蛋白质的基本机构和功能培训课件

蛋白质的基本机构和功能主主 要要 内内 容容蛋白质的分子组成蛋白质的分子组成蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化2 2蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能蛋白质蛋白质(Protein)(Protein)的种类繁多的种类繁多大肠杆菌约含蛋白质大肠杆菌约含蛋白质大肠杆菌约含蛋白质大肠杆菌约含蛋白质3 0003 000种，人体内含蛋白质种，人体内含蛋白质种，人体内含蛋白质种，人体内含蛋白质1010万万万万余种。余种。余种。余种。蛋白质是细胞中含量最丰富的生物大分子蛋白质是细胞中含量最丰富的生物大分子约占人体固体成分的约占人体固体成分的约占人体固体成分的约占人体固体成分的45%45%，可达细胞干重的，可达细胞干重的，可达细胞干重的，可达细胞干重的70%70%。3 3蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能 蛋白质是生命的物质基础蛋白质是生命的物质基础1.1.1.1.催化功能催化功能催化功能催化功能2.2.2.2.调节功能调节功能调节功能调节功能3.3.3.3.支持功能支持功能支持功能支持功能4.4.4.4.运输功能运输功能运输功能运输功能5.5.5.5.营养功能营养功能营养功能营养功能6.6.6.6.运动功能运动功能运动功能运动功能7.7.7.7.防御功能防御功能防御功能防御功能8.8.8.8.识别功能识别功能识别功能识别功能9.9.9.9.信息传递功能信息传递功能信息传递功能信息传递功能10.10.10.10.凝血与抗凝血功能凝血与抗凝血功能凝血与抗凝血功能凝血与抗凝血功能 蛋白质的生物学功能蛋白质的生物学功能蛋白质的生物学功能蛋白质的生物学功能4 4蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能第一节第一节 蛋白质的分子组成蛋白质的分子组成5 5蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能C 5055%C 5055%H 67%H 67%O 1924%O 1924%N 1319%N 1319%S 04%S 04%有些蛋白质还含有有些蛋白质还含有有些蛋白质还含有有些蛋白质还含有P P、FeFe、CuCu、MnMn、ZnZn、SeSe等。等。等。等。各种蛋白质含氮量接近，平均为各种蛋白质含氮量接近，平均为各种蛋白质含氮量接近，平均为各种蛋白质含氮量接近，平均为16%16%；样品测定样品测定样品测定样品测定中中中中1 1克克克克氮相当于含氮相当于含氮相当于含氮相当于含6.256.25克克克克蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质（凯氏定氮法凯氏定氮法凯氏定氮法凯氏定氮法）。一、蛋白质的元素组成一、蛋白质的元素组成6 6蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能二、蛋白质的基本组成单位二、蛋白质的基本组成单位氨基酸氨基酸蛋白质受酸、碱或蛋白酶水解产生蛋白质受酸、碱或蛋白酶水解产生游离氨基酸。因此，游离氨基酸。因此，组成蛋白质的基本组成蛋白质的基本单位是单位是氨基酸氨基酸(amino acid)(amino acid)。7 7蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能（一）氨基酸的分类（一）氨基酸的分类 根据根据根据根据RR侧链基团的结构和性质的不同，可将侧链基团的结构和性质的不同，可将侧链基团的结构和性质的不同，可将侧链基团的结构和性质的不同，可将20202020种氨基酸分为种氨基酸分为种氨基酸分为种氨基酸分为4 4 4 4类：类：类：类：1.1.1.1.非极性疏水性非极性疏水性非极性疏水性非极性疏水性氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸 2.2.2.2.极性中性氨基酸极性中性氨基酸极性中性氨基酸极性中性氨基酸 3.3.3.3.酸性氨基酸酸性氨基酸酸性氨基酸酸性氨基酸 4.4.4.4.碱性氨基酸碱性氨基酸碱性氨基酸碱性氨基酸8 8蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能 1.1.1.1.非极性疏水氨基酸非极性疏水氨基酸非极性疏水氨基酸非极性疏水氨基酸 侧链为烃基、吲哚环、侧链为烃基、吲哚环、侧链为烃基、吲哚环、侧链为烃基、吲哚环、甲硫基等疏水性基团。这类氨基酸在水中的溶解度甲硫基等疏水性基团。这类氨基酸在水中的溶解度甲硫基等疏水性基团。这类氨基酸在水中的溶解度甲硫基等疏水性基团。这类氨基酸在水中的溶解度小于极性中性氨基酸。小于极性中性氨基酸。小于极性中性氨基酸。小于极性中性氨基酸。2.2.2.2.极性中性氨基酸极性中性氨基酸极性中性氨基酸极性中性氨基酸 侧链为羟基、巯基、或酰侧链为羟基、巯基、或酰侧链为羟基、巯基、或酰侧链为羟基、巯基、或酰氨基等极性基团，有亲水性，但在中性水溶液中不氨基等极性基团，有亲水性，但在中性水溶液中不氨基等极性基团，有亲水性，但在中性水溶液中不氨基等极性基团，有亲水性，但在中性水溶液中不电离的氨基酸。电离的氨基酸。电离的氨基酸。电离的氨基酸。9 9蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能 3.3.3.3.酸性氨基酸酸性氨基酸酸性氨基酸酸性氨基酸 侧链上有羧基，在水溶液中侧链上有羧基，在水溶液中侧链上有羧基，在水溶液中侧链上有羧基，在水溶液中能释放出能释放出能释放出能释放出HH+而带负电荷的氨基酸。有而带负电荷的氨基酸。有而带负电荷的氨基酸。有而带负电荷的氨基酸。有谷氨酸谷氨酸谷氨酸谷氨酸、天天天天冬氨酸冬氨酸冬氨酸冬氨酸。4.4.4.4.碱性氨基酸碱性氨基酸碱性氨基酸碱性氨基酸 侧链上有氨基、胍基或咪唑基，侧链上有氨基、胍基或咪唑基，侧链上有氨基、胍基或咪唑基，侧链上有氨基、胍基或咪唑基，在水溶液中能结合在水溶液中能结合在水溶液中能结合在水溶液中能结合HH+而带正电荷的氨基酸。有而带正电荷的氨基酸。有而带正电荷的氨基酸。有而带正电荷的氨基酸。有赖氨赖氨赖氨赖氨酸酸酸酸、精氨酸精氨酸精氨酸精氨酸和和和和组氨酸组氨酸组氨酸组氨酸等。等。等。等。