薄层色谱鉴别介绍-课件

薄层色谱法薄层色谱法 薄层色谱鉴别介绍概念概念薄层色谱法薄层色谱法(TLC)(TLC)将固定相将固定相(如硅胶如硅胶)薄薄地均匀涂敷在底板薄薄地均匀涂敷在底板(或棒或棒)上，试样点在薄层一端，在展开罐内上，试样点在薄层一端，在展开罐内展开，由于各组分在薄层上的移动距离不同，展开，由于各组分在薄层上的移动距离不同，形成互相分离的斑点，测定各斑点的位置及形成互相分离的斑点，测定各斑点的位置及其密度就可以完成对试样的定性、定量分析其密度就可以完成对试样的定性、定量分析的色谱法。的色谱法。薄层色谱鉴别介绍 薄层色谱法是一种吸附薄层色谱分离法，它薄层色谱法是一种吸附薄层色谱分离法，它利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同，使在利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同，使在移动相（溶剂）流过固定相（吸附剂）的过程移动相（溶剂）流过固定相（吸附剂）的过程中，连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解中，连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而达到各成分的互相分离的目的。吸附，从而达到各成分的互相分离的目的。基本原理基本原理薄层色谱鉴别介绍v在给定的条件下（吸附剂、展开剂、板层厚在给定的条件下（吸附剂、展开剂、板层厚度等），化合物移动的距离和展开剂移动的度等），化合物移动的距离和展开剂移动的距离之比是一定的，即距离之比是一定的，即RfRf值是化合物的物理值是化合物的物理常数，其大小只与化合物本身的结构有关，常数，其大小只与化合物本身的结构有关，因此可以根据因此可以根据RfRf值鉴别化合物值鉴别化合物。薄层色谱鉴别介绍比移值比移值组分二组分二组分一组分一被分离被分离混合物混合物薄层色谱展开示意图薄层色谱展开示意图薄层色谱鉴别介绍薄层色谱法薄层色谱法优点优点 操作简单，定性结果直观操作简单，定性结果直观缺点缺点有一定毒性、定量方面的精密度有一定毒性、定量方面的精密度较差较差薄层色谱鉴别介绍v实验仪器实验仪器 载板载板 固定相（吸附剂）或载体固定相（吸附剂）或载体 涂布器涂布器 点样器点样器 展开室展开室 实验操作实验操作薄层色谱鉴别介绍实验操作实验操作1薄层板的制备薄层板的制备吸附剂（硅胶）调制玻璃板玻璃板涂布调制时慢慢搅拌，勿使产生气泡。调制时慢慢搅拌，勿使产生气泡。均匀涂布在玻璃板上，摇动摊平，晾干。均匀涂布在玻璃板上，摇动摊平，晾干。使用前放入烘箱内，在使用前放入烘箱内，在105-115105-115左右烘干左右烘干40-50min40-50min。冷。冷 却后使用。却后使用。粘合剂、添加剂粘合剂、添加剂薄层色谱鉴别介绍固定相（吸附剂）的选择固定相（吸附剂）的选择纤维素、淀粉纤维素、淀粉硅酸镁硅酸镁硫酸钙硫酸钙硅胶硅胶佛罗里硅土佛罗里硅土氧化镁氧化镁氧化铝氧化铝活性炭活性炭对极性有机物的吸附作用增强对极性有机物的吸附作用增强薄层色谱鉴别介绍v2供试品的制备供试品的制备：按照各药品质量标准：按照各药品质量标准规定的方法进行提取分离。制得的供试品应规定的方法进行提取分离。制得的供试品应放置于密塞的小瓶中，防止溶剂挥发影响点放置于密塞的小瓶中，防止溶剂挥发影响点样量。样量。