分子发光分析法-ppt课件

分子发光分析法分子发光分析法Molecular luminescence analysis 分子发光分析法Molecular luminescence 1 1分子发光分析法-ppt课件2 2 5-1 概述概述一、分子发光分析法及其分类一、分子发光分析法及其分类一、分子发光分析法及其分类一、分子发光分析法及其分类n n某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为种现象称为种现象称为种现象称为分子发光分子发光分子发光分子发光，在此基础上建立起来的分析，在此基础上建立起来的分析，在此基础上建立起来的分析，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法方法为分子发光分析法方法为分子发光分析法方法为分子发光分析法较高激发态较高激发态基基 态态吸收能吸收能量量受激受激光辐射光辐射退激退激分子在退激过程中以光辐射形式释放能量分子在退激过程中以光辐射形式释放能量 5-1 概述一、分子发光分析法及其分类较高激发态3 3n n根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类：以下几类：以下几类：以下几类：光致发光：以光致发光：以光致发光：以光致发光：以光源光源光源光源来激发而发光来激发而发光来激发而发光来激发而发光 电致发光：以电致发光：以电致发光：以电致发光：以电能电能电能电能来激发而发光来激发而发光来激发而发光来激发而发光 生物发光：以生物发光：以生物发光：以生物发光：以生物体释放的能量生物体释放的能量生物体释放的能量生物体释放的能量激发而发光激发而发光激发而发光激发而发光 化学发光：以化学发光：以化学发光：以化学发光：以化学反应能化学反应能化学反应能化学反应能激发而发光激发而发光激发而发光激发而发光化学发光分析法化学发光分析法化学发光分析法化学发光分析法荧光荧光荧光分析法荧光分析法磷光磷光磷光分析法磷光分析法根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类：荧光4 4二、分子发光分析法的特点二、分子发光分析法的特点1.1.灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度高n n荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光强荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光强荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光强荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光强度，可提高荧光强度）度，可提高荧光强度）度，可提高荧光强度）度，可提高荧光强度）采用高灵敏度的检测系统可大大提高采用高灵敏度的检测系统可大大提高灵敏度，检测限荧光分析法比分光光度法灵敏度，检测限荧光分析法比分光光度法低低24个数量级个数量级激发激发发射荧光发射荧光强强强强激发光激发光激发光激发光 物物物物 质质质质二、分子发光分析法的特点1.灵敏度高 采用高5 52.2.选择性好选择性好选择性好选择性好n n不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发光波长光波长光波长光波长n n不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光波长波长波长波长n n比较容易排除其它物质的干扰，选择性好比较容易排除其它物质的干扰，选择性好比较容易排除其它物质的干扰，选择性好比较容易排除其它物质的干扰，选择性好3.3.实验方法简单实验方法简单实验方法简单实验方法简单4.4.待测样品用量少待测样品用量少待测样品用量少待测样品用量少；仪器价格适中；测定范围较广；仪器价格适中；测定范围较广；仪器价格适中；测定范围较广；仪器价格适中；测定范围较广n n具发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物，具发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物，具发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物，具发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物，广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧产品分析、卫生检疫等领域。产品分析、卫生检疫等领域。产品分析、卫生检疫等领域。产品分析、卫生检疫等领域。2.选择性好6 6n n应用还不够广泛，尚待拓宽。应用还不够广泛，尚待拓宽。荧光法比磷光法应用广泛，但均不如分光光度荧光法比磷光法应用广泛，但均不如分光光度荧光法比磷光法应用广泛，但均不如分光光度荧光法比磷光法应用广泛，但均不如分光光度法广泛。法广泛。法广泛。法广泛。许多物质自身不会发射荧光（需衍生），且荧光许多物质自身不会发射荧光（需衍生），且荧光许多物质自身不会发射荧光（需衍生），且荧光许多物质自身不会发射荧光（需衍生），且荧光分析对环境极为敏感：温度、酸度、溶解氧、重分析对环境极为敏感：温度、酸度、溶解氧、重分析对环境极为敏感：温度、酸度、溶解氧、重分析对环境极为敏感：温度、酸度、溶解氧、重金属等均会产生影响或干扰。金属等均会产生影响或干扰。金属等均会产生影响或干扰。金属等均会产生影响或干扰。应用还不够广泛，尚待拓宽。