1010蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能POLARNON-POLARTyrHisGlyAcidicNeutralBasicAspGluGlnCysAsnSerThrLysArgAlaValIleLeuMetPheTrpPro氨基酸按照极性分类氨基酸按照极性分类氨基酸按照极性分类氨基酸按照极性分类极性或非极性，是氨基酸性质的基础极性或非极性，是氨基酸性质的基础极性或非极性，是氨基酸性质的基础极性或非极性，是氨基酸性质的基础1111蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能Leu L-C-C-CONH2-C-CONH2-C-COOH-C-C-COOH-H-CH3-C-OH-C-SH-C-C-S-CPPro-C-CCNN+-C-C-C-C-NH3+-C-C-OH-C-NSouthlineCircularlineCentrallineNorthwestlineAliphaticAmideAcidicImino,CircularBasicSulfurHydroxyAromatic-C-C-C-N-C-NN+=C-C-C-CC-C-C-CCC-CCCCHNC-COOHa-C-COHGln QAsp DGlu EPhe FArg RLys KHis HGly GAAAlaVValIIleSer SThr TCys C氨基酸代谢图Trp WNon-polarPolarArg RTyr YAsn NMet M1212蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能(二二)氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质1.1.1.1.物理性质物理性质物理性质物理性质 都是白色晶体，熔点较高。能溶于强酸和强都是白色晶体，熔点较高。能溶于强酸和强都是白色晶体，熔点较高。能溶于强酸和强都是白色晶体，熔点较高。能溶于强酸和强碱溶液；在水中的溶解度各不相同。碱溶液；在水中的溶解度各不相同。碱溶液；在水中的溶解度各不相同。碱溶液；在水中的溶解度各不相同。2.2.2.2.两性解离与等电点两性解离与等电点两性解离与等电点两性解离与等电点 氨基酸是两性电解质，其解离方式取决于所氨基酸是两性电解质，其解离方式取决于所氨基酸是两性电解质，其解离方式取决于所氨基酸是两性电解质，其解离方式取决于所处溶液的酸碱度。处溶液的酸碱度。处溶液的酸碱度。处溶液的酸碱度。1313蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能氨基酸的等电点氨基酸的等电点（isoelectric point,pI)在某一在某一在某一在某一pHpH溶液中，氨基酸解离成阳离子和溶液中，氨基酸解离成阳离子和溶液中，氨基酸解离成阳离子和溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为阴离子的趋势及程度相等，成为阴离子的趋势及程度相等，成为阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子兼性离子兼性离子兼性离子，呈电，呈电，呈电，呈电中性，此时溶液的中性，此时溶液的中性，此时溶液的中性，此时溶液的pHpH称为该蛋白质的称为该蛋白质的称为该蛋白质的称为该蛋白质的等电点等电点等电点等电点。1414蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能 3 3 3 3.紫外吸收性质紫外吸收性质紫外吸收性质紫外吸收性质 色氨酸、酪氨酸色氨酸、酪氨酸色氨酸、酪氨酸色氨酸、酪氨酸和和和和苯丙氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸对紫外光有吸对紫外光有吸对紫外光有吸对紫外光有吸 收作用。其最大吸收峰在收作用。其最大吸收峰在收作用。其最大吸收峰在收作用。其最大吸收峰在280280280280nmnm附近，以色氨酸附近，以色氨酸附近，以色氨酸附近，以色氨酸吸收最强。吸收最强。吸收最强。吸收最强。利用此性质可采用紫外分分光度法测定溶利用此性质可采用紫外分分光度法测定溶利用此性质可采用紫外分分光度法测定溶利用此性质可采用紫外分分光度法测定溶液中蛋白质的含量。液中蛋白质的含量。液中蛋白质的含量。液中蛋白质的含量。1515蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能4 4 4 4.氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应（1 1 1 1）茚三酮反应）茚三酮反应）茚三酮反应）茚三酮反应 氨基酸与水合茚三酮在溶液中共热，发氨基酸与水合茚三酮在溶液中共热，发氨基酸与水合茚三酮在溶液中共热，发氨基酸与水合茚三酮在溶液中共热，发生一系列反应，生成生一系列反应，生成生一系列反应，生成生一系列反应，生成蓝紫色蓝紫色蓝紫色蓝紫色化合物，其最大化合物，其最大化合物，其最大化合物，其最大吸收峰在吸收峰在吸收峰在吸收峰在570570570570nmnmnmnm。此反应可用于氨基酸的定性此反应可用于氨基酸的定性此反应可用于氨基酸的定性此反应可用于氨基酸的定性和定量分析。和定量分析。和定量分析。和定量分析。注：脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮反应产生注：脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮反应产生注：脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮反应产生注：脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮反应产生 黄色黄色黄色黄色化合物。化合物。化合物。化合物。1616蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能氨氨基基酸酸分分析析仪仪图图解解AspThrThrLysGlyGluSerProAlaCysValMetIleLeuTyrPheHisNH3Arg0.20.41.00.60.8光光吸吸收收流出液流出液(mL)15cm柱柱，pH3.25，0.067mol/L柠檬酸钠柠檬酸钠15cm柱柱，pH4.25，0.067mol/L柠檬酸钠柠檬酸钠15cm柱柱，pH5.25，0.12mol/L柠檬酸钠柠檬酸钠缓冲液泵缓冲液泵显色反显色反应管应管茚三酮泵茚三酮泵已分开的已分开的氨基酸氨基酸离子交换柱离子交换柱样品注入口样品注入口记录仪记录仪光电倍光电倍增管增管光源光源1717蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能（2 2 2 2）与亚硝酸反应）与亚硝酸反应）与亚硝酸反应）与亚硝酸反应:Van Slyke Van Slyke Van Slyke Van Slyke 法测定氨基酸法测定氨基酸法测定氨基酸法测定氨基酸 氨基酸的氨基在室温下与亚硝酸作用，生成氨基酸的氨基在室温下与亚硝酸作用，生成氨基酸的氨基在室温下与亚硝酸作用，生成氨基酸的氨基在室温下与亚硝酸作用，生成氮气氮气氮气氮气。通过在标准条件下测定生成的氮气体积，。通过在标准条件下测定生成的氮气体积，。