沙蚕体内微生物在农抗、农药降解方向的利用研究课件

1沙蚕体内微生物在农沙蚕体内微生物在农抗、农药降解方向的抗、农药降解方向的利用研究利用研究 1沙蚕体内微生物在农抗、农药降解方向的利用研究 v1.1.我国有机磷农药的使用情况我国有机磷农药的使用情况v2.2.沙蚕利用研究进展沙蚕利用研究进展v3.3.研究的目的与意义研究的目的与意义21.我国有机磷农药的使用情况21.机磷农药污染机磷农药污染3有机磷有机磷 农药污染农药污染复杂性复杂性 污染源多样，污染物也具有多样性，污染源多样，污染物也具有多样性，复合污染特点日益突出。复合污染特点日益突出。普遍性普遍性 污染面积增加明显，开始呈连续分布污染面积增加明显，开始呈连续分布,农田、河流农田、河流 污染严重污染严重异质性异质性 由多种复杂成分组成的污染物在非流体介质中存在由多种复杂成分组成的污染物在非流体介质中存在 浓度梯度。浓度梯度。累积性累积性 污染物含量呈增加趋势污染物含量呈增加趋势 持久性持久性 不易被生物利用，污染物存在的持久性不易被生物利用，污染物存在的持久性1.机磷农药污染3有机磷 农药污染复杂性 污染源多样，污有机磷农药的降解途径有机磷农药的降解途径4光催化降解光催化降解氧化降解氧化降解 光反应产光反应产物速率受多物速率受多种因素影响，种因素影响，不易控制不易控制 微生物降解微生物降解研究重点和热点研究重点和热点无毒、无残留、无二次污染等优点，是消除和解无毒、无残留、无二次污染等优点，是消除和解无毒、无残留、无二次污染等优点，是消除和解无毒、无残留、无二次污染等优点，是消除和解毒农药残留的一种安全、有效、廉价的方法毒农药残留的一种安全、有效、廉价的方法毒农药残留的一种安全、有效、廉价的方法毒农药残留的一种安全、有效、廉价的方法 有机磷农药的降解途径有机磷农药的降解途径成本过高成本过高有机磷农药的降解途径4光催化降解氧化降解 光反应产物速率2.沙蚕的研究与利用沙蚕的研究与利用5 沙蚕（Nereis），俗名“海蜈蚣、海虫”，是广泛分布在近岸海域的无脊椎动物，属环节动物门，多毛纲，游走目，沙蚕科。国外研究表明：沙蚕对重金属等污染物非常敏感，常被作为环境监测的指示生物（Dallinger R,1993）。沙蚕种类繁多，分布广泛。仅我国近海就有80多种，分布在我国的从南至北的各个近岸海域。同时它又是各种鱼、虾和蟹类的饵料。因此，它的丰富度会直接关系近岸海域食物链的兴衰和生物多样性。最近有研究表明某些沙蚕类群对重金属和石油烃胁迫表现出异常的适应性和高度的耐受性（Mouneyrac C,2003；Zhou QX,2003；Christensen M,2002）。2.沙蚕的研究与利用5 沙蚕（Nereis），俗名“海蜈蚣、6v双齿围沙蚕是一种主要生活在海边潮间带的海洋生物，近双齿围沙蚕是一种主要生活在海边潮间带的海洋生物，近 年来研究人员已从其体内分离出多种生物活性物质（如：年来研究人员已从其体内分离出多种生物活性物质（如：P-胍基异丁酸、羟高铁血红素、磷酸脒基牛磺酸、海蚯蚓胍基异丁酸、羟高铁血红素、磷酸脒基牛磺酸、海蚯蚓素等）。鉴于其可以生活在污染严重的环境，并能帮助改素等）。鉴于其可以生活在污染严重的环境，并能帮助改善和治理环境污染善和治理环境污染(由于沙蚕能摄食底泥中的沉积物、有由于沙蚕能摄食底泥中的沉积物、有机碎屑、微生物等有机污染物，常用于海洋污染底质原位机碎屑、微生物等有机污染物，常用于海洋污染底质原位修复修复。林更明等。林更明等2009)，故推测其体内可能具有多种生物，故推测其体内可能具有多种生物活性物质或特殊的微生态群，以帮助其拮抗外界污染环境活性物质或特殊的微生态群，以帮助其拮抗外界污染环境的损害。