7 7 5-2 分子分子荧光和分子磷光荧光和分子磷光 molecular fluorescence and phosphorescencemolecular fluorescence and phosphorescence一、荧光和磷光光谱的产生一、荧光和磷光光谱的产生（一）（一）（一）（一）激发过程激发过程激发过程激发过程n n具有不饱和基团的基态分子光照后，具有不饱和基团的基态分子光照后，具有不饱和基团的基态分子光照后，具有不饱和基团的基态分子光照后，价电子跃迁价电子跃迁价电子跃迁价电子跃迁产生荧光和磷光产生荧光和磷光产生荧光和磷光产生荧光和磷光 电子基态电子基态第一电子激发态第一电子激发态转动能极跃迁转动能极跃迁振动能级跃迁振动能级跃迁电子能级跃迁电子能级跃迁 5-2 分子荧光和分子磷光 molecular8 8n n 在光致激发和去激发光的过程中，分子中的价电子在光致激发和去激发光的过程中，分子中的价电子在光致激发和去激发光的过程中，分子中的价电子在光致激发和去激发光的过程中，分子中的价电子（、n电子）处于不同的自旋状态，通常用电子自电子）处于不同的自旋状态，通常用电子自电子）处于不同的自旋状态，通常用电子自电子）处于不同的自旋状态，通常用电子自旋状态的多重性来描述旋状态的多重性来描述旋状态的多重性来描述旋状态的多重性来描述1、光谱项的多重型：光谱项的多重型：光谱项的多重型：光谱项的多重型：MM2S+12S+1（1）单重态）单重态 M=2S+11（自旋相反）（自旋相反）（自旋相反）（自旋相反）S S0 0分子能级分子能级分子能级分子能级=电子能级电子能级电子能级电子能级(Ee)(Ee)+振动能级振动能级振动能级振动能级(Ev)(Ev)+转动能级转动能级转动能级转动能级(Er)(Er)。S S0 0,S,S1 1,S,S2 2,S,S3 3分别代表基态分别代表基态分别代表基态分别代表基态,第一第一第一第一,二二二二,三激发单重态三激发单重态三激发单重态三激发单重态（2）三重态）三重态 M=2S+13（自旋平行）（自旋平行）（自旋平行）（自旋平行）S S1 1T T1 1、T T2 2、T T3 3分别表示第一、二、三激发三重态分别表示第一、二、三激发三重态分别表示第一、二、三激发三重态分别表示第一、二、三激发三重态 在光致激发和去激发光的过程中，分子中的价电子（、n电子9 92 2、处于基态的分子吸收能量后发生跃迁：、处于基态的分子吸收能量后发生跃迁：、处于基态的分子吸收能量后发生跃迁：、处于基态的分子吸收能量后发生跃迁：2、处于基态的分子吸收能量后发生跃迁：1010当物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子能当物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子能当物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子能当物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁，级跃迁，级跃迁，级跃迁，由基态跃迁至更高的单重态，由基态跃迁至更高的单重态，由基态跃迁至更高的单重态，由基态跃迁至更高的单重态，电子自旋方电子自旋方电子自旋方电子自旋方向没有改变（相反）向没有改变（相反）向没有改变（相反）向没有改变（相反），净自旋净自旋净自旋净自旋=0=0，这种跃迁是符这种跃迁是符这种跃迁是符这种跃迁是符合光谱选律的合光谱选律的合光谱选律的合光谱选律的允许跃迁，允许跃迁，允许跃迁，允许跃迁，S0S1 n n若分子中电子跃迁过程中伴随着若分子中电子跃迁过程中伴随着若分子中电子跃迁过程中伴随着若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变自旋方向的改变自旋方向的改变自旋方向的改变（平行）（平行）（平行）（平行），由基态单重态，由基态单重态，由基态单重态，由基态单重态激发三重态，净自旋激发三重态，净自旋激发三重态，净自旋激发三重态，净自旋 0 0。这种跃迁为这种跃迁为这种跃迁为这种跃迁为禁阻跃迁，禁阻跃迁，禁阻跃迁，禁阻跃迁，S0T1 当物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃1111n n平行自旋比成对自旋稳定平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则洪特规则)，三三重态能级比相应单重态能级低重态能级比相应单重态能级低；n n 大多数有机分子的基态处于单重态；大多数有机分子的基态处于单重态；S0S2S1T1平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能1212分子发光分析法-ppt课件1313（二）去活过程（去激过程（二）去活过程（去激过程)Deactivation）电电子子处处于于激激发发态态是是不不稳稳定定状状态态，返返回回基基态态时时，通通过过辐辐射射跃迁跃迁(发光发光)和和无辐射跃迁无辐射跃迁等方式失去能量；等方式失去能量；传递途径传递途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光延迟荧光延迟荧光磷光磷光内转移内转移外转移外转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫无辐射跃迁无辐射跃迁激激发发态态停停留留时时间间短短、返返回回速速度度快快的的途途径径，发发生生的的几几率率大大，发发光强度相对大。光强度相对大。（二）去活过程（去激过程)Deactivation）14141、无辐射去激n n不伴随发光现象的过程叫无辐射去激，体不伴随发光现象的过程叫无辐射去激，体系内的多余的能量以热的形式释放系内的多余的能量以热的形式释放（1 1）内部转换（）内部转换（）内部转换（）内部转换（ICIC，Internal ConversionInternal Conversion）当当两个电子能级两个电子能级非常靠近以至其振动能级有非常靠近以至其振动能级有重叠重叠时，时，相同的多重态之间的转换相同的多重态之间的转换相同的多重态之间的转换相同的多重态之间的转换，S2 S1、T2-T1（2 2）振动驰豫（）振动驰豫（）振动驰豫（）振动驰豫（VRVR，Vibrational RelaxationVibrational Relaxation）同一电子能级同一电子能级同一电子能级同一电子能级中，从中，从中，从中，从较高振动能级到较低振动能级较高振动能级到较低振动能级较高振动能级到较低振动能级较高振动能级到较低振动能级的过程。的过程。的过程。的过程。速率极大，速率极大，10-14 10-12s 完成。完成。