通过在标准条件下测定生成的氮气体积，。通过在标准条件下测定生成的氮气体积，即可计算出氨基酸的量。即可计算出氨基酸的量。即可计算出氨基酸的量。即可计算出氨基酸的量。生成的氮气只有生成的氮气只有生成的氮气只有生成的氮气只有一半一半一半一半来自氨基酸。来自氨基酸。来自氨基酸。来自氨基酸。可用于氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定。可用于氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定。可用于氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定。可用于氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定。1818蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能（3 3 3 3）桑格（）桑格（）桑格（）桑格（Sanger)Sanger)Sanger)Sanger)反应反应反应反应 氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸的的的的NHNHNHNH2 2 2 2与与与与2 2 2 2，4 4 4 4一一一一二二二二硝硝硝硝基基基基氟氟氟氟苯苯苯苯（DNFBDNFBDNFBDNFB）反反反反应应应应，生生生生成成成成DNP-DNP-DNP-DNP-氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸；黄黄黄黄色色色色，提提提提取取取取、层层层层析析析析法法法法鉴鉴鉴鉴定定定定来来来来测测测测定氨基酸。定氨基酸。定氨基酸。定氨基酸。1919蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能（4 4 4 4）丹磺酰氯（）丹磺酰氯（）丹磺酰氯（）丹磺酰氯（DNS-ClDNS-ClDNS-ClDNS-Cl）反应）反应）反应）反应 氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸的的的的NHNHNHNH2 2 2 2与与与与DNSDNSDNSDNS反反反反应应应应；由由由由于于于于丹丹丹丹磺磺磺磺酰酰酰酰氯氯氯氯基基基基具具具具有有有有强强强强烈烈烈烈的的的的荧荧荧荧光光光光，灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度比比比比DNFBDNFBDNFBDNFB法法法法高高高高100100100100倍倍倍倍，并并并并且且且且水水水水解解解解后后后后的的的的DNSDNSDNSDNS氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸不不不不需需需需要要要要提提提提取取取取，可可可可直直直直接接接接用用用用纸纸纸纸电泳或薄层层析加以鉴定。电泳或薄层层析加以鉴定。电泳或薄层层析加以鉴定。电泳或薄层层析加以鉴定。2020蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能(5)(5)(5)(5)埃埃埃埃德德德德曼曼曼曼反反反反应应应应(Edman Edman Edman Edman reactionreactionreactionreaction）苯异硫氰酸酯，苯异硫氰酸酯，苯异硫氰酸酯，苯异硫氰酸酯，PITC PITC PITC PITC 苯苯苯苯 乙乙乙乙 内内内内 酰酰酰酰 硫硫硫硫 脲脲脲脲 衍衍衍衍 生生生生 物物物物（PTH-PTH-PTH-PTH-氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸），无无无无色色色色，可以用层析法分离鉴定。可以用层析法分离鉴定。可以用层析法分离鉴定。可以用层析法分离鉴定。被被被被EdmanEdmanEdmanEdman用来鉴定多肽的用来鉴定多肽的用来鉴定多肽的用来鉴定多肽的NHNHNHNH2 2 2 2末端氨基酸末端氨基酸末端氨基酸末端氨基酸2121蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能三、氨基酸在蛋白质分子中的连接方式三、氨基酸在蛋白质分子中的连接方式（一）肽键和肽（一）肽键和肽肽键（肽键（肽键（肽键（peptide bond)peptide bond)peptide bond)peptide bond)是由一个氨基酸分是由一个氨基酸分是由一个氨基酸分是由一个氨基酸分子的子的子的子的-羧基与另一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合氨基脱水缩合氨基脱水缩合氨基脱水缩合形成的化学键。形成的化学键。形成的化学键。形成的化学键。2222蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能2323蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能命名、编号命名、编号2424蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能第二节第二节 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构2525蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能蛋白质是由许多蛋白质是由许多蛋白质是由许多蛋白质是由许多氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸单位通过单位通过单位通过单位通过肽键肽键肽键肽键连接形成连接形成连接形成连接形成的具有特定分子结构的高分子化合物。的具有特定分子结构的高分子化合物。的具有特定分子结构的高分子化合物。的具有特定分子结构的高分子化合物。蛋白质的分子结构可分为蛋白质的分子结构可分为蛋白质的分子结构可分为蛋白质的分子结构可分为一级一级一级一级、二级二级二级二级、三级三级三级三级和和和和四级四级四级四级。一级结构是蛋白质的基本结构，二级、。一级结构是蛋白质的基本结构，二级、。一级结构是蛋白质的基本结构，二级、。一级结构是蛋白质的基本结构，二级、三级、四级结构称为高级或空间构象。三级、四级结构称为高级或空间构象。三级、四级结构称为高级或空间构象。三级、四级结构称为高级或空间构象。2626蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能一、蛋白质的一级结构一、蛋白质的一级结构 概念概念概念概念 是指蛋白质分子中氨基酸的排列顺序是指蛋白质分子中氨基酸的排列顺序是指蛋白质分子中氨基酸的排列顺序是指蛋白质分子中氨基酸的排列顺序。