纯化系统--课件

纯化系统（AutoPurification System）制备色谱简介制备色谱简介2一、色谱发展和制备色谱分类二、制备色谱基本理论三、制备型高效液相色谱四、Waters纯化系统操作规程五、应用实例3一、色谱发展和制备色谱分类41980s1960s1950s1903色谱发展史1938茨维特，一种新型的吸附现象及其在生化分析中的应用Kuhn和Lederer从维生素B中分离出B6获得了1938年的诺贝尔化学奖。1940s1941年，Martin和Synge提出液液分配色谱法，塔板理论1942年，Martin等发展了纸色谱1952年，Martin和James提出气液分配色谱法，诺贝尔奖1956年，VanDeemter色谱速率理论，用于气相色谱1958年，Golay提出毛细管柱气相色谱1962年，Klesper提出超临界流体色谱1963年，Giddings奠定了现代液相色谱理论基础60年代中后期，逆流色谱，凝胶渗透色谱，亲和色谱1969年，现代液相色谱受到重视高速逆流色谱出现毛细管电泳发展2000s超高效液相色谱多维分离联用技术5模拟移动床色谱高速逆流色谱高压制备色谱低压及中压制备色谱经典柱色谱制备薄层色谱制制备色色谱分分类吸附柱色谱离子交换色谱凝胶柱色谱亲和柱色谱干柱色谱分配柱色谱低压：0.5Mpa中压：0.5-2Mpa固定相不需要载体制备型分离重点两相溶剂系统的选择石油工业和糖工业尤适用于两组分混合物分离6二、制备色谱基础理论7分析和制备有什么异同？制备方法中关注的参数有哪些？如何选择制备柱的尺寸？如何做到分析到制备的线性放大？制备中难点有哪些？8分析制备目的尽可能多的获得样品的组成信息尽可能短的时间内获得尽可能多的纯组分或化合物对象大部分或者全部样品组分通常只对一个或几个样品组分感兴趣进样量仅够检测用即可尽可能加大进样量柱内径1-5 mm5 mm-500 mm填料粒径流速溶解度通常不重要非常重要9色谱的基本理论及有关参数色谱的基本理论及有关参数 两大理论：塔板理论:阐明了色谱、蒸馏和萃取之间的相似性，将色谱柱设想成由许多液液萃取单元或理论塔板组成；相似于精馏过程，色谱分离也是一个分配平衡过程.N=16(tR/wb)2N=5.54(tR/w1/2)2速率理论:研究各种动力学因素对峰展宽的影响。H=A+B/u+Cu10相关参数分离度（分辨率）：在色谱分离过程中表示两组分相互分离的程度，一般情况下，分离度大于1.5时称为完全分离11只有峰窄而间距大的分离度是令人满意的。在色谱分析中要求：两组分的保留值差别要足够大两色谱峰要足够窄待测组分的分离度要足够大，分离过程要尽可能短相关参数理论塔板数(N)：描述色谱峰谱带展宽的程度，是物理因素,N=16(tR/W)2选择因子()：描述两个被分离组份分离的好坏程度，是化学因素,=tR2/tR1容量因子(k)：表达了被分离组分与柱填料之间作用的强弱,k=(tR-t0)/t012分离因子，柱效，容量因子对分离的影响相关参数13上样量(Capacity)(Capacity):纯化过程中，目标物质的上样量。可以是体积也可以是质量。回收率(Recovery)(Recovery):产品贵重时此项很重要。流动相的条件、环境会影响它。分离度(Resolution)(Resolution):在纯化的最后阶段，此项很关键，尤其是杂质的结构和目的物结构相似时。14相关参数HPLC柱内径/mm柱长/cm填料粒径/m处理量/次分析4-525-505几十到几百g半制备8-1025-505-105-50mg制备20-2225-505-200.1-1g大制备20g/d15制备规模16确定样品信息开发分析级分离方法增加进样量放大为制备级方法测定纯度分析放大到制备17分析放大到制备确定样品信息样品性质组成、基体、复杂性、性质、相态、浓度、价值产品纯度微量天然产物，70%核磁或者红外测试的样品，95%以上定量分析用的标准品，99%以上18分析放大到制备开发分析级分离方法良好的分离选择性足够的柱效N合适的溶剂强度:容量因子k19分析放大到制备增加进样量过载体体积过载制备色谱上样量应控制在组分制备色谱上样量应控制在组分峰的峰的容量因子下降容量因子下降10%左右左右流动相中溶液浓度质量量过载20分析放大到制备放大为制备级方法上样量流速梯度坡度S=constant=Change in%organicVm=Volume of the column tG=Gradient time F=Flow21分析放大到制备测定纯度96.8%79.9%HPLCUPLC除去组分中的溶剂：氮吹，旋蒸，冷冻干燥纯度：HPLC，TCL,回收率：重量，活性22制备中的难点速度上样量分离度相互制约的“三角形”23制备中的难点上样量选择的流动相好的分离度，较高的溶解度进样体积增大至最大进样体积了解样品的性质如对离子型样品改变pH或者缓冲盐的浓度改变溶解样品的溶剂如甲醇、DMSO等（前提保证分离度）温度待分离成分呈单一主峰不易分开的两组分目的组分含量少24制备中的难点分离度待分离成分呈单一主峰25目的组分含量少26样品量对主峰前面微量组分峰宽的影响样品量对主峰前面微量组分峰宽的影响不易分开的两组分2728三、纯化系统(Autopurification)29输液系统进样系统色谱柱检测系统馏分收集系统数据处理系统纯化系统30输液系统单向阀AB过滤器31输液系统单向阀故障单向阀堵死，液体不出来，压力无显示单向阀被污染，压力波动大处理方法：纯水超声10min，甲醇超声15min过滤器故障过滤器堵塞，压力升高处理方法：纯水超声10min，甲醇超声15min32进样系统 33色谱柱分析制备粒径Atlantis T35 mXBridge5 mXTerra5 mXUnion10 mXAmide5 mXAmide10 m34检测系统紫外检测器蒸发光散射检测器质谱检测器35馏分收集系统UV Fraction ManagerWaters 2767 Sample ManagerWaters AutoPurification System 操作规程操作程序操作程序开机开机首先准备新鲜流动相、洗针溶液和洗泵溶液T1为弱洗：与初始流动相条件相同；T2为强洗：样品溶解度较好的溶剂；seal wash：10%MeOH/90%H2O.