无论分子被激发到哪个激发单重态，均通过内转换和无论分子被激发到哪个激发单重态，均通过内转换和振动弛豫，跃回振动弛豫，跃回第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级。1、无辐射去激不伴随发光现象的过程叫无辐射去激，体系内的多1515（3 3）系间窜跃）系间窜跃）系间窜跃）系间窜跃(ISC(ISC，Intersystem Conversion)Intersystem Conversion)n n不同多重态不同多重态不同多重态不同多重态,有重叠的转动能级有重叠的转动能级有重叠的转动能级有重叠的转动能级,通过自旋通过自旋通过自旋通过自旋-轨道耦合轨道耦合轨道耦合轨道耦合改变电子自旋改变电子自旋改变电子自旋改变电子自旋,不同的多重态之间不同的多重态之间不同的多重态之间不同的多重态之间的非辐射跃迁，禁的非辐射跃迁，禁的非辐射跃迁，禁的非辐射跃迁，禁阻跃迁阻跃迁阻跃迁阻跃迁.S S1 1T T1 1 n n（4 4）外部转移（）外部转移（）外部转移（）外部转移（External ConversionExternal Conversion，ECEC）指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用而转指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用而转指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用而转指激发态分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用而转移能量，使荧光或磷光强度减弱或消灭（猝灭）移能量，使荧光或磷光强度减弱或消灭（猝灭）移能量，使荧光或磷光强度减弱或消灭（猝灭）移能量，使荧光或磷光强度减弱或消灭（猝灭）n n发生系间窜跃电子需转向，发生系间窜跃电子需转向，发生系间窜跃电子需转向，发生系间窜跃电子需转向，S S1 1T T1 1间进行，比内部转间进行，比内部转间进行，比内部转间进行，比内部转换困难换困难换困难换困难 （3）系间窜跃(ISC，Intersystem Conve1616T1S0ISCVRVRIC吸光吸光 吸光吸光S0S1S2VR：振动驰豫：振动驰豫IC：内部转换：内部转换ISC：系间窜跃：系间窜跃T1S0ISCVRVRIC吸光 吸光S0S1S217172.辐射去激辐射去激产生荧光和磷光光谱产生荧光和磷光光谱产生荧光和磷光光谱产生荧光和磷光光谱（1）荧光）荧光当电子从第一激发单重态当电子从第一激发单重态当电子从第一激发单重态当电子从第一激发单重态S S1 1的最低振动能级的最低振动能级的最低振动能级的最低振动能级基态基态基态基态S S0 0各各各各振动能级振动能级振动能级振动能级（多为多为 S1 S0跃迁跃迁）所产生的辐射叫荧光所产生的辐射叫荧光所产生的辐射叫荧光所产生的辐射叫荧光n n 荧光是荧光是荧光是荧光是相同多重态间的允许跃迁相同多重态间的允许跃迁相同多重态间的允许跃迁相同多重态间的允许跃迁，产生速度快，产生速度快，产生速度快，产生速度快，1010-9 91010-6-6s s，又叫快速荧光或瞬时荧光，又叫快速荧光或瞬时荧光，又叫快速荧光或瞬时荧光，又叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停止照射，外部光源停止照射，外部光源停止照射，外部光源停止照射，荧光马上熄灭荧光马上熄灭荧光马上熄灭荧光马上熄灭n n由于各种去活化过程的存在由于各种去活化过程的存在由于各种去活化过程的存在由于各种去活化过程的存在，无论开始电子被激发至无论开始电子被激发至无论开始电子被激发至无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐射去激消耗能量后到什么高能级，它都经过无辐射去激消耗能量后到什么高能级，它都经过无辐射去激消耗能量后到什么高能级，它都经过无辐射去激消耗能量后到S S1 1的最的最的最的最低振动能级，低振动能级，低振动能级，低振动能级，荧光辐射能通常要比激发能量低荧光辐射能通常要比激发能量低荧光辐射能通常要比激发能量低荧光辐射能通常要比激发能量低，荧光波荧光波荧光波荧光波长比激发光波长长。长比激发光波长长。长比激发光波长长。长比激发光波长长。荧荧 激激 2.辐射去激产生荧光和磷光光谱（1）荧光当电子从第一激发单1818T1S0ISCVRVRIC吸光吸光 吸光吸光 荧光荧光图图5-1 分子荧光光谱产生过程示意图分子荧光光谱产生过程示意图S0S1S2VR：振动驰豫：振动驰豫IC：内部转换：内部转换ISC：系间窜跃：系间窜跃T1S0ISCVRVRIC吸光 吸光 1919（2）磷光）磷光由第一激发三重态的最低振动能级由第一激发三重态的最低振动能级由第一激发三重态的最低振动能级由第一激发三重态的最低振动能级基态基态基态基态(T T1 1 S S0 0跃迁跃迁跃迁跃迁）产生产生产生产生a.a.电子由电子由电子由电子由S S0 0 T T1 1的可能过程：（的可能过程：（的可能过程：（的可能过程：（禁阻跃迁）禁阻跃迁）禁阻跃迁）禁阻跃迁）S S0 0 激发激发激发激发振动弛豫振动弛豫振动弛豫振动弛豫内转移内转移内转移内转移SS系间跨越系间跨越系间跨越系间跨越TT振动弛豫振动弛豫振动弛豫振动弛豫 T T1 1b.b.从从从从T T1 1 S S1 1要改变电子自旋，发光速度慢，约为要改变电子自旋，发光速度慢，约为要改变电子自旋，发光速度慢，约为要改变电子自旋，发光速度慢，约为 10 10-4-4 10s 10s，光照停止后，磷光仍可持续一段时间光照停止后，磷光仍可持续一段时间光照停止后，磷光仍可持续一段时间光照停止后，磷光仍可持续一段时间c.c.