主要的化学键主要的化学键主要的化学键主要的化学键 肽键肽键肽键肽键、有些蛋白质还含有有些蛋白质还含有有些蛋白质还含有有些蛋白质还含有二硫键二硫键二硫键二硫键。一级结构是决定蛋白质空间构象和特异生物学功能的一级结构是决定蛋白质空间构象和特异生物学功能的一级结构是决定蛋白质空间构象和特异生物学功能的一级结构是决定蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础，但不是决定蛋白质空间构象唯一因素。基础，但不是决定蛋白质空间构象唯一因素。基础，但不是决定蛋白质空间构象唯一因素。基础，但不是决定蛋白质空间构象唯一因素。2727蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能 二、蛋白质的空间结构二、蛋白质的空间结构空间结构空间结构空间结构空间结构 指蛋白质分子内指蛋白质分子内指蛋白质分子内指蛋白质分子内各原子各原子各原子各原子围绕某些围绕某些围绕某些围绕某些共共共共 价键价键价键价键的旋转而形成的各种的旋转而形成的各种的旋转而形成的各种的旋转而形成的各种空间排布空间排布空间排布空间排布及及及及相互关系相互关系相互关系相互关系，称为蛋白质的构象。称为蛋白质的构象。称为蛋白质的构象。称为蛋白质的构象。蛋白质的构象分为蛋白质的构象分为蛋白质的构象分为蛋白质的构象分为主链构象主链构象主链构象主链构象和和和和侧链构象侧链构象侧链构象侧链构象。2828蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能（一）蛋白质的二级结构（一）蛋白质的二级结构 概念概念概念概念 是指蛋白质多肽链是指蛋白质多肽链是指蛋白质多肽链是指蛋白质多肽链主链主链主链主链原子原子原子原子局部局部局部局部的空间排列，的空间排列，的空间排列，的空间排列，不涉及氨基酸残基侧链的构象。不涉及氨基酸残基侧链的构象。不涉及氨基酸残基侧链的构象。不涉及氨基酸残基侧链的构象。维系蛋白质二级结构的主要化学键是维系蛋白质二级结构的主要化学键是维系蛋白质二级结构的主要化学键是维系蛋白质二级结构的主要化学键是氢键氢键氢键氢键。2929蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能 2 2.蛋白质二级结构的主要形式蛋白质二级结构的主要形式-螺旋螺旋-折叠折叠-转角转角无规卷曲无规卷曲3030蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能（1 1）-螺旋螺旋3131蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能-螺旋的结构特点螺旋的结构特点 多肽链以肽键平面为单位，多肽链以肽键平面为单位，多肽链以肽键平面为单位，多肽链以肽键平面为单位，-碳原子为碳原子为碳原子为碳原子为转折点，有规律的盘绕成转折点，有规律的盘绕成转折点，有规律的盘绕成转折点，有规律的盘绕成右手螺旋右手螺旋右手螺旋右手螺旋结构。结构。结构。结构。每每每每3.63.6个个个个氨基酸残基盘绕一圈，螺距为氨基酸残基盘绕一圈，螺距为氨基酸残基盘绕一圈，螺距为氨基酸残基盘绕一圈，螺距为0.540.54nmnm。相邻螺旋的肽键之间形成相邻螺旋的肽键之间形成相邻螺旋的肽键之间形成相邻螺旋的肽键之间形成氢键氢键氢键氢键，方向与长，方向与长，方向与长，方向与长轴基本平行，维持螺旋的稳定。轴基本平行，维持螺旋的稳定。轴基本平行，维持螺旋的稳定。轴基本平行，维持螺旋的稳定。R R基团伸向螺旋基团伸向螺旋基团伸向螺旋基团伸向螺旋外侧外侧外侧外侧，其大小、形状及电荷，其大小、形状及电荷，其大小、形状及电荷，其大小、形状及电荷性质均影响性质均影响性质均影响性质均影响-螺旋的形成。螺旋的形成。螺旋的形成。螺旋的形成。3232蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能（2 2）-折叠折叠3333蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能 -折叠的结构特点折叠的结构特点 多肽链呈多肽链呈多肽链呈多肽链呈伸展状态伸展状态伸展状态伸展状态，肽键平面沿长轴折叠呈，肽键平面沿长轴折叠呈，肽键平面沿长轴折叠呈，肽键平面沿长轴折叠呈锯齿状锯齿状锯齿状锯齿状，两平面间夹角为，两平面间夹角为，两平面间夹角为，两平面间夹角为110110110110，R R R R基交替地伸向锯基交替地伸向锯基交替地伸向锯基交替地伸向锯齿状结构的上下方。齿状结构的上下方。齿状结构的上下方。齿状结构的上下方。若干肽段互相靠拢，平行排列，通过若干肽段互相靠拢，平行排列，通过若干肽段互相靠拢，平行排列，通过若干肽段互相靠拢，平行排列，通过氢键氢键氢键氢键连连连连接。氢键的方向与长轴垂直。接。氢键的方向与长轴垂直。接。氢键的方向与长轴垂直。接。氢键的方向与长轴垂直。若两条肽段走向一致（若两条肽段走向一致（若两条肽段走向一致（若两条肽段走向一致（N N N N端、端、端、端、C C C C端方向相同）端方向相同）端方向相同）端方向相同），称为，称为，称为，称为顺向平行顺向平行顺向平行顺向平行；反之，称之为；反之，称之为；反之，称之为；反之，称之为逆向平行逆向平行逆向平行逆向平行，逆向更，逆向更，逆向更，逆向更稳定。稳定。稳定。稳定。3434蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能-折叠包括平行式和反平行式两种类型折叠包括平行式和反平行式两种类型3535蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能（3 3）-转角转角3636蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能 -转角的特点转角的特点 主链骨架本身以大约主链骨架本身以大约主链骨架本身以大约主链骨架本身以大约180180回折回折回折回折 回折部分通常由回折部分通常由回折部分通常由回折部分通常由4 4个氨基酸残基构成个氨基酸残基构成个氨基酸残基构成个氨基酸残基构成 构象依靠第构象依靠第构象依靠第构象依靠第一一一一残基的残基的残基的残基的-COCO基与第基与第基与第基与第四四四四残基的残基的残基的残基的-NHNH基之间形成氢键来维系。基之间形成氢键来维系。基之间形成氢键来维系。基之间形成氢键来维系。3737蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能 （4 4）无规卷曲）无规卷曲是指多肽链中除了以上几种比较规则是指多肽链中除了以上几种比较规则的构象外，其余的构象外，其余没有没有确定确定规律性规律性的那部分的那部分肽链构象。肽链构象。