朗伯比尔定律课件

1第第10章章 吸光光度法吸光光度法10.1 概述概述10.2 吸光光度法基本原理吸光光度法基本原理10.3 分光光度计及吸收光谱分光光度计及吸收光谱10.4 显色反应及影响因素显色反应及影响因素10.5 吸光光度分析及误差控制吸光光度分析及误差控制10.6 光度分析法的应用光度分析法的应用1第10章 吸光光度法10.1 概述2化学分析与仪器分析方法比较化学分析与仪器分析方法比较化学分析化学分析(Chemical analysis)：常量组分常量组分(1%),Er 0.1%0.2%依据化学反应依据化学反应,使用玻璃仪器使用玻璃仪器 仪器分析仪器分析(Instrumental analysis)：微量组分微量组分(105：超高灵敏；超高灵敏；=(610）104：高灵敏；高灵敏；104)c.产物的化学组成稳定产物的化学组成稳定d.化学性质稳定化学性质稳定e.反应和产物有明显的颜色差别反应和产物有明显的颜色差别(60nm)显色反应要求显色反应要求52a.选择性好 显色反应要求53配位反应配位反应氧化还原反应氧化还原反应2 显色反应类型显色反应类型偶氮胂偶氮胂III53配位反应氧化还原反应2 显色反应类型偶氮胂III54离子缔合反应离子缔合反应成盐反应成盐反应 AuCl4-罗丹明罗丹明B吸附显色反应吸附显色反应 达旦黄测定达旦黄测定Mg(II),Mg(OH)2吸附达旦黄呈红色吸附达旦黄呈红色 54离子缔合反应成盐反应 AuCl4-罗丹明B吸附显色反应553 显色剂显色剂无机显色剂无机显色剂:过氧化氢，硫氰酸铵，碘化钾过氧化氢，硫氰酸铵，碘化钾有机显色剂：有机显色剂：偶氮类：偶氮胂偶氮类：偶氮胂III553 显色剂无机显色剂:有机显色剂：56三苯甲烷类三苯甲烷类 三苯甲烷酸性染料三苯甲烷酸性染料 铬天菁铬天菁S S 三苯甲烷碱性染料三苯甲烷碱性染料 结晶紫结晶紫 56三苯甲烷类 三苯甲烷碱性染料 结晶紫 57邻菲罗啉类：新亚铜灵邻菲罗啉类：新亚铜灵 肟类：丁二肟肟类：丁二肟 57邻菲罗啉类：新亚铜灵 肟类：丁二肟 584 多元配合物多元配合物 多多元元配配合合物物是是由由三三种种或或三三种种以以上上的的组组分分所所形形成成的配合物。的配合物。应应用用较较多多的的是是由由一一种种金金属属离离子子与与两两种种配配位位体体所所组组成成的的三三元元配配合合物物。三三元元配配合合物物在在吸吸光光光光度度分分析析中应用较普遍。重要的三元配合物类型中应用较普遍。重要的三元配合物类型。584 多元配合物59三元混配配合物三元混配配合物 金金属属离离子子与与一一种种配配合合剂剂形形成成未未饱饱和和配配合合物物，然然后后与与另另一一种种配配合合剂剂结结合合，形形成成三三元元混混合合配配位位配配合合物，简称三元混配配合物。物，简称三元混配配合物。例例如如，V(V)，H2O2和和吡吡啶啶偶偶氮氮间间苯苯二二酚酚(PAR)形形成成1:1:1的的有有色色配配合合物物，可可用用于于钒钒的的测测定定，其其灵灵敏敏度高，选择性好。度高，选择性好。59三元混配配合物 60*离离子子缔缔合合物物 金金属属离离子子先先与与配配位位剂剂生生成成配配阴阴离离子子或或配配阳阳离离子子，再再与与带带反反电电荷荷的的离离子子生生成成离离子子缔缔合合物物。主主要要用用于于萃萃取取光光度度法法。如如，Ag+与与1，10-邻邻二二氮氮菲菲形形成成阳阳离离子子，再再与与溴溴邻邻苯苯三三酚酚红红的的阴阴离离子子形形成成深深蓝蓝色色的的离离子子缔缔合合物物。用用F-、H2O2、EDTA作掩蔽剂，可测定微量作掩蔽剂，可测定微量Ag+。