分子相互碰撞的无辐射能量埙耗大，所以磷光的波长更长分子相互碰撞的无辐射能量埙耗大，所以磷光的波长更长分子相互碰撞的无辐射能量埙耗大，所以磷光的波长更长分子相互碰撞的无辐射能量埙耗大，所以磷光的波长更长 磷磷磷磷 荧荧荧荧 激激激激 *易产生荧光易产生荧光易产生荧光易产生荧光 n n *易产生磷光易产生磷光易产生磷光易产生磷光（2）磷光由第一激发三重态的最低振动能级基态(T1 2020T1S0ISCVRVRIC吸光吸光 吸光吸光 荧光荧光 磷光磷光图图5-1 分子荧光、磷光光谱产生过程示意图分子荧光、磷光光谱产生过程示意图S0S1S2VR：振动驰豫：振动驰豫IC：内部转换：内部转换ISC：系间窜跃：系间窜跃VRT1S0ISCVRVRIC吸光 吸光 2121S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换振动弛豫S2S1S0T1吸发发系间跨越内转换振动弛豫能l 2l 1l2222二、激发光谱和荧光、磷光光谱二、激发光谱和荧光、磷光光谱n n1 1、激发光谱、激发光谱、激发光谱、激发光谱 荧光和磷光均为光致发光，合适的激发光波长需根荧光和磷光均为光致发光，合适的激发光波长需根荧光和磷光均为光致发光，合适的激发光波长需根荧光和磷光均为光致发光，合适的激发光波长需根据激发光谱确定据激发光谱确定据激发光谱确定据激发光谱确定I exex固定固定 em em 荧光波长荧光波长荧光波长荧光波长固定测量波长为荧光（或磷光）固定测量波长为荧光（或磷光）最大发射波长最大发射波长 emem，然后改变激，然后改变激发波长，根据激发光波长发波长，根据激发光波长 ex对荧对荧光（磷光）强度光（磷光）强度I作图得作图得 激发光激发光谱曲线谱曲线。激发：激发：excitated发射：发射：emission 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大二、激发光谱和荧光、磷光光谱1、激发光谱I ex固定em2323n n激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经校正后二者完全相同！这是因为经校正后二者完全相同！这是因为分子吸分子吸收光能的过程就是分子的激发过程收光能的过程就是分子的激发过程。激发光谱曲线：激发光谱曲线：I I exex吸收曲线：吸收曲线：A A 两者在性质上是不同的两者在性质上是不同的I exex固定固定 em em 荧光波长荧光波长荧光波长荧光波长激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经校正后二者完全相同！这2424I emem固定固定 ex ex 激发光波长激发光波长激发光波长激发光波长固定激发光波长固定激发光波长(选最大选最大选最大选最大激发波长激发波长激发波长激发波长),),化合物发射化合物发射化合物发射化合物发射的荧光的荧光的荧光的荧光(或磷光强度或磷光强度或磷光强度或磷光强度)与与与与发射光波长关系曲线，发射光波长关系曲线，发射光波长关系曲线，发射光波长关系曲线，以以以以I I 为纵坐标，为纵坐标，为纵坐标，为纵坐标，emem为横为横为横为横坐标得左图，即荧光物坐标得左图，即荧光物坐标得左图，即荧光物坐标得左图，即荧光物质的发射光谱质的发射光谱质的发射光谱质的发射光谱从曲线上找出最大的从曲线上找出最大的从曲线上找出最大的从曲线上找出最大的 ememn n2.发射光谱荧光光谱(或磷光光谱)由于不同物质具有不同的特征由于不同物质具有不同的特征发射峰，因而使用荧光发射光发射峰，因而使用荧光发射光谱可用于鉴别荧光物质谱可用于鉴别荧光物质I em固定 ex 激发光波长固定激发光波长(选最大激发2525n n从图中看出从图中看出n n 磷磷 荧荧 激激吸收峰荧光峰磷光峰从图中看出吸收峰荧光峰磷光峰2626分子发光分析法-ppt课件27273.3.激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系 a.Stokes a.Stokes位移位移 激激发发光光谱谱与与发发射射光光谱谱之之间间的的波波长长差差值值。发发射射光光谱谱的的波波长长比比激发光谱的长，激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 不管激发波长如何，分子受激后可到达不同能层的激发态，不管激发波长如何，分子受激后可到达不同能层的激发态，但通过去活化（内转换和振动弛豫），电子都是从第一电子但通过去活化（内转换和振动弛豫），电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层。激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层。c.镜像规则镜像规则 通通常常荧荧光光发发射射光光谱谱与与它它的的吸吸收收光光谱谱（与与激激发发光光谱谱形形状状一一样）成镜像对称关系。样）成镜像对称关系。3.激发光谱与发射光谱的关系 a.Stokes位移2828三维荧光光谱图三维荧光光谱图三维荧光光谱图2929n n c.镜像规则镜像规则 基基态态上上的的各各振振动动能能级级分分布布与与第第一一激激发发态态上上的的各各振振动能级分布类似。动能级分布类似。激发：基态激发：基态第一激发态各振动能级，振动能级越第一激发态各振动能级，振动能级越 高，能级差越大，波长就越短。高，能级差越大，波长就越短。发射荧光：从第一激发态的最低振动能级发射荧光：从第一激发态的最低振动能级基态的各基态的各 振动能级，基态的振动能级越高，其能量振动能级，基态的振动能级越高，其能量 差越小，波长就越长。差越小，波长就越长。吸收光谱中能级越高波长越短，发射光谱中能级越吸收光谱中能级越高波长越短，发射光谱中能级越高，波长越长。互为镜像高，波长越长。互为镜像 c.镜像规则 基态上的各振动能级分布与第一激发态上3030 基基态态上上的的零零振振动动能能级级与与第第一一激激发发态态的的振振动动能能级级之之间间的的跃跃迁迁几几率率最最大大，相相反反跃跃迁迁也然也然。