3838蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能3939蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能（二）蛋白质的三级结构（二）蛋白质的三级结构概念概念概念概念 是指是指是指是指整条肽链中所有原子的空间排布，它包整条肽链中所有原子的空间排布，它包整条肽链中所有原子的空间排布，它包整条肽链中所有原子的空间排布，它包括主链构象和侧链构象括主链构象和侧链构象括主链构象和侧链构象括主链构象和侧链构象。主要化学键主要化学键主要化学键主要化学键 疏水键疏水键疏水键疏水键、氢键、盐键、氢键、盐键、氢键、盐键、氢键、盐键等非共价键和等非共价键和等非共价键和等非共价键和二硫键二硫键二硫键二硫键。疏。疏。疏。疏水键是维持三级结构稳定的最主要作用力。水键是维持三级结构稳定的最主要作用力。水键是维持三级结构稳定的最主要作用力。水键是维持三级结构稳定的最主要作用力。4040蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能结构域（结构域（domain）分子量大的蛋白质在形成三级结构时，肽链分子量大的蛋白质在形成三级结构时，肽链分子量大的蛋白质在形成三级结构时，肽链分子量大的蛋白质在形成三级结构时，肽链中某些局部的二级结构汇集在一起，形成发挥生中某些局部的二级结构汇集在一起，形成发挥生中某些局部的二级结构汇集在一起，形成发挥生中某些局部的二级结构汇集在一起，形成发挥生物学功能的特定区域，称为结构域物学功能的特定区域，称为结构域物学功能的特定区域，称为结构域物学功能的特定区域，称为结构域。纤连蛋白纤连蛋白纤连蛋白纤连蛋白(fibronectin)(fibronectin)(fibronectin)(fibronectin)4141蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能由一条多肽链形成的蛋白质，其最高级结由一条多肽链形成的蛋白质，其最高级结构为三级结构。只有具有三级结构的蛋白构为三级结构。只有具有三级结构的蛋白质才具有生物学活性。质才具有生物学活性。4242蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能 （三）蛋白质的四级结构（三）蛋白质的四级结构 许多蛋白质分子是由两条或两条以上具有独许多蛋白质分子是由两条或两条以上具有独许多蛋白质分子是由两条或两条以上具有独许多蛋白质分子是由两条或两条以上具有独立三级结构的多肽链通过非共价键聚合而成，其中立三级结构的多肽链通过非共价键聚合而成，其中立三级结构的多肽链通过非共价键聚合而成，其中立三级结构的多肽链通过非共价键聚合而成，其中每条具有独立三级结构的多肽链称为亚基。每条具有独立三级结构的多肽链称为亚基。每条具有独立三级结构的多肽链称为亚基。每条具有独立三级结构的多肽链称为亚基。概念概念概念概念 蛋白质分子中各亚基之间的空间排布和相互接蛋白质分子中各亚基之间的空间排布和相互接蛋白质分子中各亚基之间的空间排布和相互接蛋白质分子中各亚基之间的空间排布和相互接触关系。触关系。触关系。触关系。化学键化学键化学键化学键 氢键、盐键、范氏引力、疏水键等非共价键。氢键、盐键、范氏引力、疏水键等非共价键。氢键、盐键、范氏引力、疏水键等非共价键。氢键、盐键、范氏引力、疏水键等非共价键。4343蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能 蛋白质结构中应注意的几个问题蛋白质结构中应注意的几个问题由一条多肽链形成的蛋白质其最高级结构为三由一条多肽链形成的蛋白质其最高级结构为三由一条多肽链形成的蛋白质其最高级结构为三由一条多肽链形成的蛋白质其最高级结构为三级，具有级，具有级，具有级，具有三级结构三级结构三级结构三级结构的蛋白质的蛋白质的蛋白质的蛋白质才具有生物学活性才具有生物学活性才具有生物学活性才具有生物学活性。形成蛋白质的形成蛋白质的形成蛋白质的形成蛋白质的四级四级四级四级结构结构结构结构至少至少至少至少要有要有要有要有两条两条两条两条多肽链。多肽链。多肽链。多肽链。两条或两条或两条或两条或两条两条两条两条以上的以上的以上的以上的多肽链多肽链多肽链多肽链靠靠靠靠共价键共价键共价键共价键连接的蛋白质连接的蛋白质连接的蛋白质连接的蛋白质没有没有没有没有四级结构。四级结构。四级结构。四级结构。由一条多肽链形成的蛋白质与亚基不同。由一条多肽链形成的蛋白质与亚基不同。由一条多肽链形成的蛋白质与亚基不同。由一条多肽链形成的蛋白质与亚基不同。4444蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能三、蛋白质的结构与功能三、蛋白质的结构与功能蛋白质一级结构与功能的关系蛋白质一级结构与功能的关系 一级结构决定蛋白质的空间结构；一级结构决定蛋白质的空间结构；一级结构决定蛋白质的空间结构；一级结构决定蛋白质的空间结构；一级结构决定蛋白质的生物学功能。一级结构决定蛋白质的生物学功能。一级结构决定蛋白质的生物学功能。一级结构决定蛋白质的生物学功能。蛋白质空间结构与功能的关系蛋白质空间结构与功能的关系 蛋白质构象是其生物学功能的基础，蛋白质构象是其生物学功能的基础，蛋白质构象是其生物学功能的基础，蛋白质构象是其生物学功能的基础，构象改变功能改变。构象改变功能改变。构象改变功能改变。构象改变功能改变。4545蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能第三节 蛋白质的理化性质4646蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能一、蛋白质的两性解离与等电点一、蛋白质的两性解离与等电点1 1.蛋白质是两性电解质蛋白质是两性电解质 蛋白质分子中可解离的基团蛋白质分子中可解离的基团蛋白质分子中可解离的基团蛋白质分子中可解离的基团 多肽两端游离的多肽两端游离的多肽两端游离的多肽两端游离的-氨基和氨基和氨基和氨基和-羧基羧基羧基羧基 多肽侧链多肽侧链多肽侧链多肽侧链R R R R上解离的基团上解离的基团上解离的基团上解离的基团 决定蛋白质解离成正负离子的因素决定蛋白质解离成正负离子的因素决定蛋白质解离成正负离子的因素决定蛋白质解离成正负离子的因素 蛋白质所含酸性和碱性基团的数目蛋白质所含酸性和碱性基团的数目蛋白质所含酸性和碱性基团的数目蛋白质所含酸性和碱性基团的数目 蛋白质所在溶液的蛋白质所在溶液的蛋白质所在溶液的蛋白质所在溶液的pHpHpHpH值值值值4747蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能2 2.蛋白质的等电点（蛋白质的等电点（pI）当蛋白质溶液处于某一当蛋白质溶液处于某一当蛋白质溶液处于某一当蛋白质溶液处于某一pHpHpHpH时，蛋白质解离时，蛋白质解离时，蛋白质解离时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为成正、负离子的趋势相等，即成为成正、负离子的趋势相等，即成为成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子兼性离子兼性离子兼性离子，净电荷为零，此时溶液的净电荷为零，此时溶液的净电荷为零，此时溶液的净电荷为零，此时溶液的pHpHpHpH称为蛋白质的称为蛋白质的称为蛋白质的称为蛋白质的等电等电等电等电点点点点。