菌种传代与保藏课件

菌种的菌种的传传代与保藏代与保藏内蒙自治区内蒙自治区药药品品检验检验所所-精品文档-菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学材料，在医学领领域中，域中，诊诊断制品的制断制品的制备备，菌苗的，菌苗的生生产产、微生物致病性研究，、微生物致病性研究，药药物的抑菌物的抑菌试验试验及及药药品微生物品微生物检验检验等都有一套完整的菌种等都有一套完整的菌种.微生物具微生物具有生命活力，有生命活力，在在传传代代过过程中易程中易发发生生变变异甚至死亡，异甚至死亡，因此菌种保藏是一因此菌种保藏是一项项重要的基重要的基础础工作，是微生物工作，是微生物学基学基础础工作的一工作的一项项重要内容，也是重要内容，也是药药品微生物工品微生物工作中的一作中的一项项常用技常用技术术。一、菌种保藏的意一、菌种保藏的意义义-精品文档-如如药药品中的控制菌品中的控制菌检查检查使用的阳性使用的阳性对对照照菌菌须须防止因多次防止因多次传传代而使阳性代而使阳性对对照菌的典型照菌的典型生物学特征生物学特征发发生生变变化及菌株的死亡，保化及菌株的死亡，保证证达达到菌种到菌种长长期正确的形期正确的形态态；如如药药品微生物学品微生物学检验过检验过程中，程中，检检出的可疑出的可疑致病菌致病菌须须妥善保藏，以达到妥善保藏，以达到进进一步一步鉴鉴定的目定的目的，保的，保证证用用药药安全。安全。-精品文档-二、菌种代号的意二、菌种代号的意义义l国内国内药药品微生物品微生物检验检验所用的菌种代号是所用的菌种代号是lCMCC（F）或）或CMCC（B）lCMCC中国医学菌种保藏中心中国医学菌种保藏中心lB代表代表细细菌，菌，F代表真菌。代表真菌。l大大肠肠杆菌杆菌CMCC(B)44102l乙型副乙型副伤伤寒沙寒沙门门杆菌杆菌CMCC(B)50094l铜绿铜绿假假单单胞菌胞菌CMCC(B)10104l金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003l生生孢孢梭菌梭菌CMCC(B)64941l白色念珠菌白色念珠菌CMCC(F)98001-精品文档-三、常用菌种保藏方法三、常用菌种保藏方法(一一)菌种保藏的原理菌种保藏的原理l根据微生物的菌种生理、生化特性，在人工根据微生物的菌种生理、生化特性，在人工创创造造的条件下尽量降低微生物的条件下尽量降低微生物细细胞的代胞的代谢谢强强度，使度，使细细胞基本胞基本处处于休眠状于休眠状态态，生，生长长繁殖受到抑制但又不繁殖受到抑制但又不至于死亡，以减低菌种的至于死亡，以减低菌种的变变异率。低温、干燥、异率。低温、干燥、缺氧、缺乏缺氧、缺乏营营养等养等环环境条件都有抑制微生物的代境条件都有抑制微生物的代谢谢作用。作用。l低温、干燥、真空是用于菌种保藏的重要手段。低温、干燥、真空是用于菌种保藏的重要手段。-精品文档-选择选择保藏方法保藏方法时时，首先，首先应应考考虑虑方法能否方法能否长长期地期地保持菌种原有的特性，同保持菌种原有的特性，同时时也也应应兼兼顾顾到方法的到方法的经济经济和和简简便。在便。在实际实际工作中，往往多种条件同工作中，往往多种条件同时时使用使用,以提高保藏效果。以提高保藏效果。（二）菌种保藏步（二）菌种保藏步骤骤挑挑选选特征典型的特征典型的纯纯菌菌落；菌菌落；确定保藏的合适菌体形确定保藏的合适菌体形态态；选择选择最适宜的保藏方法；最适宜的保藏方法；定定期期对对保保藏藏菌菌种种进进行行检检查查，观观察察是是否否发发生生变变化化，若若有有变变化化，须须改改变变保保藏藏方方法法。保保藏藏期期满满应应及及时时进进行移种。行移种。-精品文档-1.1.