基态上的零振动能级与第一激发态的振动能级之3131分子发光分析法-ppt课件3232二、荧光、磷光与分子结构的关系（内因）二、荧光、磷光与分子结构的关系（内因）n n产生并可观察到荧光的条件：产生并可观察到荧光的条件：产生并可观察到荧光的条件：产生并可观察到荧光的条件：i i）分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）；）分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）；）分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）；）分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）；ii ii）量子效率足够大：）量子效率足够大：）量子效率足够大：）量子效率足够大：（一）荧光效率（一）荧光效率（荧光量子产率、量子效率（荧光量子产率、量子效率）n n衡量物质发射荧光的能力衡量物质发射荧光的能力 荧光量子效率荧光量子效率 f=发荧光的分子数发荧光的分子数激发态分子总数激发态分子总数 f f 是一个物质荧光特性的重要参数，反映了荧光物是一个物质荧光特性的重要参数，反映了荧光物是一个物质荧光特性的重要参数，反映了荧光物是一个物质荧光特性的重要参数，反映了荧光物质发射荧光的能力，质发射荧光的能力，质发射荧光的能力，质发射荧光的能力，f f 越大，荧光越强，在越大，荧光越强，在越大，荧光越强，在越大，荧光越强，在0101之之之之间间间间二、荧光、磷光与分子结构的关系（内因）产生并可观察到荧光的条3333n n若以各种跃迁速率常数来表示若以各种跃迁速率常数来表示n nKf 为荧光发射过程的速率常数为荧光发射过程的速率常数取决于取决于物质的物质的化学结构化学结构n nKi 为非辐射跃迁的速率常数之和为非辐射跃迁的速率常数之和主要主要取决于取决于化学环境化学环境，也与化学结构有关，也与化学结构有关n n分析上有应用价值的荧光化合物的荧光效分析上有应用价值的荧光化合物的荧光效率在率在0.11之间之间若以各种跃迁速率常数来表示3434（二）荧光与分子结构的关系（内因）（二）荧光与分子结构的关系（内因）1、跃迁类型、跃迁类型通常，具有通常，具有 *和和n *跃迁结构的分子才跃迁结构的分子才能能吸收紫外可见光吸收紫外可见光，产生荧光，产生荧光 具有具有*跃迁的量子效率比跃迁的量子效率比n*跃迁的要跃迁的要大得多（前者大得多（前者大、寿命短）大、寿命短）总之，总之，跃迁是产生荧光的主要跃迁类型。跃迁是产生荧光的主要跃迁类型。（二）荧光与分子结构的关系（内因）总之，跃迁是产生荧35352、共轭效应共轭效应n n具有共轭体系的芳环或杂环化合物，具有共轭体系的芳环或杂环化合物，具有共轭体系的芳环或杂环化合物，具有共轭体系的芳环或杂环化合物，电子共轭电子共轭电子共轭电子共轭程度越大，越易产生荧光程度越大，越易产生荧光程度越大，越易产生荧光程度越大，越易产生荧光;环越多，共轭程度越环越多，共轭程度越环越多，共轭程度越环越多，共轭程度越大，产生荧光波长越长（红移），发射的荧光强大，产生荧光波长越长（红移），发射的荧光强大，产生荧光波长越长（红移），发射的荧光强大，产生荧光波长越长（红移），发射的荧光强度越强度越强度越强度越强 f f ex ex/nm/nm emem/nm/nm 0.11 205 278 0.29 286 3100.46 365 400苯苯萘萘蒽蒽 350菲菲线状环结构比非线状线状环结构比非线状结构的荧光波长长结构的荧光波长长2、共轭效应f ex/nm 3636 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光生荧光 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定 3，4-苯并苯并芘是强致癌物芘是强致癌物 ex ex=386 nm=386 nm emem=430 nm=430 nm 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光 37373、刚性平面结构较稳定的平面结构n n具有强荧光的分子多数有刚性平面结构，可以减具有强荧光的分子多数有刚性平面结构，可以减具有强荧光的分子多数有刚性平面结构，可以减具有强荧光的分子多数有刚性平面结构，可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分子的少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分子的少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分子的少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减少，也减少了碰撞去活的可能性，荧相互作用减少，也减少了碰撞去活的可能性，荧相互作用减少，也减少了碰撞去活的可能性，荧相互作用减少，也减少了碰撞去活的可能性，荧光强度大。光强度大。光强度大。光强度大。荧光素：氧桥把两荧光素：氧桥把两个环固定在一个平个环固定在一个平面上，具有平面结面上，具有平面结构，强荧光物质构，强荧光物质酚酞：无氧桥把两酚酞：无氧桥把两个环固定，不能很个环固定，不能很好的共平面，为非好的共平面，为非荧光物质荧光物质3、刚性平面结构较稳定的平面结构具有强荧光的分子多数有刚3838例 1，2-二苯乙烯二苯乙烯反式：平面构型 强荧光体顺式：非平面构型 非荧光体例 1，2-二苯乙烯反式：平面构型 39394、取代基效应、取代基效应n n取代基对荧光物质的荧光特征和强取代基对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影响。分成三类：度也有很大影响。分成三类：（1 1）增强荧光的取代基）增强荧光的取代基 有有-OH、-OR、-NH2、-NHR、-NR2等等给电子基团给电子基团n n由于基团的由于基团的 n 电子（孤对电子）的电子云与电子（孤对电子）的电子云与苯环上的苯环上的 轨道平行，共享了共轭轨道平行，共享了共轭 电子，电子，扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强度增强度增强4、取代基效应取代基对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影4040（2 2）减弱荧光的取代基）减弱荧光的取代基 -COOH-COOH、-NO-NO2 2 、-COOR-COOR、-NO-NO、-SH-SH 吸电子基团吸电子基团吸电子基团吸电子基团,使荧光波长使荧光波长使荧光波长使荧光波长短移，荧光强度减弱短移，荧光强度减弱短移，荧光强度减弱短移，荧光强度减弱芳环上被芳环上被芳环上被芳环上被F F、ClCl、BrBr、I I 取代后，使系间窜跃加强，取代后，使系间窜跃加强，取代后，使系间窜跃加强，取代后，使系间窜跃加强，磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子重原子重原子重原子效应。