蛋白质等电点性质为。蛋白质等电点性质为。蛋白质等电点性质为。蛋白质等电点性质为电泳分离电泳分离电泳分离电泳分离的依据。的依据。的依据。的依据。4848蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能PrPrPrPr(pH(pH(pH(pHpI)pI)pI)pI)(pH(pH(pH(pHpI)pI)pI)pI)(pH(pH(pH(pHpI)pI)pI)pI)蛋白质的阳离子蛋白质的阳离子蛋白质的阳离子蛋白质的阳离子蛋白质的兼性离子蛋白质的兼性离子蛋白质的兼性离子蛋白质的兼性离子 蛋白质的阴离子蛋白质的阴离子蛋白质的阴离子蛋白质的阴离子NHNHNHNH2 2 2 2COOCOOCOOCOO-PrPrPrPrNHNHNHNH3 3 3 3+COOHCOOHCOOHCOOHPrPrPrPrNHNHNHNH3 3 3 3+COOCOOCOOCOO-OHOHOHOH-H H H H+OHOHOHOH-H H H H+4949蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能 体内大多数蛋白质的等电点在体内大多数蛋白质的等电点在pH5.0左右，因而在生理条件下以左右，因而在生理条件下以阴离子阴离子形式存形式存在在。5050蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能3 3.电泳电泳 带电粒子在电场中向带电粒子在电场中向带电粒子在电场中向带电粒子在电场中向电性相反电性相反电性相反电性相反的电极的电极的电极的电极移动移动移动移动的的的的现象。现象。现象。现象。蛋白质在带电场中泳动的蛋白质在带电场中泳动的蛋白质在带电场中泳动的蛋白质在带电场中泳动的速度速度速度速度和和和和方向方向方向方向与其所与其所与其所与其所带带带带电荷电荷电荷电荷的的的的性质性质性质性质、数量数量数量数量及及及及分子的大小分子的大小分子的大小分子的大小、形状形状形状形状有关。有关。有关。有关。带电荷多，分子小的泳动速度较快；反之则泳动带电荷多，分子小的泳动速度较快；反之则泳动带电荷多，分子小的泳动速度较快；反之则泳动带电荷多，分子小的泳动速度较快；反之则泳动较慢，较慢，较慢，较慢，从而达到分离蛋白质的目的。从而达到分离蛋白质的目的。从而达到分离蛋白质的目的。从而达到分离蛋白质的目的。5151蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能二、蛋白质的胶体性质二、蛋白质的胶体性质 1 1.蛋白质有胶体性质蛋白质有胶体性质 蛋白质是生物大分子，分子量在蛋白质是生物大分子，分子量在1 1万万1010万万DaDa之间，分子直径在胶体颗粒的范之间，分子直径在胶体颗粒的范围（围（1100nm），因此，蛋白质具有胶，因此，蛋白质具有胶体的性质。体的性质。5252蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能 2 2 2 2.蛋白质亲水胶体稳定的因素蛋白质亲水胶体稳定的因素蛋白质亲水胶体稳定的因素蛋白质亲水胶体稳定的因素 蛋白质分子表面的蛋白质分子表面的蛋白质分子表面的蛋白质分子表面的水化膜水化膜水化膜水化膜和和和和同种电荷同种电荷同种电荷同种电荷。去。去。去。去掉两个稳定因素，则蛋白质从溶液中析出而产掉两个稳定因素，则蛋白质从溶液中析出而产掉两个稳定因素，则蛋白质从溶液中析出而产掉两个稳定因素，则蛋白质从溶液中析出而产生沉淀。生沉淀。生沉淀。生沉淀。3 3 3 3.蛋白质胶体性质的应用蛋白质胶体性质的应用蛋白质胶体性质的应用蛋白质胶体性质的应用 透析透析透析透析用于分离纯化蛋白质用于分离纯化蛋白质用于分离纯化蛋白质用于分离纯化蛋白质 超速离心超速离心超速离心超速离心用于蛋白质的分离纯化及分子量用于蛋白质的分离纯化及分子量用于蛋白质的分离纯化及分子量用于蛋白质的分离纯化及分子量的测定。的测定。的测定。的测定。5353蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能5454蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能变性的概念变性的概念变性的概念变性的概念 在某些物理或化学因素的作用下，蛋白质在某些物理或化学因素的作用下，蛋白质在某些物理或化学因素的作用下，蛋白质在某些物理或化学因素的作用下，蛋白质特定的空间构象被破坏，从而导致其理化性质改特定的空间构象被破坏，从而导致其理化性质改特定的空间构象被破坏，从而导致其理化性质改特定的空间构象被破坏，从而导致其理化性质改变和生物活性丧失，称为蛋白质的变性变和生物活性丧失，称为蛋白质的变性变和生物活性丧失，称为蛋白质的变性变和生物活性丧失，称为蛋白质的变性。变性的实质变性的实质变性的实质变性的实质 次级键断裂，空间结构破坏次级键断裂，空间结构破坏次级键断裂，空间结构破坏次级键断裂，空间结构破坏 三、蛋白质的变性、沉淀和凝固三、蛋白质的变性、沉淀和凝固5555蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能 引起变性的因素引起变性的因素引起变性的因素引起变性的因素 物理因素物理因素物理因素物理因素 高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波等。高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波等。高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波等。高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波等。化学因素化学因素化学因素化学因素 强酸、强碱、有机溶剂、尿素、重金属盐等。强酸、强碱、有机溶剂、尿素、重金属盐等。强酸、强碱、有机溶剂、尿素、重金属盐等。强酸、强碱、有机溶剂、尿素、重金属盐等。5656蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能变性蛋白质的特点变性蛋白质的特点变性蛋白质的特点变性蛋白质的特点 A.A.A.A.生物学活性丧失生物学活性丧失生物学活性丧失生物学活性丧失 B.B.B.B.溶解度降低，易于沉淀溶解度降低，易于沉淀溶解度降低，易于沉淀溶解度降低，易于沉淀 C.C.C.C.粘度增加粘度增加粘度增加粘度增加 D.D.D.D.结晶能力消失结晶能力消失结晶能力消失结晶能力消失 E.E.E.E.