60*离子缔合物 金属离子先与配位剂生成配阴离子或配阳离61*离子缔合物离子缔合物 作作为为离离子子缔缔合合物物的的阳阳离离子子，有有碱碱性性染染料料、1，10-邻邻二二氮氮菲菲及及其其衍衍生生物物、安安替替比比林林及及其其衍衍生物、氯化四苯砷生物、氯化四苯砷(或磷、锑或磷、锑)等等;作作为为阴阴离离子子，有有X-，SCN-，ClO4-，无无机机杂杂多酸和某些酸性染料等。多酸和某些酸性染料等。61*离子缔合物62 *金属离子金属离子-配位剂配位剂-表面活性剂体系表面活性剂体系 金金属属离离子子与与显显色色剂剂反反应应时时，加加入入某某些些表表面面活活性性剂剂，可可以以形形成成胶胶束束化化合合物物，它它们们的的吸吸收收峰峰向向长长波波方方向向移移动动(红移红移)，而测定的灵敏度显著提高。，而测定的灵敏度显著提高。62 *金属离子-配位剂-表面活性剂体系 63 *金属离子金属离子-配位剂配位剂-表面活性剂体系表面活性剂体系 常常用用的的表表面面活活性性剂剂有有溴溴化化十十六六烷烷基基吡吡啶啶、氯氯化化十十四四烷烷基基二二甲甲基基苄苄胺胺、氯氯化化十十六六烷烷基基三三甲甲基基铵铵、溴溴化化十十六六烷烷基基三三甲甲基基铵铵、溴溴化化羟羟基基十十二二烷烷基基三三甲甲基基铵铵、OP乳化剂。乳化剂。例例如如，稀稀土土元元素素、二二甲甲酚酚橙橙及及溴溴化化十十六六烷烷基基吡吡啶啶反反应应，生生成成三三元元配配合合物物，在在pH 89时时呈呈蓝蓝紫紫色色，用用于痕量稀土元素总量的测定于痕量稀土元素总量的测定。63 *金属离子-配位剂-表面活性剂体系 64杂多酸杂多酸 溶溶液液在在酸酸性性的的条条件件下下，过过量量的的钼钼酸酸盐盐与与磷磷酸酸盐盐、硅硅酸酸盐盐、砷砷酸酸盐盐等等含含氧氧的的阴阴离离子子作作用用生生成成杂杂多多酸酸，作作为为吸吸光光光光度度法法测测定定相相应应的的磷磷、硅硅、砷砷等等元元素素的的基基础础。杂杂多多酸酸法法需需要要还还原原反反应应的的酸酸度度范范围较窄，必须严格控制反应条件。围较窄，必须严格控制反应条件。64杂多酸 65杂多酸杂多酸 很很多多还还原原剂剂都都可可应应用用于于杂杂多多酸酸法法中中。氯氯化化亚亚锡锡及及某某些有机还原剂，些有机还原剂，例例：1-氨氨基基-2-萘萘酚酚-4-磺磺酸酸加加亚亚硫硫酸酸盐盐和和氢氢醌醌常常用用于于磷的测定。磷的测定。硫硫酸酸肼肼在在煮煮沸沸溶溶液液中中作作砷砷钼钼酸酸盐盐和和磷磷钼钼酸酸盐盐的的还还原原剂。剂。抗坏血酸也是较好的还原剂。抗坏血酸也是较好的还原剂。65杂多酸 665、显色条件的选择、显色条件的选择 实验条件包括实验条件包括:溶液酸度，显色剂用量，试剂溶液酸度，显色剂用量，试剂加入顺序，显色时间，显色温度，有机配合物的加入顺序，显色时间，显色温度，有机配合物的稳定性及共存离子的干扰等稳定性及共存离子的干扰等。（1）溶液的酸度）溶液的酸度 M+HR=MR+H+*影响显色剂的平衡浓度和颜色影响显色剂的平衡浓度和颜色*影响被测金属离子的存在状态影响被测金属离子的存在状态*影响配合物的组成影响配合物的组成*pH与吸光度关系曲线确定与吸光度关系曲线确定pH范围。范围。665、显色条件的选择67（2）显色剂的用量）显色剂的用量 M(被测组分被测组分)+R(显色剂显色剂)=MR(有色配合物有色配合物)为使显色反应进行完全，需加入过量的显色剂。但为使显色反应进行完全，需加入过量的显色剂。但显色剂不是越多越好。有些显色反应，显色剂加入太显色剂不是越多越好。有些显色反应，显色剂加入太多，反而会引起副反应，对测定不利。在实际工作中多，反而会引起副反应，对测定不利。