效应。效应。效应。（2）减弱荧光的取代基-COOH、-NO2、-C4141重原子效应n n溶液中若含有原子序数较高的重原子的分溶液中若含有原子序数较高的重原子的分子或离子，如溴化物、碘化物等，导致容子或离子，如溴化物、碘化物等，导致容易发生系间跨越效应称重原子效应。易发生系间跨越效应称重原子效应。n n其原因是重原子的电子自旋和轨道运动间其原因是重原子的电子自旋和轨道运动间的相互作用变大，原子核附近产生磁场，的相互作用变大，原子核附近产生磁场，使单重态向多重态系间跨越的几率增加。使单重态向多重态系间跨越的几率增加。n n含重原子的化合物荧光很弱，甚至无荧光，含重原子的化合物荧光很弱，甚至无荧光，但磷光增强。但磷光增强。重原子效应溶液中若含有原子序数较高的重原子的分子或离子，如溴4242（3 3）影响不明显的取代基）影响不明显的取代基 -NH -NH3 3+、-R-R、-SO-SO3 3HH等等等等（3）影响不明显的取代基 -NH3+、-R、4343（三）金属螯合物的荧光（三）金属螯合物的荧光n n大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某些大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某些大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某些大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某些螯合物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属离子螯合物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属离子螯合物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属离子螯合物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属离子的测定的测定的测定的测定n n不少有机配体是弱荧光体不少有机配体是弱荧光体不少有机配体是弱荧光体不少有机配体是弱荧光体 或不发荧光，但与或不发荧光，但与或不发荧光，但与或不发荧光，但与MMn+n+形形形形成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生荧光荧光荧光荧光n n例：例：例：例：8-8-羟基喹啉为弱荧光体，与羟基喹啉为弱荧光体，与羟基喹啉为弱荧光体，与羟基喹啉为弱荧光体，与MMn+n+Al Al3+3+、MgMg2+2+形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强（三）金属螯合物的荧光大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，4444三、影响荧光强度的因素（外因）三、影响荧光强度的因素（外因）1.1.溶剂的影响溶剂的影响溶剂的影响溶剂的影响 同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质不同的荧光性质不同的荧光性质不同的荧光性质 一般来说，一般来说，一般来说，一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长移，溶剂的极性增强，荧光波长长移，溶剂的极性增强，荧光波长长移，溶剂的极性增强，荧光波长长移，荧光强度增大荧光强度增大荧光强度增大荧光强度增大 2.2.温度的影响温度的影响温度的影响温度的影响低温下测定，提高灵敏度低温下测定，提高灵敏度低温下测定，提高灵敏度低温下测定，提高灵敏度 因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而非辐射跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光非辐射跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光非辐射跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光非辐射跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强度减弱。度减弱。度减弱。度减弱。温度对磷光影响更大温度对磷光影响更大温度对磷光影响更大温度对磷光影响更大三、影响荧光强度的因素（外因）1.溶剂的影响45453.pH的影响n n大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光性质受溶液光性质受溶液光性质受溶液光性质受溶液pHpH的影响很大的影响很大的影响很大的影响很大n n共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具有各自的荧光效率和荧光波长有各自的荧光效率和荧光波长有各自的荧光效率和荧光波长有各自的荧光效率和荧光波长例：例：苯酚苯酚离子化后，离子化后，荧光消失荧光消失pH1有有荧光荧光pH13无荧光无荧光3.pH的影响大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光4646n n但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，分子形式无荧光，离子化后显荧光分子形式无荧光，离子化后显荧光分子形式无荧光，离子化后显荧光分子形式无荧光，离子化后显荧光例：例：苯酚苯酚有荧光有荧光无荧光无荧光另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，分子形式无荧光，47474.内滤光作用和自吸现象内滤光作用和自吸现象 自自吸吸现现象象：内内滤滤光光中中的的一一种种，化化合合物物的的荧荧光光发发射射光光谱谱的的短短波波长长端端与与其其吸吸收收光光谱谱的的长长波波长长端端重重叠叠，产产生生自自吸吸收收；如如蒽蒽化化合合物。物。