打开计算机电源，进入windows操作系统打开检测器，2767，2545BSM，515泵等待仪器通过自检后在打开Masslynx软件登录登录MasslynxMasslynx v4.1 v4.1软件，进入运行样品界面软件，进入运行样品界面点击点击FractionlynxFractionlynxCollectionCollection Control Control将将FractionlynxFractionlynx激活激活设置收集位置设置收集位置新建新建ProjectProjectFileProject WizardYes输入Project名称（建每个使用人员用个人的名称）Description（可根据需要选择是否填写）点击“next”如已建如已建ProjectProject，则打开自己的，则打开自己的ProjectProjectFlieOpen ProjectYes制备常用的制备常用的Sample listSample listSample listSample list各参数含义各参数含义参数含义分析制备File Name样品名称File TextInlet File液相方法Bottle进样位置Inject Volume进样体积Fraction File制备收集方法Fraction Trigger 1/2收集触发Wavelength A/B紫外检测波长编辑编辑sample listsample list从该表格中选出需要的参数从该表格中选出需要的参数保存保存sample listsample listInletInlet FileFile在Inlet File方法框中任选一方法，点击鼠标右键，选择“edit”Inlet MethodInletInletInlet选择溶剂（A1,B1或A2,B2）编辑梯度方法设置压力限制（pressure limits）设置运行时间（run time）AutosamplerAutosampler选择进样口：分析或制备选择进样方式：Partical loop or full loop选择是否将样品打入定量环中央选择洗针方式Afer injector or after collectionDetectorDetector选择扫描波长注意运行时间和液相时间一致保存保存Inlet FileInlet FileInlet FileInlet File的调用的调用进样位置设置进样位置设置bottlebottle编辑编辑Fraction FileFraction File右键editGeneralGeneralFraction DectectionFraction:可选择on 或 offPeak：峰的类型analysis或preparativeMultiple FractionsMax.Fractions per：最大收集组分数Max.Tubes per：最大收集管数Rinse Between Fractions：Rinse time：收集口清洗时间，010sTimingTimingSolvent Front Delay：如果想忽略前面的溶剂峰，可设置一个solvent front delay time，0 to 6000 seconds.Split/Collector Delay：延迟时间，需要测定，不同的流速有不同的延迟时间。Minimum Fraction：最小组分宽度Time:0 to 300 secondsVolume:0 to 1000 mL or 0 to 1000 tubesRecommendation:3 secondsMaximum Fraction：最大组分宽度Time:0 to 600seconds(dependent on chromatography)Volume:0 to 100 mLVolume(tubes)Maximum Tube Fill：试管体积百分数0 to 100%.Mumber of Fractions to：UVUVMin.Intensity Threshold：最小阈值Max.Intensity：最大阈值Peak start:Use MIT Only:根据上面设的阈值Leading Edge Gradient(%):oSpecify the minimum gradient required to start fraction collection by specifying one of these values:o50%1.5 timeso100%2.0 timeso200%3.0 timesPeak start:Below Gradient%:0100%Use Max Fraction Width:Use MIT only:Trailing Valley%:oTo trigger peak termination based on a downward slope,enter a value less than 0.oTo trigger termination close to the valley,enter 0.oTo trigger peak termination based on an upward slope,enter a value greater than 0 Timed eventsTimed eventsDisable/Enable Collect:Any peaks detected after disabling fraction collection and before enabling collection are not collected.At the start of a run,collection is always enabled.与前面设置的阈值相关，只有达到阈值才收集Start/Stop Collect：跟时间有关跟前面的阈值无关UV MIT:阈值的时间事件保存保存Fractionlynx MethodFractionlynx MethodFraction Trigger1/2：选择需要按照何种模式触发收集，在Fraction Trigger中双击可以进行选择Wavelength A/B:选择需要检测的波长制备样品前的灌注系统制备样品前的灌注系统Prime system：灌注进样系统Probe/port wash：清洗进样口调原点位置调原点位置查看数据查看数据模拟收集方法模拟收集方法模拟收集方法的界面模拟收集方法的界面模拟的结果模拟的结果关机程序关机程序清洗系统及色谱柱停流动相流速关闭仪器电源退出Masslynx软件，关计算机注意事项注意事项常见故障常见故障五、应用实例雷公藤中化合物的制备雷公藤中化合物的制备AB分析色谱Atlantis T34.6x150mm制备色谱Atlantis T330 x100mm二次制备二次制备精细组分中化合物的制备谢谢！