 在在催化中催化中发挥基本作用的残基。发挥基本作用的残基。替换替换Asp228，活性，活性完全丧失完全丧失。突变了突变了118个残基，个残基，只有替换只有替换Asp228Asp228，活性的完全丧失，证明了，活性的完全丧失，证明了个残基的个残基的重要性重要性。l哺乳动物哺乳动物cAMP侬赖的蛋白激酶侬赖的蛋白激酶晶体结构的证据，晶体结构的证据，与与Brenner的推测一致。的推测一致。l保守残基的研究对理解保守残基的研究对理解关键氨基酸残基关键氨基酸残基与与蛋白活性蛋白活性关系具有重要的意义关系具有重要的意义Asp210Asp228p1261、保守残基的突变Asp210Asp228p126292、非保守残基的突变、非保守残基的突变在蛋白质家族中，在蛋白质家族中，非保守的非保守的残基残基与与家族成员（包括种属间的变种）的家族成员（包括种属间的变种）的特异性特异性有关，如：病毒的毒力。有关，如：病毒的毒力。用定点突变方式进行替换用定点突变方式进行替换获得很多获得很多生物学活性生物学活性的信息的信息，也可以获得具有也可以获得具有新特异性新特异性的突变体蛋白质。的突变体蛋白质。l举例：举例：脊髓灰质炎病毒（脊髓灰质炎病毒（2种型）：种型）：非毒型（非毒型（I）和和毒型（毒型（II）型诱发型诱发小鼠小鼠脊髓灰质炎，脊髓灰质炎，I型型对小鼠对小鼠无毒性无毒性。型型毒力丧失毒力丧失的的突变体证明：突变体证明：90-10590-105残基负责残基负责型型病毒病毒对小鼠的毒力对小鼠的毒力若将若将型的型的95-104残基残基环区域环区域转移到无毒力的转移到无毒力的I型型毒株中，毒株中，杂合杂合I型毒株型毒株表现出对小鼠的毒力，表现出对小鼠的毒力，表明：脊髓灰质炎病毒表明：脊髓灰质炎病毒识别识别鼠细胞受体，鼠细胞受体，环区环区发挥重要作用。发挥重要作用。2、非保守残基的突变举例：脊髓灰质炎病毒（2种型）：非毒型（30五、翻译后修饰位点突变五、翻译后修饰位点突变为什么要进行翻译后修饰位点的为什么要进行翻译后修饰位点的突变突变？Protein 很多翻译后修饰很多翻译后修饰，（如：磷酸化、糖基化、酰基化、羧基化、甲基化、羟甲基化等等），（如：磷酸化、糖基化、酰基化、羧基化、甲基化、羟甲基化等等）修饰的基团修饰的基团通常通常具有重要的功能，但是除去或改变这些修饰很困难。具有重要的功能，但是除去或改变这些修饰很困难。将修饰位点将修饰位点的的AA定点突变定点突变，除去了修饰，除去了修饰，理解理解蛋白质修饰蛋白质修饰的意义的意义。磷酸化位点磷酸化位点 突变突变：举例：举例酵母酵母 cAMP依赖性依赖性蛋白激酶蛋白激酶全酶全酶是无活性的是无活性的四聚体蛋白四聚体蛋白由由2个催化亚基和个催化亚基和2个调节亚基组成。个调节亚基组成。cAMP与与调节亚基结合调节亚基结合，促进复合体，促进复合体解聚解聚，释放出有，释放出有活性的活性的催化亚基催化亚基。磷酸化磷酸化Thr残基残基，在酶的，在酶的催化亚基（催化亚基（A）和和调节亚基（调节亚基（R）间的相互作用中发挥间的相互作用中发挥重要作用，究竟是否如此？重要作用，究竟是否如此？同源性比对，同源性比对，Thr241是保守是保守AA，重要的磷酸化位点，选择并对其进行突变。，重要的磷酸化位点，选择并对其进行突变。会发生现象？说明什么问题？会发生现象？说明什么问题？会发生现象？说明什么问题？会发生现象？说明什么问题？五、翻译后修饰位点突变为什么要进行翻译后修饰位点的突变？会发31AlaThr241AlaThr241：催化亚基催化亚基对对调节亚基的调节亚基的亲和力大幅下降，而亲和力大幅下降，而不影响不影响催化活性。催化活性。表明：磷酸化表明：磷酸化ThrThr参与参与调节亚基的识别调节亚基的识别功能。功能。Ser Ser Thr241Thr241，对调节亚基亲和力正常，也不影响催化活性。，对调节亚基亲和力正常，也不影响催化活性。表明：磷酸化表明：磷酸化SerSer可以替换磷酸化可以替换磷酸化ThrThr。酸性酸性AAAA（AspAsp和和GluGlu）Thr241Thr241，部分恢复对调节亚基的亲和力。，部分恢复对调节亚基的亲和力。表明：这个位置上存在表明：这个位置上存在带负电荷带负电荷的的基团基团是必需的。是必需的。综上分析综上分析：磷酸化：磷酸化Thr241Thr241非常重要非常重要带负电荷带负电荷的基团是必需的。的基团是必需的。哺乳动物哺乳动物蛋白激酶蛋白激酶的催化亚基的催化亚基晶体结构的解析晶体结构的解析显示：显示：酵母中酵母中Thr241Thr241残基残基磷酸化磷酸化是非常重要的。是非常重要的。催化活性催化活性 +AlaThr241：催化亚基对调节亚基的亲和力大幅下降，而32定点突变改造天然蛋白质定点突变改造天然蛋白质特点特点已有很多成功的实例报道。已有很多成功的实例报道。只对天然蛋白质中只对天然蛋白质中少数的氨基酸残基少数的氨基酸残基进行替换，进行替换，蛋白质的蛋白质的高级结构基本保持高级结构基本保持不变，不变，对蛋白质功能的对蛋白质功能的改造改造极为极为有限有限。需要采用其它方法：定点突变改造天然蛋白质特点需要采用其它方法：33本节小结本节小结u重点介绍了重点介绍了 部分氨基酸的改造部分氨基酸的改造u依据不同情况和目的不同，在五方面依据不同情况和目的不同，在五方面设计设计进行蛋白质部分氨基酸的改造进行蛋白质部分氨基酸的改造根据根据结构信息结构信息确定碱基突变确定碱基突变随机突变随机突变理化诱变的方法理化诱变的方法 缺失突变分析和接头分区突变缺失突变分析和接头分区突变利用蛋白质的利用蛋白质的同源性同源性确定功能残基确定功能残基翻译后修饰翻译后修饰位点位点突变突变重点在理解蛋白质的重点在理解蛋白质的结构结构和功能关系和功能关系具有重要意义具有重要意义本节小结重点介绍了 部分氨基酸的改造重点在理解蛋白质的结构和34