内滤光作用内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色氨酸中的重铬酸钾；光，如色氨酸中的重铬酸钾；4.内滤光作用和自吸现象 自吸现象：内滤光中的一种，化合物的48485、溶解氧的影响、溶解氧的影响n n溶液中的氧分子可使荧光溶液发射的荧光强度降低甚至熄灭。其原因较为复杂。n n溶解氧几乎对所有的有机荧光物质均有不同程度的熄灭作用，对芳香烃尤为显著。5、溶解氧的影响溶液中的氧分子可使荧光溶液发射的荧光强度降低49496、荧光猝灭、荧光猝灭n n荧光物质与溶剂或其它物质之间发生荧光物质与溶剂或其它物质之间发生化学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降化学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降或荧光效率或荧光效率 f 下降称为下降称为荧光猝灭。荧光猝灭。n n使荧光强度降低的物质称为使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂荧光猝灭剂n n氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是常见的荧光猝灭剂物等都是常见的荧光猝灭剂n n猝灭类型有：猝灭类型有：6、荧光猝灭荧光物质与溶剂或其它物质之间发生化学反应，或5050（1）碰撞猝灭（动态猝灭）碰撞猝灭（动态猝灭）n n处于单重态的荧光分子M*与猝灭剂分子Q碰撞，使M*以无辐射跃迁方式回到基态，产生猝灭。M 非辐射跃迁非辐射跃迁 M+热热 碰撞猝灭碰撞猝灭（1）碰撞猝灭（动态猝灭）处于单重态的荧光分子M*与猝灭剂分5151（2）静态猝灭（组成化合物的猝灭）静态猝灭（组成化合物的猝灭）n n部分荧光物质与猝灭剂生成非荧光的配合物。n n这一过程往往还会引起物质吸收光谱的改变。（2）静态猝灭（组成化合物的猝灭）部分荧光物质与猝灭剂生成非5252（3）转入三重态的猝灭）转入三重态的猝灭n n由于系间跨越跃迁，分子由单重态跃迁至三重态，转入三重态的分子在室温下不发光，易与其它分子碰撞而使荧光猝灭，若发射发射则为磷光。（3）转入三重态的猝灭由于系间跨越跃迁，分子由单重态跃迁至三5353（4）发生电子转移反应的猝灭）发生电子转移反应的猝灭n n猝灭剂与荧光分子相互作用时发生了电子转移引起的猝灭。n n如：甲基蓝溶液的荧光被Fe2+离子猝灭n nI-、Br-，S2O32-等易于给出电子的阴离子，使奎宁、罗丹明等荧光猝灭。（4）发生电子转移反应的猝灭猝灭剂与荧光分子相互作用时发生了5454（5）荧光自猝灭）荧光自猝灭n n单重态激发态的分子在发生荧光之前和未激发的荧光物质碰撞，浓度较高时常发生。（5）荧光自猝灭单重态激发态的分子在发生荧光之前和未激发的荧5555四、荧光强度与荧光物质浓度的关系四、荧光强度与荧光物质浓度的关系n n用强度为用强度为用强度为用强度为I I0 0的入射光，照射到液池内的荧光物质的入射光，照射到液池内的荧光物质的入射光，照射到液池内的荧光物质的入射光，照射到液池内的荧光物质时，产生荧光，荧光强度时，产生荧光，荧光强度时，产生荧光，荧光强度时，产生荧光，荧光强度I If f 用仪器测得，在荧光用仪器测得，在荧光用仪器测得，在荧光用仪器测得，在荧光浓度很稀浓度很稀浓度很稀浓度很稀(A(A0.050.05)时，荧光物质发射的荧光强度时，荧光物质发射的荧光强度时，荧光物质发射的荧光强度时，荧光物质发射的荧光强度I If f 与浓度有下面的关系与浓度有下面的关系与浓度有下面的关系与浓度有下面的关系n nI If f=f f I Ia a=f f（I I0 0-I-I）I Ia a为吸收的辐射强度为吸收的辐射强度为吸收的辐射强度为吸收的辐射强度I I0 0为入射光强度为入射光强度为入射光强度为入射光强度荧光池I I0 0I II If f荧光强度检测器n n I If f=f f（I I0 0-I-I0 01010-A-A ）=f f I I0 0 （1 1-10-10-A-A ）I=I=I I0 01010-A-A将上式展开四、荧光强度与荧光物质浓度的关系用强度为I0的入射光，照射到5656当当当当A A0.050.05时，方括号中其它各项与第一项相比可时，方括号中其它各项与第一项相比可时，方括号中其它各项与第一项相比可时，方括号中其它各项与第一项相比可忽略不计，上式简化忽略不计，上式简化忽略不计，上式简化忽略不计，上式简化 I If f=2.3 =2.3 f f I I0 0A A =2.3 =2.3 f f I I0 0 bcbc当当A0.05时，时，I If f与与与与 f f、I I0 0、和和和和c c 有关，对一给有关，对一给有关，对一给有关，对一给定物质，当激发光波长和强度一定时，定物质，当激发光波长和强度一定时，定物质，当激发光波长和强度一定时，定物质，当激发光波长和强度一定时，f f、I I0 0、和和和和b b为常数，合并为为常数，合并为为常数，合并为为常数，合并为KK If=KC 定量分析依据定量分析依据定量分析依据定量分析依据当A0.05时，方括号中其它各项与第一项相比可忽略不计，上5757n n荧光强度与物质浓度呈线性关系，荧光强度与物质浓度呈线性关系，If=KC只只有在有在浓度低时浓度低时使用，荧光物质测定的是使用，荧光物质测定的是微微量或痕量组分量或痕量组分，灵敏度高，灵敏度高n n浓度高时，浓度高时，If与与C不呈线形关系，有时不呈线形关系，有时C增增大，大，If反而降低因为公式反而降低因为公式 中后面影响，中后面影响，有时发生荧光猝灭效应有时发生荧光猝灭效应n n I If f=f f I I0 0 （1 1-10-10-A-A ）=f f I I0 0 （1 1-10-10-bcbc ）荧光强度与物质浓度呈线性关系，If=KC只有在浓度低时使用，5858（一）荧光分析仪器（一）荧光分析仪器（一）荧光分析仪器（一）荧光分析仪器主要由光源、单色器、主要由光源、单色器、主要由光源、单色器、主要由光源、单色器、液槽、检测器和显示器组成液槽、检测器和显示器组成液槽、检测器和显示器组成液槽、检测器和显示器组成与分光光度计有两点不同与分光光度计有两点不同两个单色器两个单色器检测器与激发光互成直角检测器与激发光互成直角光源光源第一单色器第一单色器激发单色器激发单色器液池液池检测器检测器第二单色器第二单色器发射单色器发射单色器检测器检测器放大器及记录器放大器及记录器 