琼琼脂斜面低温保存法脂斜面低温保存法 l（1）方法：将）方法：将经经常使用的菌种的典型菌落接常使用的菌种的典型菌落接种在斜面（某些特殊菌种可用液体培养基）上，种在斜面（某些特殊菌种可用液体培养基）上，按按规规定的温度和定的温度和时间时间培养，待充分生培养，待充分生长长后，把后，把培养好的新培养好的新鲜鲜菌种用牛皮菌种用牛皮纸纸保好，保好，为为减减缓缓培养培养基的水分蒸基的水分蒸发发，延，延长长保藏保藏时间时间，可将菌种保藏，可将菌种保藏管的棉花塞管的棉花塞换换成橡胶塞。放在成橡胶塞。放在4左右的冰箱左右的冰箱中保藏。每隔中保藏。每隔23个月移种一次，个月移种一次，继续进继续进行保行保藏。若用半固体高藏。若用半固体高层层培养基穿刺培养，一般可培养基穿刺培养，一般可保藏半年保藏半年 一年。有的甚至更一年。有的甚至更长时间长时间。l（2）适用范）适用范围围：细细菌、酵母菌、霉菌保藏。菌、酵母菌、霉菌保藏。-精品文档-大大肠肠杆菌斜面杆菌斜面 金黄色葡萄球菌斜面金黄色葡萄球菌斜面-精品文档-生生生生孢孢孢孢梭菌梭菌梭菌梭菌 白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌需气菌、需气菌、需气菌、需气菌、厌厌厌厌气菌培养基气菌培养基气菌培养基气菌培养基 真菌培养基真菌培养基真菌培养基真菌培养基-精品文档-各各类类菌种保藏条件及菌种保藏条件及时间时间菌菌种种培培养养基基保存温保存温度度传传种种时时间间细细菌菌一一般般多多用用于于营营养养琼琼脂脂或或根根据据菌菌种种规规定定选选用用培养基培养基46芽芽孢孢杆杆菌菌36个个月月，其它其它细细菌每个月菌每个月酵母菌酵母菌一一般般用用麦麦芽芽汁汁琼琼脂脂或或麦芽汁酵母膏麦芽汁酵母膏琼琼脂脂46一般一般46个月个月丝丝状真状真菌菌一般用PDA琼脂、蔡氏琼脂或麦芽汁琼脂等46每每4个个月月移移植植一一次次（每每2个月移植一次个月移植一次）-精品文档-（3）特点：）特点：优优点是点是简简便，易于推广；一般不需便，易于推广；一般不需要另要另选择选择保藏用培养基；保藏用培养基；对对大多数微生物都大多数微生物都适用。适用。缺点是缺点是保藏期太短；保藏期太短；传传代次数多，代次数多，易易发发生生变变异及异及污污染。染。-精品文档-（4）注意事）注意事项项：l保保藏藏的的菌菌种种应应是是生生命命活活力力旺旺盛盛的的新新鲜鲜培培养养物物，至至少少应应是第三代的培养物。是第三代的培养物。l保保藏藏时时，破破伤伤风风杆杆菌菌可可用用庖庖肉肉培培养养基基；生生孢孢梭梭菌菌用用流体硫乙醇酸流体硫乙醇酸盐盐培养基。培养基。l必必须须定定期期检检查查保保藏藏菌菌种种冰冰箱箱的的温温度度、湿湿度度以以及及菌菌种管的棉塞是否松种管的棉塞是否松动动或生霉，如有异常或生霉，如有异常应应及及时处时处理。理。l每每次次移移植植后后，应应与与原原菌菌种种的的编编号号、名名称称逐逐一一核核对对，确确证证培养基特征和培养基特征和纯纯度无度无误误后再后再继续继续保藏。保藏。l保保藏藏菌菌种种的的培培养养基基应应无无糖糖，其其他他菌菌类类含含糖糖小小于于2%为为宜，以免宜，以免产产酸酸过过多，影响菌种存活。多，影响菌种存活。l铜铜绿绿假假单单胞胞菌菌在在冰冰箱箱中中易易发发生生菌菌体体自自溶溶而而死死亡亡，不宜用本法保存。不宜用本法保存。-精品文档-2、液体石蜡保存法：、液体石蜡保存法：本法是用石蜡将培养物与空气隔本法是用石蜡将培养物与空气隔本法是用石蜡将培养物与空气隔本法是用石蜡将培养物与空气隔绝绝绝绝，以降低菌，以降低菌，以降低菌，以降低菌种的生理生化水平，并可防止水分蒸种的生理生化水平，并可防止水分蒸种的生理生化水平，并可防止水分蒸种的生理生化水平，并可防止水分蒸发发发发，从而延，从而延，从而延，从而延长长长长菌种的保藏期。菌种的保藏期。菌种的保藏期。菌种的保藏期。（1）方法：）方法：l将将菌菌种种接接种种于于斜斜面面或或穿穿刺刺于于0.30.5%琼琼脂脂半半固体高固体高层层培养基中，培养好培养基中，培养好备备用。用。