的损害。6双齿围沙蚕是一种主要生活在海边潮间带的海洋生物，近 年来 3研究目的及意义研究目的及意义v目的：针对我国有机磷农药污染问题，从海洋目的：针对我国有机磷农药污染问题，从海洋生物沙蚕体内筛选出具体抗菌及高效降解有机生物沙蚕体内筛选出具体抗菌及高效降解有机磷农药的功能微生物磷农药的功能微生物。v意义：为减少农药对生态环境和人体健康所带意义：为减少农药对生态环境和人体健康所带来危害，提供微生物资源和技术支撑来危害，提供微生物资源和技术支撑7 3研究目的及意义目的：针对我国有机磷农8沙蚕体内细菌沙蚕体内真菌沙蚕体内放线菌8沙蚕体内细菌沙蚕体内真菌沙蚕体内放线菌9活性菌株的初筛活性菌株的初筛9活性菌株的初筛采用杯碟法，将经过初筛活性效果明显的菌株制备发酵液，采用杯碟法，将经过初筛活性效果明显的菌株制备发酵液，离心取上清，吸取离心取上清，吸取200l注入牛津杯，将注入无菌水的平板注入牛津杯，将注入无菌水的平板作为对照。作为对照。10采用杯碟法，将经过初筛活性效果明显的菌株制备发酵液，离心取SCF-18产物抑菌谱的测定产物抑菌谱的测定v在无菌条件下，用移液管吸取在无菌条件下，用移液管吸取SCF-18发酵滤液发酵滤液2.5ml于于培养皿内，加入融化好的土豆培养基培养皿内，加入融化好的土豆培养基10ml混合均匀。冷混合均匀。冷却后将各种病原菌菌丝块分别接种于培养皿中央，却后将各种病原菌菌丝块分别接种于培养皿中央，28培养。以无菌水代替发酵液作为对照。当对照组菌丝长培养。以无菌水代替发酵液作为对照。当对照组菌丝长至接近皿边缘时，量取菌丝直径（减去菌丝块直径）。至接近皿边缘时，量取菌丝直径（减去菌丝块直径）。v按下列公式求抑菌率：按下列公式求抑菌率：抑菌率抑菌率=（对照组菌丝直径（对照组菌丝直径-处理组菌丝直径）处理组菌丝直径）/对照组菌对照组菌丝直径丝直径100%SCF-18产物抑菌谱的测定在无菌条件下，用移液管吸取SCF抑菌谱的测定抑菌谱的测定抑菌谱的测定拮抗菌拮抗菌SCF-18抑菌率抑菌率拮抗菌SCF-18抑菌率CSF-18发酵液对立枯丝核菌的抑制情况发酵液对立枯丝核菌的抑制情况CSF-18发酵液对立枯丝核菌的抑制情况CSF-18发酵液对大麦根腐病的抑制情况发酵液对大麦根腐病的抑制情况CSF-18发酵液对大麦根腐病的抑制情况CSF-18发酵液对大麦根腐病的抑制情况发酵液对大麦根腐病的抑制情况CSF-18发酵液对大麦根腐病的抑制情况16SrRNA序列分析（链霉菌属）序列分析（链霉菌属）16SrDNA序列分析序列分析 将大连宝生物（将大连宝生物（Takara）公司测得菌株）公司测得菌株SCF-18的的16SrDNA序列与序列与Genbank中相关数据进行中相关数据进行BLAST相似性分析，相似性分析，根据序列同源性从高到低原则，选取相近的根据序列同源性从高到低原则，选取相近的9个菌株的个菌株的16S rDNA序列，运用序列，运用MEGA4.0软件构建系统发育树。结果表明：与之同源软件构建系统发育树。结果表明：与之同源性较高的均为链霉菌（性较高的均为链霉菌（Streptomyces），其中），其中SCF-18与淡紫灰链与淡紫灰链霉菌（霉菌（S.lavendula）同源性为）同源性为100%。菌落形态、培养等特征与。菌落形态、培养等特征与淡紫灰链霉菌（淡紫灰链霉菌（S.lavendula）也相符合。因此，将菌株）也相符合。