3 3 对照品溶液的制备对照品溶液的制备：可按质量标准规定：可按质量标准规定精配成一定浓度的对照品溶液，置密塞小瓶精配成一定浓度的对照品溶液，置密塞小瓶中备用。标准药材对照溶液，一般需照供试中备用。标准药材对照溶液，一般需照供试品的制备方法制备。在使用对照品溶液时一品的制备方法制备。在使用对照品溶液时一定要注意将取样的毛细管充分洗干净，防止定要注意将取样的毛细管充分洗干净，防止造成对照品污染。造成对照品污染。薄层色谱鉴别介绍4 4 点样点样：按规定吸取溶液用定量点样毛细按规定吸取溶液用定量点样毛细管或色谱用微量注射器点样于薄层板上。管或色谱用微量注射器点样于薄层板上。点样基线距底边的距离为点样基线距底边的距离为1 12cm2cm，点间距，点间距一般为一般为1.0-1.5cm1.0-1.5cm。点样直径一般应小于。点样直径一般应小于5mm5mm。两个以上的点样应在同一水平线上，。两个以上的点样应在同一水平线上，并与薄层板的底边平行。点样时必须注意并与薄层板的底边平行。点样时必须注意勿损伤薄层表面。勿损伤薄层表面。薄层色谱鉴别介绍点样示意图点样示意图对照品对照品样样供试品样供试品样点样直径点样直径5mm1cm点间距点间距1.5cm1-2cm薄层色谱鉴别介绍自动点样器自动点样器毛细管点样毛细管点样薄层色谱鉴别介绍v5 5 展开展开v展开室展开室v展开剂（流动相）的选择展开剂（流动相）的选择：主要根据样品中主要根据样品中各组分的极性、溶剂对于样品中各组分溶解各组分的极性、溶剂对于样品中各组分溶解度等因素来考虑。度等因素来考虑。薄层色谱鉴别介绍展开剂的选择展开剂的选择 正己烷正己烷 环己烷环己烷 四氯化碳四氯化碳 甲苯甲苯 氯仿氯仿 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 丙酮丙酮 乙醇乙醇 甲醇甲醇 水水溶剂的洗脱能力随溶剂的极性增大而增强溶剂的洗脱能力随溶剂的极性增大而增强在一块薄层板上进行试验：在一块薄层板上进行试验：若所选展开剂使混合物中所有的组分点都移到了溶剂前沿，此溶剂的极若所选展开剂使混合物中所有的组分点都移到了溶剂前沿，此溶剂的极性过强；性过强；若所选展开剂几乎不能使混合物中的组分点移动，留在了原点上，此溶剂若所选展开剂几乎不能使混合物中的组分点移动，留在了原点上，此溶剂的极性过弱。的极性过弱。理想的展开剂应能使混合物分离后各组分的理想的展开剂应能使混合物分离后各组分的R Rf f值相差尽可能大。值相差尽可能大。各组分理想的比移值在各组分理想的比移值在0.2-0.80.2-0.8之间。之间。当一种溶剂不能很好地展开各组分时，常选择用混合溶剂作为展开剂。先当一种溶剂不能很好地展开各组分时，常选择用混合溶剂作为展开剂。先用一种极性较小的溶剂为基础溶剂展开混合物，若展开不好，用极性较大用一种极性较小的溶剂为基础溶剂展开混合物，若展开不好，用极性较大的溶剂与前一溶剂混合，调整极性，再次试验，直到选出合适的展开剂组的溶剂与前一溶剂混合，调整极性，再次试验，直到选出合适的展开剂组合。合。薄层色谱鉴别介绍1-2cm展开示意图展开示意图展开剂要接触到薄层板展开剂要接触到薄层板下沿，但切勿接触到样下沿，但切勿接触到样点。点。盖上盖子，展开。盖上盖子，展开。观察展开情况。观察展开情况。