l取取化化学学纯纯的的液液体体石石蜡蜡装装在在试试管管中中，每每管管1015ml，加加棉棉塞塞，瓶瓶口口包包上上纸纸，121高高压压灭灭菌菌30min，取取出出置置37温温箱箱或或110170烤烤箱箱中中12h或干燥器内除去液体石蜡中的水分。或干燥器内除去液体石蜡中的水分。-精品文档-l将将上上述述液液体体石石蜡蜡加加入入培培养养好好的的菌菌种种试试管管内内，液液体体石石蜡蜡液液面面以以高高出出培培养养基基最最上上端端1为为宜宜，将将试试管管直直立立，放入放入4冰箱中保藏。冰箱中保藏。l适适用用范范围围：适适用用于于保保藏藏部部分分霉霉菌菌，酵酵母母菌菌和和放放线线菌菌，对对细细菌菌保保藏效果藏效果较较差。差。-精品文档-液体石蜡液体石蜡对对各各类类菌种保藏效果菌种保藏效果菌菌种种菌株数菌株数保存保存时间时间（年）（年）存活率存活率（%）细细菌菌霉菌霉菌酵母菌酵母菌放放线线菌菌87586400380552420.983.688.991.3-精品文档-（3）特点：）特点：本方法本方法简简便易行，是便易行，是实验实验室常用的一种保藏方法，室常用的一种保藏方法，该该法主要使菌种与空气隔法主要使菌种与空气隔绝绝。（4）注意事）注意事项项：保藏保藏时时，用新，用新鲜鲜培养物接种，培养物接种，应检查纯应检查纯度和特征度和特征 后，方可后，方可进进行保行保藏。藏。保藏保藏过过程中，需程中，需经经常常观观察斜面是否干燥，如干燥，察斜面是否干燥，如干燥，需重新移种。需重新移种。使用菌种使用菌种时时，先将菌种管，先将菌种管倾倾斜使液体石蜡流至一斜使液体石蜡流至一边边，再用接种，再用接种针针挑取培养物接种到新挑取培养物接种到新鲜鲜斜面上培斜面上培养，待养，待长长出新培养物后，再移种一次到新斜面上出新培养物后，再移种一次到新斜面上即可使用。即可使用。-精品文档-将将沾沾有有少少量量液液体体石石蜡蜡的的接接种种针针浸浸于于95%酒酒精精中中片片刻刻，再再烧烧灼灼灭灭菌菌，以以免免直直接接在在酒酒精精灯灯下下烧烧灼灼时时，液液体体石石蜡蜡四四溅溅，引引起起污污染。染。液液体体石石蜡蜡在在菌菌种种管管中中高高出出培培养养基基的的高高度度要要严严格格控控制制，如如太太多多，会会影影响响菌菌种种交交换换气气体体，使使保保藏藏效效果果不不好好；如如太太少少，斜斜面面容容易易干干燥燥，将将缩缩短短保保藏藏期期。一一般般以以高高出出斜斜面面1为为宜。宜。制制备备无无菌菌液液体体石石蜡蜡时时，每每管管装装量量不不能能太太多多，否否则则分分装装到到菌菌种种培培养养基基中中易易造造成成污污染。染。-精品文档-3、半固体、半固体琼琼脂培养基（脂培养基（0.5%）4、40%甘油保存法甘油保存法：-精品文档-四、四、试验试验用菌种的培养用菌种的培养传传代方法代方法l程序：程序：冻冻干菌复干菌复苏苏接种（斜面）接种（斜面）（菌种（菌种传传代）代）（营营养肉养肉汤汤）制制备备菌菌悬悬液液对对照菌液照菌液l检检定定用用标标准准菌菌种种，由由中中国国药药品品生生物物检检定定所所提提供供，为为冷冷冻冻干燥菌种。干燥菌种。l菌种的复菌种的复苏苏与保存在与保存在专专用无菌室或超用无菌室或超净净工作台内工作台内进进行。行。-精品文档-1菌种的复菌种的复苏苏 把把冻冻干菌种管、干菌种管、灭灭菌菌1ml滴管、双碟、滴管、双碟、镊镊子、子、营营养肉养肉汤汤培养基、培养基、营营养养琼琼脂斜面数支，移入接种室或脂斜面数支，移入接种室或净净化工作台。化工作台。先用砂先用砂轮轮将将冻冻干菌种安瓶干菌种安瓶颈颈部挫出刻痕部挫出刻痕,再将再将冻冻干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用75%乙醇棉乙醇棉擦擦净净，放在，放在灭灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上，管的封口一端在火焰上，烧烧灼灼红热红热，用，用灭灭菌滴管吸取菌滴管吸取营营养肉养肉汤汤培养基，滴在灼培养基，滴在灼热热的菌种管封口一端，使的菌种管封口一端，使骤骤冷而炸裂。