ex ex ememI I0 0I I五、荧光和磷光分析仪器五、荧光和磷光分析仪器（一）荧光分析仪器主要由光源、单色器、液槽、检测器和显示5959分子发光分析法-ppt课件60601、光源、光源n n激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽发射强度；适用波长范围宽发射强度；适用波长范围宽发射强度；适用波长范围宽n n荧光光度计中常用荧光光度计中常用荧光光度计中常用荧光光度计中常用高压汞灯高压汞灯高压汞灯高压汞灯和和和和氙弧灯氙弧灯氙弧灯氙弧灯利用汞蒸气放电发光的利用汞蒸气放电发光的利用汞蒸气放电发光的利用汞蒸气放电发光的光源；常用其发射光源；常用其发射光源；常用其发射光源；常用其发射365 nm365 nm、405 nm405 nm、436 nm 436 nm 三条谱线三条谱线三条谱线三条谱线以以以以365 nm 365 nm 的谱线最强的谱线最强的谱线最强的谱线最强应用最广泛的一种光应用最广泛的一种光源，可发射源，可发射250800nm很强的连续光源很强的连续光源1、光源激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；6161n n激光诱导荧光激光诱导荧光LIF，laser inductive fluorescence激光诱导荧光62622、单色器n n大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱获得激发光谱，又可获得荧光光谱n n第一单色器作用第一单色器作用：激发单色器激发单色器，分离出所，分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长需要的激发光，选择最佳激发波长 ex。n n第二单色器作用第二单色器作用：发射单色器，发射单色器，滤掉一些滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长测定用的荧光波长 em。在选定的在选定的 em 下测定荧光强度，定量分析下测定荧光强度，定量分析2、单色器大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分63633 3、样品池、样品池、样品池、样品池n n盛放测定溶液，通常是盛放测定溶液，通常是石英石英材料的方形池，材料的方形池，四面都透光四面都透光，只能用手拿棱或最上边，只能用手拿棱或最上边4、检测器、检测器n n荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管光电倍增管 荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光强度与激发光强度成正比，提高是因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可激发光强度可 大大提高荧光强度大大提高荧光强度5、读出装置、读出装置n n记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱和发射光谱光谱和发射光谱3、样品池盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，6464同步荧光光谱同步荧光光谱n n1971年年Lloyd首先提出用同步扫描技术来绘首先提出用同步扫描技术来绘制光谱图，即同时扫描激发单色器和发射制光谱图，即同时扫描激发单色器和发射单色器波长的条件下测绘光谱图。单色器波长的条件下测绘光谱图。n n所得的荧光强度所得的荧光强度I和波长曲线为同步荧光光和波长曲线为同步荧光光谱。谱。同步荧光光谱1971年Lloyd首先提出用同步扫描技术来绘制6565同步扫描技术同步扫描技术 根根据据激激发发和和发发射射单单色色器器在在扫扫描描过过程程中中彼彼此此间间所所保保持持的的关关系系，同同步步扫扫描描可可分分为为固固定定波波长长差差()和和固固定定能能量量差差及及可可变变波长三种：波长三种：1、固定波长差同步扫描荧光法、固定波长差同步扫描荧光法 ex-em常数常数2、固定能量差同步扫描荧光法固定能量差同步扫描荧光法 使发射单色器与激发单色器之间保持一个恒定的波数差使发射单色器与激发单色器之间保持一个恒定的波数差3、可变波长同步扫描荧光法、可变波长同步扫描荧光法 使两单色器在扫描过程中以不同的速率同时进行扫描使两单色器在扫描过程中以不同的速率同时进行扫描同步扫描技术 根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所6666 同同步步扫扫描描技技术术可可简简化化光光谱谱，谱谱带带变变窄，减少光谱重叠，提高分辨率。窄，减少光谱重叠，提高分辨率。合适的合适的可可减少光谱重叠：减少光谱重叠：酪酪氨氨酸酸和和色色氨氨酸酸的的荧荧光光激激发发光光谱谱相相似似，发发射射光光谱谱严严重重重重叠叠，但但15nm60nm60nm时时，只只显显示示色色氨氨酸酸的的特特征征光光谱谱，实实现现分分别测定。别测定。同步扫描技术可简化光谱，谱带变窄，减少光谱重叠，提高6767六、荧光光谱法与紫外六、荧光光谱法与紫外-可见分可见分光光度法比较光光度法比较n n（一）相同点n n（二）不同点六、荧光光谱法与紫外-可见分光光度法比较（一）相同点6868磷光分析法磷光分析法 phosphorescence n n与荧光相比，磷光的特点：与荧光相比，磷光的特点：与荧光相比，磷光的特点：与荧光相比，磷光的特点：n n1 1、磷光寿命比荧光长、磷光寿命比荧光长、磷光寿命比荧光长、磷光寿命比荧光长n n2 2、磷光辐射的波长比荧光长、磷光辐射的波长比荧光长、磷光辐射的波长比荧光长、磷光辐射的波长比荧光长n n（一）磷光强度：（一）磷光强度：Ip IpKCKCn n（二）温度对磷光强度的影响（二）温度对磷光强度的影响 试样需在液氮温度（试样需在液氮温度（试样需在液氮温度（试样需在液氮温度（77K77K）或液氦（）或液氦（）或液氦（）或液氦（4K4K）下测）下测）下测）下测定定定定磷光分析法 phosphorescence 与荧光相比，磷6969（三）磷光分析仪器（三）磷光分析仪器n n与荧光分析仪器相似，主要差异