取出薄层板取出薄层板薄层色谱鉴别介绍上升法上升法倾斜上行法倾斜上行法下降法下降法展开方式示意图展开方式示意图薄层色谱鉴别介绍v影响展开的因素影响展开的因素 A A 相对湿度的影响相对湿度的影响 B B 溶剂系统的影响溶剂系统的影响C C 溶剂蒸汽的影响溶剂蒸汽的影响 D D 薄层板类型的影响薄层板类型的影响 E E 温度的影响温度的影响 F F 展距的影响展距的影响薄层色谱鉴别介绍A相对湿度的影响吸附剂的活度随相对湿度的增大而降低。20cm20cm的硅胶薄层板在50%的相对湿度中：放置3分钟 失去活性一半 放置15分钟 吸附水分达最大值薄层在相对湿度为1-80%的情况下展开，Rf值可以相差3倍。最佳相对湿度范围决定于溶质和溶剂的极性，极性越大，相对湿度范围也相应增大。薄层色谱鉴别介绍薄层色谱鉴别介绍B溶剂系统的影响溶剂系统不同，组分的分配系数不同，故Rf值不同。在平面电泳中，溶液的离子强度增大，组分的泳动速度减小。薄层色谱鉴别介绍薄层色谱鉴别介绍薄层色谱鉴别介绍预饱和分为预饱和分为2部分：部分：1 1、展开缸的预饱和：在展开之前，使展开剂、展开缸的预饱和：在展开之前，使展开剂蒸汽在展开缸内饱和，使展开缸汽液状态达蒸汽在展开缸内饱和，使展开缸汽液状态达到一定的稳定状态，此时尚未放薄层板。到一定的稳定状态，此时尚未放薄层板。2 2、薄层板的预饱和：在展开缸饱和后，放入、薄层板的预饱和：在展开缸饱和后，放入已经点样完毕的薄层板，进行饱和，使薄层已经点样完毕的薄层板，进行饱和，使薄层板整体差异性减小。具体做法是：在双槽层板整体差异性减小。具体做法是：在双槽层析玻璃缸内析玻璃缸内,将其中一个槽内倒入配好的展开将其中一个槽内倒入配好的展开剂剂,另一个槽内放入薄层板另一个槽内放入薄层板,盖好上面的玻璃盖好上面的玻璃盖盖,这时候就是在预饱和。这时候就是在预饱和。C C 溶剂蒸汽的影响溶剂蒸汽的影响薄层色谱鉴别介绍v关于饱和时间：根据展开剂而定。v1、展开剂组分极性差异不大的且挥发性好的，时间可以短一些，一般1520分钟即可；2、极性差异大的，且挥发性差异大的，时间要长一些，一般要3060分钟；3、极性差异大的，且挥发性差异不大的，时间要长一些，一般要2030分钟；4、极性差异不大，且挥发性差不大的，时间可以短一些，一般要1015分钟；5、水饱和有机试剂或有机试剂饱和水的，时间一般都比较长，3060分钟。6、另外，大家打开关闭展开缸的速度要快，放板取板的速度也要快，大家打开关闭展开缸的速度要快，放板取板的速度也要快，v否则预饱和的效果全被你后期的否则预饱和的效果全被你后期的v操作给抹杀了！操作给抹杀了！薄层色谱鉴别介绍薄层色谱鉴别介绍薄层色谱鉴别介绍薄层色谱鉴别介绍D1滤纸纸色谱中所用的滤纸性质对分离效果有很大影响。对滤纸的要求是：1.物理性质均匀、质地均一、厚薄一致，否则斑点畸形，Rf值改变;2.具有一定的机械强度;3.纤维松紧程度适当;4.具有一定的纯度;5.纸面洁净，不含有溶于水及有机溶剂的物质。D薄层板类型的影响薄层板类型的影响薄层色谱鉴别介绍色谱用滤纸纤维的方向会影响组分的分离，色谱用滤纸纤维的方向会影响组分的分离，故每次展开时故每次展开时,滤纸的纤维方向应一致滤纸的纤维方向应一致.商品滤纸有厚纸、薄纸、慢速、快速、中商品滤纸有厚纸、薄纸、慢速、快速、中速等不同类型可供选择速等不同类型可供选择.薄层色谱鉴别介绍D2薄层板有资料表明，60%以上的薄层分离用硅胶作为吸附剂，其次为纤维素、氧化铝、聚酰胺、硅藻土等。固定相薄层色谱鉴别介绍硅胶硅胶是一种弱酸性的多孔性无定形吸附剂。