冷而炸裂。-精品文档-取取灭灭菌菌镊镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入放入灭灭菌双碟内，另取菌双碟内，另取1支支灭灭菌滴管，在火焰旁菌滴管，在火焰旁吸取吸取营营养肉养肉汤汤少少许许，加至菌种管底部，将，加至菌种管底部，将冻冻干菌干菌搅动搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分促使溶解，随即吸出管内菌液，分别别接种至接种至营营养养琼琼脂斜面及普通肉脂斜面及普通肉汤汤内，并将滴管及菌种管内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的投入消毒液内，将已接种的营营养肉养肉汤汤及及营营养养琼琼脂脂斜面置斜面置3537培养培养2224h。取出培养物，仔取出培养物，仔细观细观察菌苔形察菌苔形态态、有无、有无杂杂菌、菌、涂片、革涂片、革兰兰氏染色氏染色镜检镜检，呈典型菌落后，呈典型菌落后，转转种种3代即可代即可应应用。如用。如发现发现菌型不典型，可菌型不典型，可进进行平板分行平板分离离单单菌落。菌落。-精品文档-2 菌种的菌种的传传代与保存代与保存 方法（方法（1）：）：菌斜面菌斜面菌斜面（保存）菌斜面（保存）培培养养基基应应新新鲜鲜制制备备，如如斜斜面面已已无无冷冷凝凝水水者者，不不宜宜再再使使用用。标标签签上上著著名名菌菌名名及及接接种种日日期期。至至冰冰箱箱取取出出的的菌菌种种斜斜面面，应应在在室室温温放放置置约约30分分钟钟，待待温温度度平平衡衡后再移入接种室或超后再移入接种室或超净净工作台。工作台。点点燃燃酒酒精精灯灯，用用左左手手握握住住菌菌种种斜斜面面，将将管管口口靠靠进进火火焰焰旁旁，右右手手拿拿接接种种棒棒后后端端，将将接接种种环环烧烧红红30秒秒，随随后后将将全全部部接接种种棒棒金金属属部部分分在在火火焰焰上上烧烧灼灼，往往返返通通过过3次次。左左手手将将管管口口在在火火焰焰上上旋旋转转烧烧灼灼，右右手手用用无无名名指指、小小指指及及掌掌部部夹夹住住棉棉塞塞，拨拨开开棉棉塞塞，将将接接种种环环伸伸人人管管内内先先在在近近壁壁的的琼琼脂脂斜斜面面上上靠靠一一下下，稍稍冷冷却却再再移移至至菌菌苔苔上上，刮刮去去少少量量菌菌苔苔，随随即即取取出出接接种种棒棒，并并将将菌种管口移至火焰旁。菌种管口移至火焰旁。-精品文档-堵堵上上棉棉塞塞，左左手手将将菌菌种种管管放放下下，取取营营养养琼琼脂脂斜斜面面1支支，照照上上述述操操作作打打开开棉棉塞塞，将将接接种种环环伸伸入入管管内内至至琼琼脂脂斜斜面面的的低低部部，由由底底向向上上，将将接接种种环环轻轻贴贴斜斜面面的的表表面面曲曲折折移移动动，使使细细菌菌划划在在斜斜面面的表面上。的表面上。取取出出接接种种棒棒，在在火火焰焰旁旁将将培培养养基基管管棉棉塞塞堵堵上上，然然后后将将接接种种过过细细菌菌的的接接种种棒棒在在火火焰焰上上烧烧灼灼灭灭菌。菌。将将已已接接种种毕毕的的细细菌菌管管置置3537培培养养2224小小时时，霉霉菌菌管管一一般般置置2025霉霉菌菌培培养养箱箱内内培培养养7日日。取取出出后后放放人人冰冰箱箱保保存存，一一般般3个个月月转转种种一次。一次。-精品文档-方法方法2：菌斜面：菌斜面营营养肉养肉汤汤分离平板分离平板菌斜面菌斜面如如果果菌菌落落形形态态不不典典型型可可纯纯化化，按按下下列列方方法法传传代代（分离菌落）（分离菌落）：用用接接种种环环取取上上述述菌菌管管（斜斜面面）菌菌苔苔少少许许接接种种置置营营养养肉肉汤汤中中(5ml/支支,已已灭灭菌菌),置置3537培培养养1824小小时时后后，再再用用接接种种环环取取培培养养好好的的营营养养肉肉汤汤菌菌悬悬液液（浓浓菌菌液液），接接种种于于分分离离平平板板，置置3537培培养养1824小小时时，用用接接种种针针选选典典型型菌菌落落划划线线于于营营养养琼琼脂脂斜斜面面，置置3537培培养养1824小小时时。