因此，将菌株SCF-18鉴定为淡紫灰链霉菌（鉴定为淡紫灰链霉菌（Streptomyces lavendula），命名为），命名为Streptomyces lavendula strain SCF-18。16SrRNA序列分析（链霉菌属）基于基于16SrRNA序列同源性的系统发育树序列同源性的系统发育树基于16SrRNA序列同源性的系统发育树生理生化反应生理生化反应v温度对菌株生长的影响温度对菌株生长的影响 取取3mL菌液至菌液至100mL改良高氏一号培养基中，在温度为改良高氏一号培养基中，在温度为20、25、30、35、38、40 条件下，震荡培养，分别用未接条件下，震荡培养，分别用未接种菌液培养基为对照，每个处理设置种菌液培养基为对照，每个处理设置3个平行，个平行，4d后取菌液于紫外后取菌液于紫外分光光度仪分光光度仪600nm波长测定光吸收值。波长测定光吸收值。vpH值对菌株生长的影响值对菌株生长的影响 取取3ml菌液转入装有菌液转入装有100ml液体高氏培养基三角瓶中，将其放入恒液体高氏培养基三角瓶中，将其放入恒温摇床，在温摇床，在pH 5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9条件下震荡培条件下震荡培养，以未接种菌液培养基为对照，每个处理设置养，以未接种菌液培养基为对照，每个处理设置3个平行。个平行。4天后取天后取菌液测定光吸收（菌液测定光吸收（OD600）。）。生理生化反应温度对菌株生长的影响生理生化反应生理生化反应生理生化反应生理生化反应生理生化反应v盐度对菌株生长的影响盐度对菌株生长的影响 在高氏培养基中加入在高氏培养基中加入NaCl，使其质量分数分别为，使其质量分数分别为2%、3%、5%、7%和和9%，3次重复，划线接种次重复，划线接种SCF-18，培，培养养4d后观察记录其生长情况。后观察记录其生长情况。生理生化反应盐度对菌株生长的影响结论结论v本本研研究究通通过过对对双双齿齿围围沙沙蚕蚕（P.aibuhitensis）内内生生菌菌株株的的分分离离，筛筛选选出出一一株株可可抑抑制制立立枯枯丝丝核核菌菌生生长长的的放放线线菌菌SCF-18。采采用用分分子子生生物物学学方方法法，并并结结合合菌菌体体形形态态、培培养养特特征征等等方方法法将将该该放放线线菌菌鉴鉴定定为为淡淡紫紫灰灰链链霉霉菌菌（S.lavendula）。其其对对立立枯枯丝丝核核菌菌（Rhizoctonia solani Khn）抑抑制制作作用用较较强强，50%菌菌体体发发酵酵液液基基本本上上可可以以完完全全抑抑制制以以上上两两种种病病原原菌菌的的生生长长。为为进进一一步步发发酵酵利利用用拮拮抗抗菌菌SCF-18，本本研研究究针针对对发发酵酵过过程程中中影影响响最最终终产产物物的的重重要要细细胞胞反反应应参参数数，如如：温温度度、酸酸碱碱度度、渗渗透透压压进进行行研研究究。发发现现放放线线菌菌SCF-18生生长长最最适适温温度度为为30，适适于于在在中中性性偏偏碱碱环环境境下下生生长长，渗渗透透压压耐耐受受能能力力较较强强。从从目目前前形形势势来来看看,生生物物防防治治是是一一种种经经济济有有效效且且环环境境友友好好的的防防治治方方法法，前前景景十十分分广广阔阔。本本研研究究所所分分离离的的放放线线菌菌SCF-18对对立立枯枯丝丝核核等等病病原原菌菌表表现现出出明明显显的的抑抑制制作作用用，日日后后将将对对其其抑抑菌菌机机制制进进行行深深入入探探索索，以以期期为为此类抑菌剂的研发提供理论指导和参考依据。此类抑菌剂的研发提供理论指导和参考依据。22结论本研究通过对双齿围沙蚕（P.aibuhitensis）Thank You!