硅胶表面有很多硅醇基(SiOH)，通过硅原子上的-OH基团与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而表现出吸附性能。硅醇基的数目越大，则吸附能力增强。硅胶也能吸附水分而成为水合硅醇基。薄层色谱鉴别介绍氧化铝氧化铝由氢氧化铝高温脱水而成。按制备方法不同，氧化铝可分为三种：碱性氧化铝：pH=910,可分离合成染料，生物碱等酸性氧化铝：pH=45，适应于酸性物质的分离中性氧化铝：pH=77.5，适于分离醛酮，以及对酸碱 不稳定的脂和内酯等化合物氧化铝的活度与其含水量有关，含水量大，则吸附能力小。活性级别含水量%-361015薄层色谱鉴别介绍纤维素纤维素分子中带有许多羟基，亲水性强，分离原理与纸色谱相似，但分离效果和分离速度均比纸色谱佳，可以代替纸色谱.薄层色谱鉴别介绍普通纤维素：天然纤维素、高纯度纤维素、微晶纤维素。乙酰化纤维素：用乙酸将纤维素结构上的羟基酯化而成，适用于反相色谱。离子交换纤维素：纤维素经化学反应，使分子中一部分羟基上的氢被阳离子或阴离子交换基取代而成，具有离子交换树脂的性质。纤维素的种类有：薄层色谱鉴别介绍聚酰胺聚酰胺是由酰胺聚合而成的高分子聚合物。薄层色谱中常用的聚己内酰胺，结构如下：酰胺中心的酰胺基可与酚类、酸类、硝基类等化合物形成氢键而对这些物质产生吸附作用。应用：蛋白质、肽、多糖、核苷酸等的分离。-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C-N-nHO薄层色谱鉴别介绍葡聚糖葡聚糖是一种由葡萄糖残基构成的多糖物质。葡聚糖是一种由葡萄糖残基构成的多糖物质。葡聚糖凝胶是由一定分子量的葡聚糖悬浮于有葡聚糖凝胶是由一定分子量的葡聚糖悬浮于有机相中，加入交联剂交联聚合而成。机相中，加入交联剂交联聚合而成。在葡聚糖分子上引入有机基团，则可成为亲脂性在葡聚糖分子上引入有机基团，则可成为亲脂性凝胶。凝胶。在葡聚糖凝胶上引入羧甲基、磺乙基等，则制成在葡聚糖凝胶上引入羧甲基、磺乙基等，则制成具有离子交换性质的葡聚糖凝胶离子交换剂。具有离子交换性质的葡聚糖凝胶离子交换剂。应用：蛋白质、肽、多糖、核苷酸等的分离应用：蛋白质、肽、多糖、核苷酸等的分离薄层色谱鉴别介绍薄层板的种类v载板材料：玻璃片、铝箔、塑料片等v薄层板类型：1.硬板：在固定相中加入粘合剂（煅石膏、淀粉）;2.软板：不加粘合剂;3.烧结玻璃板：将玻璃粉与硅胶、氧化铝等吸附剂按一定比例混合后，以丙酮、乙醇或水等溶剂调成匀浆，涂成薄层，经高温烧结而成。薄层色谱鉴别介绍吸附剂及预制板包装上的符号及含义vG加入一定的煅石膏作粘合剂vH不加粘合剂，供制各种软板用vF254加入对254nm波长能发荧光的物质vF254s加入抗酸性荧光指示剂薄层色谱鉴别介绍薄层色谱鉴别介绍薄层色谱鉴别介绍薄层色谱鉴别介绍E温度的影响温度影响物质的分配系数KD，同时也影响纤维的水合作用，改变固定相的量。薄层色谱鉴别介绍薄层色谱鉴别介绍F F 展距的影响展距的影响薄层色谱鉴别介绍v薄层色谱法薄层色谱法-跑板跑板v点样点样v用微量进样器进行点样。点样前，先用铅笔在层析上距末端2cm处轻轻画一横线，然后用毛细管吸取样液在横线上轻轻点样，点的斑点较小，展开的色谱图分离度好，颜色分明。如果要重新点样，一定要等前一次点样残余的溶剂挥发后再点样（用电吹风的热风吹干再点用电吹风的热风吹干再点），以免点样斑点过大。一般斑点直径大于2mm，不宜超过5mm。