一一般般同同时时接接种种几几支支管管，其其中中一一支支用用于于以以后后菌菌种种传传代代或或接接种种到到半半固固体体琼琼脂脂培培养养基中，其它用做工作菌种。基中，其它用做工作菌种。-精品文档-常用分离平板：常用分离平板：l大大肠肠埃希菌埃希菌EMB琼琼脂平板脂平板-精品文档-铜绿铜绿假假单单胞菌胞菌溴化十六溴化十六烷烷三甲三甲铵琼铵琼脂培养基脂培养基-精品文档-l金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌甘露醇甘露醇氯氯化化钠琼钠琼脂培养脂培养基基-精品文档-l沙沙门门菌菌SS琼琼脂平脂平板板 -精品文档-3 菌菌悬悬液的制液的制备备l 取取上上述述培培养养好好的的菌菌种种斜斜面面移移入入接接种种室室或或净净化化工工作作台台，放放置置室室温温后后,用用接接种种环环取取菌菌苔苔少少许许接接种种置置营营养养肉肉汤汤中中(5ml/支支,已已灭灭菌菌),将将已已接接种种毕毕的的细细菌菌管管置置3537培培养养1824小小时时，取取出出备备用用。一一般般于于冰冰箱箱中中保存可用保存可用7天。天。-精品文档-4 对对照用菌液制照用菌液制备备l 取上述培养好的取上述培养好的营营养肉养肉汤汤菌菌悬悬液液（浓浓菌液）菌液）1ml，加到，加到9ml0.9%无菌无菌氯氯化化钠钠溶液混匀，溶液混匀，为为10-1，再取另一只吸管，再取另一只吸管吸取吸取10-1菌液菌液1ml加到加到9ml0.9%无菌无菌氯氯化化钠钠溶液混匀，溶液混匀，为为10-2以此以此类类推，稀推，稀释释至含活菌数在至含活菌数在50100个。用平板个。用平板计计数。数。l此稀此稀释释菌液用于菌液用于试验试验后加阳性后加阳性对对照，照，可在可在1天内使用。天内使用。-精品文档-菌种菌种菌种菌种工工作作菌菌种种培培养养基基菌菌悬悬液液对对照菌液照菌液大大肠肠杆菌杆菌营营养养琼琼脂斜面脂斜面营营养肉养肉汤汤0.9%氯氯 化化 钠钠 溶溶液液沙沙门门菌菌营营养养琼琼脂斜面脂斜面营营养肉养肉汤汤0.9%氯氯 化化 钠钠 溶溶液液金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌营营养养琼琼脂斜面脂斜面营营养肉养肉汤汤0.9%氯氯 化化 钠钠 溶溶液液铜绿铜绿假假单单胞菌胞菌营营养养琼琼脂斜面脂斜面营营养肉养肉汤汤0.9%氯氯 化化 钠钠 溶溶液液生生孢孢梭菌梭菌硫硫乙乙醇醇酸酸盐盐培培养养基基硫硫乙乙醇醇酸酸盐盐培培养养基基0.9%氯氯 化化 钠钠 溶溶液液白色念珠菌白色念珠菌真菌真菌琼琼脂斜面脂斜面真菌培养基真菌培养基0.9%氯氯 化化 钠钠 溶溶液液-精品文档-五、菌种保管五、菌种保管 菌菌种种保保管管应应有有专专人人负负责责，保保存存与与加加锁锁的的冰冰箱箱中中或或特特制制的的白白铁铁箱箱中中加加锁锁置置阴阴暗暗处处，确确保保菌菌种种安安全全。因工作因工作变动时变动时，必，必须须做好交接工作。做好交接工作。菌菌种种应应有有详详细细登登记记本本，包包括括名名称称、分分离离日日期期、鉴鉴定定日日期期、鉴鉴定定者者、主主要要鉴鉴定定性性能能，并并注注意意记记录录使用、使用、转转移及移及销销毁毁情况和原因。情况和原因。各各种种菌菌种种应应按按规规定定时时间间定定期期移移种种。一一般般每每移移种种3次次后后作作一一次次全全面面鉴鉴定定。注注意意菌菌种种有有无无污污染染和和变变异异，如如发现污发现污染和染和变变异异时时，应应及及时时更更换换。购购置置菌菌种种，应应有有介介绍绍信信。全全部部保保存存菌菌种种应应具具备备清清单单，并定期向部，并定期向部门负责门负责人人报报告。告。-精品文档-精品文档-