易被蛋白酶水解易被蛋白酶水解易被蛋白酶水解易被蛋白酶水解5757蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能蛋白质变性的应用蛋白质变性的应用蛋白质变性的应用蛋白质变性的应用 应用变性的因素进行消毒、灭菌。应用变性的因素进行消毒、灭菌。应用变性的因素进行消毒、灭菌。应用变性的因素进行消毒、灭菌。保存生物制剂则要防止蛋白质变性。保存生物制剂则要防止蛋白质变性。保存生物制剂则要防止蛋白质变性。保存生物制剂则要防止蛋白质变性。蛋白质的复性蛋白质的复性蛋白质的复性蛋白质的复性 大多数蛋白质变性后，空间构象严重破坏，大多数蛋白质变性后，空间构象严重破坏，大多数蛋白质变性后，空间构象严重破坏，大多数蛋白质变性后，空间构象严重破坏，不能恢复其天然状态，称为不可逆性变性；若蛋不能恢复其天然状态，称为不可逆性变性；若蛋不能恢复其天然状态，称为不可逆性变性；若蛋不能恢复其天然状态，称为不可逆性变性；若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素，有些可恢复白质变性程度较轻，去除变性因素，有些可恢复白质变性程度较轻，去除变性因素，有些可恢复白质变性程度较轻，去除变性因素，有些可恢复其天然构象和生物活性其天然构象和生物活性其天然构象和生物活性其天然构象和生物活性,称为蛋白质的复性。称为蛋白质的复性。称为蛋白质的复性。称为蛋白质的复性。5858蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能牛牛核核糖糖核核酸酸酶酶的的变变性性与与复复性性5959蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能蛋白质沉淀蛋白质沉淀蛋白质沉淀蛋白质沉淀概念概念概念概念 蛋白质从溶液中析出的现象称为沉淀。蛋白质从溶液中析出的现象称为沉淀。蛋白质从溶液中析出的现象称为沉淀。蛋白质从溶液中析出的现象称为沉淀。方法方法方法方法 盐析法、有机溶剂的沉淀、重金属盐沉淀、盐析法、有机溶剂的沉淀、重金属盐沉淀、盐析法、有机溶剂的沉淀、重金属盐沉淀、盐析法、有机溶剂的沉淀、重金属盐沉淀、生物碱试剂及某些酸类沉淀。生物碱试剂及某些酸类沉淀。生物碱试剂及某些酸类沉淀。生物碱试剂及某些酸类沉淀。变性的蛋白质易于沉淀，但不一定都发生变性的蛋白质易于沉淀，但不一定都发生变性的蛋白质易于沉淀，但不一定都发生变性的蛋白质易于沉淀，但不一定都发生沉淀。沉淀的蛋白质易发生变性，但并不都变沉淀。沉淀的蛋白质易发生变性，但并不都变沉淀。沉淀的蛋白质易发生变性，但并不都变沉淀。沉淀的蛋白质易发生变性，但并不都变性，如盐析。性，如盐析。性，如盐析。性，如盐析。6060蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能四、蛋白质的紫外吸收性质四、蛋白质的紫外吸收性质蛋白质分子中含有共轭双键的蛋白质分子中含有共轭双键的蛋白质分子中含有共轭双键的蛋白质分子中含有共轭双键的苯丙氨酸、苯丙氨酸、苯丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸酪氨酸酪氨酸酪氨酸和和和和色氨酸色氨酸色氨酸色氨酸残基，具有紫外吸收能力，残基，具有紫外吸收能力，残基，具有紫外吸收能力，残基，具有紫外吸收能力，在在在在280280280280nmnmnmnm处有最大处有最大处有最大处有最大吸收峰吸收峰吸收峰吸收峰。此特性常用于蛋白。此特性常用于蛋白。此特性常用于蛋白。此特性常用于蛋白质含量的测定。质含量的测定。质含量的测定。质含量的测定。6161蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能五、蛋白质的免疫学性质五、蛋白质的免疫学性质蛋白质作为大分子，往往具有蛋白质作为大分子，往往具有蛋白质作为大分子，往往具有蛋白质作为大分子，往往具有免疫原性免疫原性免疫原性免疫原性，同时，抗，同时，抗，同时，抗，同时，抗体也是蛋白质。体也是蛋白质。体也是蛋白质。体也是蛋白质。抗原（免疫原）：抗原（免疫原）：抗原（免疫原）：抗原（免疫原）：凡能刺激机体免疫系统产生免疫凡能刺激机体免疫系统产生免疫凡能刺激机体免疫系统产生免疫凡能刺激机体免疫系统产生免疫应答，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞受体发生特应答，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞受体发生特应答，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞受体发生特应答，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞受体发生特异性结合的物质。异性结合的物质。异性结合的物质。异性结合的物质。抗体：抗体：抗体：抗体：机体中因抗原刺激而产生的能与相应抗原特机体中因抗原刺激而产生的能与相应抗原特机体中因抗原刺激而产生的能与相应抗原特机体中因抗原刺激而产生的能与相应抗原特异结合并具免疫功能的免疫球蛋白。异结合并具免疫功能的免疫球蛋白。异结合并具免疫功能的免疫球蛋白。异结合并具免疫功能的免疫球蛋白。单克隆抗体：单克隆抗体：单克隆抗体：单克隆抗体：由针对由针对由针对由针对某一个特定抗原决定簇某一个特定抗原决定簇某一个特定抗原决定簇某一个特定抗原决定簇而分化、而分化、而分化、而分化、增殖而来的增殖而来的增殖而来的增殖而来的B B B B淋巴细胞群合成并分泌的抗体。淋巴细胞群合成并分泌的抗体。淋巴细胞群合成并分泌的抗体。淋巴细胞群合成并分泌的抗体。6262蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能六、蛋白质的呈色反应六、蛋白质的呈色反应1.1.双缩脲反应：双缩脲反应：肽键肽键肽键肽键与双缩脲试剂反应呈紫色；与双缩脲试剂反应呈紫色；与双缩脲试剂反应呈紫色；与双缩脲试剂反应呈紫色；氨基酸无此反应氨基酸无此反应氨基酸无此反应氨基酸无此反应，可用于检查蛋白质的水解程度。可用于检查蛋白质的水解程度。可用于检查蛋白质的水解程度。可用于检查蛋白质的水解程度。碱性溶液中与碱性溶液中与碱性溶液中与碱性溶液中与CuCuCuCu2+2+2+2+反应，反应，反应，反应，mgmgmgmg级测定级测定级测定级测定2.2.茚三酮反应茚三酮反应:酸性条件下，与茚三酮共热产生蓝紫色酸性条件下，与茚三酮共热产生蓝紫色酸性条件下，与茚三酮共热产生蓝紫色酸性条件下，与茚三酮共热产生蓝紫色3.Folin3.Folin酚试剂反应酚试剂反应碱性碱性碱性碱性+Cu+Cu2+2+磷钼酸磷钼酸磷钼酸磷钼酸-磷钨酸磷钨酸磷钨酸磷钨酸蓝色蓝色蓝色蓝色范围范围范围范围:25-250g(Tyr,Trp:25-250g(Tyr,Trp的反应的反应的反应的反应)6363蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能1.1.