点好样的薄层板用电吹风的热风吹干。底线距基点好样的薄层板用电吹风的热风吹干。底线距基线线125cm，点间距离为，点间距离为lcm左右左右，样点与玻样点与玻璃边缘距离至少璃边缘距离至少lcm，为防止边缘效应，为防止边缘效应，薄层色谱鉴别介绍v2.展开展开v将点了样的薄层板放在盛在有展开剂的展开槽中，由于毛细管作用，展开溶剂在薄层板上缓慢前进，前进至一定距离后，取出薄层板，样品组分固移动速度不同而彼此分离。v展开室应预饱和。为达到饱和效果，可在室中加入足够量的展开剂，密封室顶的盖。v展开剂一般为两种以上互溶的有机溶剂，并且临用时新配为宜。强烈振摇使混合液充分混匀，放置，如果分层，取用体积大的一层作为展开剂。绝对不应该把各组成溶液倒入展开缸，振摇展开缸来配制展开剂。混合混合不均匀和没有分液的展开剂，会造成层析的完全失败不均匀和没有分液的展开剂，会造成层析的完全失败。各组成溶剂的比例准确度对不同的分析任务有不同的要求，尽量达到实验室仪器的最高精确度，比如：取1ml的溶剂，应使用1ml的单标移液管，v薄层板点样后，应待溶剂挥发完，再放人展开室中展开。v展开应密闭，展距一般为展距一般为815cm。薄层板放入展开室时，展开剂不能没过样点。一般情况下，展展开剂浸入薄层下端的高度不宜超过开剂浸入薄层下端的高度不宜超过0.5cm。v展开剂展开剂每次展开后，都需要更换，不能重复使用不能重复使用。（展开缸中得展开剂弃去，密封在容量瓶中得展开剂可在当天使用）v展开后的薄层板用适当的方法，使溶剂挥发完全使溶剂挥发完全，然后进行检视。vRf值一般控制在值一般控制在0.30.8，当Rf值很大或很小时，应适当改变流动相的比例。薄层色谱鉴别介绍v3.斑点的检出斑点的检出v展开后的薄层板经过干燥后，常用紫外光灯照射或用显色剂显色检出斑点。对于无色组分，在用显色剂时，显色剂喷洒要均匀，量显色剂喷洒要均匀，量要适度要适度。紫外光灯的功率越大，暗室越暗，检出效果就越好。v展开分离后，化合物在薄层板上的位置用比移值(Rf值)来表示。化化合物斑点中心至原点的合物斑点中心至原点的距离与溶剂前沿至原点的距离的比值就是该距离与溶剂前沿至原点的距离的比值就是该化合物的化合物的Rf值。值。薄层色谱鉴别介绍v注意事项：注意事项：v一预饱和分为一预饱和分为2部分部分：v1、展开缸的预饱和：在展开之前，使展开剂蒸汽在展开缸内饱和，使展开缸汽液状态达到一定的稳定状态，此时尚未放薄层板。v2、薄层板的预饱和：在展开缸饱和后，放入已经点样完毕的薄层板，进行饱和，使薄层板整体差异性减小。具体做法是具体做法是：在双槽层析玻璃缸内,将其中一个槽内倒入配好的展开剂,另一个槽内放入薄层板,盖好上面的玻璃盖,这时候就是在预饱和。v关于饱和时间：根据展开剂而定。1、展开剂组分极性差异不大的且挥发性好的，时间可以短一些，一般1520分钟即可；2、极性差异大的，且挥发性差异大的，时间要长一些，一般要3060分钟；3、极性差异大的，且挥发性差异不大的，时间要长一些，一般要2030分钟；4、极性差异不大，且挥发性差不大的，时间可以短一些，一般要1015分钟；5、水饱和有机试剂或有机试剂饱和水的，时间一般都比较长，3060分钟。6、另外，大家打开关闭展开缸的速度要快，放板取板的速度也要快，否则预饱大家打开关闭展开缸的速度要快，放板取板的速度也要快，否则预饱和的效果全被你后期的和的效果全被你后期的v操作给抹杀了！操作给抹杀了！