紫外分光光度法紫外分光光度法:280nm,0.1-0.5mg/ml(样品含核酸时)蛋白质(mg/ml)=1.55A280-0.75A2602.2.福林福林-酚试剂法酚试剂法:碱性+Cu2+磷钼酸-磷钨酸蓝色范围:25-250g(Tyr,Trp的反应)七、蛋白质的含量测定七、蛋白质的含量测定6464蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能5.5.双缩脲法双缩脲法 肽键肽键+碱性碱性+Cu+Cu2+2+紫红色紫红色 范围范围:0.5-10mg/ml:0.5-10mg/ml6.6.凯氏定氮法凯氏定氮法 1g1g氮相当于样品含有氮相当于样品含有6.25g6.25g蛋白质蛋白质6666蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能第四节第四节 蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化6767蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能一、蛋白质的提取一、蛋白质的提取1.1.选材：选材：选材：选材：新鲜、富含目的蛋白且来源方便新鲜、富含目的蛋白且来源方便新鲜、富含目的蛋白且来源方便新鲜、富含目的蛋白且来源方便2.2.组织细胞的粉碎：组织细胞的粉碎：组织细胞的粉碎：组织细胞的粉碎：胞内及膜中蛋白胞内及膜中蛋白胞内及膜中蛋白胞内及膜中蛋白物理法：如超声、匀浆、加砂研磨、高压挤压等物理法：如超声、匀浆、加砂研磨、高压挤压等物理法：如超声、匀浆、加砂研磨、高压挤压等物理法：如超声、匀浆、加砂研磨、高压挤压等化学法：如化学法：如化学法：如化学法：如EDTAEDTA、SDSSDS等等等等酶法：如自溶法、外加酶法（纤维素酶、果胶酶、酶法：如自溶法、外加酶法（纤维素酶、果胶酶、酶法：如自溶法、外加酶法（纤维素酶、果胶酶、酶法：如自溶法、外加酶法（纤维素酶、果胶酶、溶菌酶等）溶菌酶等）溶菌酶等）溶菌酶等）3.3.提取：提取：提取：提取：适当溶媒、适当条件、适当提取时间和次适当溶媒、适当条件、适当提取时间和次适当溶媒、适当条件、适当提取时间和次适当溶媒、适当条件、适当提取时间和次数数数数6868蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能二、蛋白质的分离纯化二、蛋白质的分离纯化（一）根据溶解度不同（一）根据溶解度不同1.等电点沉淀等电点沉淀:蛋白质在蛋白质在pI时溶解度最小时溶解度最小2.盐析盐析(分级分级):大量中性盐如大量中性盐如(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl加入蛋白质溶液中加入蛋白质溶液中,破坏蛋白破坏蛋白质在水溶液中的稳定性因素而沉淀质在水溶液中的稳定性因素而沉淀.各种蛋白各种蛋白质盐析时需盐浓度及质盐析时需盐浓度及pH不同不同.3.低温有机溶剂沉淀低温有机溶剂沉淀(分级分级):降低水的介电常数降低水的介电常数6969蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能（二）根据分子大小不同（二）根据分子大小不同1.透析和超滤透析和超滤(分级分级):根据分子量的大小，用透根据分子量的大小，用透析袋或滤膜将大、小分子物质分开析袋或滤膜将大、小分子物质分开2.凝胶过滤凝胶过滤(分子排阻层析分子排阻层析):又称分子筛，柱内又称分子筛，柱内填满带有小孔的颗粒，一般为葡聚糖填满带有小孔的颗粒，一般为葡聚糖 3.密度梯度离心密度梯度离心:根据粒子密度差进行分离。蔗根据粒子密度差进行分离。蔗糖糖,CsCl7070蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能(三三)根据电离性质不同根据电离性质不同1.电泳法电泳法:蛋白质泳动的方向和速度取决于蛋蛋白质泳动的方向和速度取决于蛋白质分子所带电荷的性质、数量及质点的大白质分子所带电荷的性质、数量及质点的大小和形状小和形状 1)醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳 2)聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)2.离子交换层析离子交换层析（如下页图）（如下页图）1)离子交换纤维素离子交换纤维素 2)离子交换凝胶离子交换凝胶 3)大孔型离子交换树脂大孔型离子交换树脂7171蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能7272蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能(四四)根据配基特异性根据配基特异性亲和层析亲和层析:根据生物大分子与其配基间特根据生物大分子与其配基间特异的亲和结合异的亲和结合(可逆可逆)如如Ag-Ab、IgA与其补体、酶与其底物或与其补体、酶与其底物或抑制剂等抑制剂等7373蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能7474蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能三、蛋白质的纯度鉴定三、蛋白质的纯度鉴定1.层析法层析法:单一洗脱峰单一洗脱峰层析纯层析纯(HPLC)2.电泳法电泳法:单一区带单一区带电泳纯电泳纯 高效毛细管电泳高效毛细管电泳(HPCE)3.免疫化学法免疫化学法:免疫纯免疫纯 放射免疫分析法放射免疫分析法(RIA)酶标记免疫分析法酶标记免疫分析法(EIA)7575蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能半饱和硫酸铵半饱和硫酸铵半饱和硫酸铵半饱和硫酸铵离心离心离心离心球蛋白沉淀球蛋白沉淀球蛋白沉淀球蛋白沉淀血清血清血清血清血清血清血清血清离心离心离心离心饱和硫酸铵饱和硫酸铵饱和硫酸铵饱和硫酸铵白蛋白沉淀白蛋白沉淀白蛋白沉淀白蛋白沉淀不同浓度硫酸铵对血清的盐析结果不同浓度硫酸铵对血清的盐析结果不同浓度硫酸铵对血清的盐析结果不同浓度硫酸铵对血清的盐析结果返返 回回7676蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能分子筛层析原理示意图分子筛层析原理示意图7777蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能返返 回回7878蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能密度梯度离心示意图密度梯度离心示意图密度梯度离心示意图密度梯度离心示意图返返 回回7979蛋白质的基本机构和功能蛋白质的基本机构和功能