薄层色谱鉴别介绍v二展开室应放在水平、稳定的实验台上，不能有阳光直射，展开室应放在水平、稳定的实验台上，不能有阳光直射，也不能在通风处放置也不能在通风处放置，离开热源，避免温度波动对分离不利；光敏物质的分离应将展开室置于暗处进行。v三点样时间不应超过三分钟。点样时间不应超过三分钟。硅胶的硅醇基以氢键形式优先吸附水，物理吸附使硅胶的活度降低，影响了弱极性物质的吸附，化合物的Rf值相应地增大。硅胶薄层的吸水速度很快，当用预先经过活化的薄层板，在点样过程中干燥的薄层会立即吸附空气中的水蒸气，在数分钟内达到平衡，吸附水蒸气的量决定于点样速度即暴露在空气中暴露在空气中的时间和空气的相对湿度。Dallas指出0.25mm厚、20cm20cm的硅胶薄层板在50%相对湿度中放置约约3min就失去活性的一半就失去活性的一半，而放置15min时吸附的水分已达到最大值。在用相同条件分离同一组化合物得到的结果不能重现时，必须考虑到相对湿度对展开的影响，特别是我国南北地区湿度相差很大；即使在同一实验室冬夏季节不同湿度也有明显差别，如果不注意湿度的影响就得不到预期的结果。薄层色谱鉴别介绍v展开时的最佳相对湿度范围决定于溶质和溶剂的极性，随溶质和溶剂极性的增加相对湿度的范围也相应地增大，在用苯在用苯作展开剂时作展开剂时，适宜的相对湿度范围很窄，因此湿度对分离的影响十分明显；当用乙醚为展开剂时，当用乙醚为展开剂时，相对湿度在20%-50%,时均可得到重现的结果；如用氯仿如用氯仿-异丙醇异丙醇-25%氨水氨水（45:45:10）为展开剂时，）为展开剂时，则相对湿度在20%-80%范围内可得到较好的重现性。这种差别来自展开室中展开剂蒸气有取代吸附在薄层上水分子的趋势，取代量决定于展开剂蒸气的极性和量；苯为非极性溶剂，其取代作用小，因为苯与水极性相差很大，即使吸附水量有微小的变化也能引起Rf值的改变，甚至在薄层上形成“两个前沿”而使色谱畸形。而在用而在用极性溶剂如乙醇、甲醇或氨水为展开剂时，极性溶剂如乙醇、甲醇或氨水为展开剂时，则吸附的水分子被大量取代，原来吸附的水分下降，这时平衡主要决定于高浓度的溶剂蒸气。展开剂极性越大，薄层上吸附水蒸气的影响越小，因此能在一较宽的湿度范围内得到重现性较好的结果。薄层色谱鉴别介绍v四在点样前薄层板在110活化30min，然后用另一块玻璃板盖在活化后的薄层上，只有原点区露出以便点样。总之在相对湿度50%-60%时，平衡后的硅胶含水量约13%，多数情况下，是适用的。薄层色谱鉴别介绍五五展开中斑点异常现象的探讨展开中斑点异常现象的探讨边缘效应边缘效应：同一种化合物，在同一块薄层板上，用同一：同一种化合物，在同一块薄层板上，用同一展开剂，在同一层析缸内展开后，薄层中部的斑点比展开剂，在同一层析缸内展开后，薄层中部的斑点比薄层两侧边缘处的斑点的薄层两侧边缘处的斑点的 Rf Rf值小即为边缘效应。值小即为边缘效应。常用的解决办法：常用的解决办法：增加展开室（层析缸）中溶剂蒸气饱和度。增加展开室（层析缸）中溶剂蒸气饱和度。选用较合适的单一展开剂代替混合展开剂。选用较合适的单一展开剂代替混合展开剂。采用共沸混合展开剂代替一般混合展开剂。采用共沸混合展开剂代替一般混合展开剂。在薄层板的两边各刮去约在薄层板的两边各刮去约5mm5mm的吸附剂有助于防止的吸附剂有助于防止 边缘效应。边缘效应。薄层色谱鉴别介绍薄层色谱鉴别介绍三用紫外仪三用紫外仪显色用喷雾器显色用喷雾器薄层色谱鉴别介绍薄层色谱鉴别介绍