在实际工作中根据实验结果来确定显色剂的用量。根据实验结果来确定显色剂的用量。67（2）显色剂的用量68（3）显色反应时间）显色反应时间 有有些些显显色色反反应应瞬瞬间间完完成成，溶溶液液颜颜色色很很快快达达到到稳稳定定状状态态，并并在在较较长长时时间间内内保保持持不不变变;有有些些显显色色反反应应虽虽能能迅迅速速完完成成，但但有有色色配配合合物物的的颜颜色色很很快快开开始始褪褪色色;有有些些显显色色反反应应进进行行缓缓慢慢，溶溶液液颜颜色色需需经经一一段段时时间间后后才稳定。制作吸光度才稳定。制作吸光度-时间曲线确定适宜时间。时间曲线确定适宜时间。68（3）显色反应时间69（4）显色反应温度）显色反应温度 显显色色反反应应大大多多在在室室温温下下进进行行。但但是是，有有些些显显色色反反应应必需加热至一定温度完成必需加热至一定温度完成。（5）溶剂）溶剂 有有机机溶溶剂剂降降低低有有色色化化合合物物的的解解离离度度，提提高高显显色色反反应应的的灵灵敏敏度度。如如在在Fe(SCN)3的的溶溶液液中中加加入入丙丙酮酮颜颜色色加加深深。还还可可能能提提高高显显色色反反应应的的速速率率，影影响响有有色色配配合合物物的溶解度和组成等。的溶解度和组成等。69（4）显色反应温度70（6）干扰及其消除方法）干扰及其消除方法 试试样样中中存存在在干干扰扰物物质质会会影影响响被被测测组组分分的的测测定定。例例如如干干扰扰物物质质本本身身有有颜颜色色或或与与显显色色剂剂反反应应，在在测测量量条条件件下下也也有有吸吸收收，造造成成正正干干扰扰。干干扰扰物物质质与与被被测测组组分分反反应应或或与与显显色色剂剂反反应应，便便显显色色反反应应不不完完全全，也也会会造造成成干干扰扰。干干扰扰物物质质在在测测量量条条件件下下从从溶溶液液中中析析出出，便溶液变混浊，无法准确测定溶液的吸光度。便溶液变混浊，无法准确测定溶液的吸光度。70（6）干扰及其消除方法71a.控制溶液酸度控制溶液酸度b.加加入入掩掩蔽蔽剂剂 选取的条件是掩蔽剂不与待测离子作用，掩蔽剂以及它与干扰物质形成的配合物的颜色应不干扰待测离子的测定。c.利用氧化还原反应，改变干扰离子的价态利用氧化还原反应，改变干扰离子的价态 d.用用参参比比溶溶液液消消除除显显色色剂剂和和某某些些共共存存有有色色离离子子的的干干扰。扰。消除的干扰方法：消除的干扰方法：71a.控制溶液酸度消除的干扰方法：72e.选择适当的波长选择适当的波长f.当当溶溶液液中中存存在在有有消消耗耗显显色色剂剂的的干干扰扰离离子子时时，可可通通过增加显色剂的用量来消除干扰。过增加显色剂的用量来消除干扰。g.分离分离 以上方法均不奏效时，预先分离的方法。以上方法均不奏效时，预先分离的方法。72e.选择适当的波长73化学法化学法 Co2,Fe3+Co2+FeF63-Co(SCN)2(蓝蓝)NaFSCNCo2+Fe2+,Sn4+(2)Sn2+Co(SCN)2SCN测测Co2(含含Fe3+)掩蔽法掩蔽法氧化还原法氧化还原法73化学法 Co2,Fe3+Co2+Co(SCN)2(74测测Co2(生成配合物性质不同生成配合物性质不同)Co2+,Zn2+,Ni2+,Fe2+CoR,ZnR NiR,FeRCoR,Zn2+,Ni2+,Fe2+钴试剂钴试剂RH+如不能通过控制酸度和掩蔽的办法消除干扰，如不能通过控制酸度和掩蔽的办法消除干扰，则需采取分离法。则需采取分离法。测测Fe3(控制控制pH)Fe3+,Cu2+FeSS（紫红）紫红）Cu2+pH 2.5SS磺基水杨酸磺基水杨酸74测Co2(生成配合物性质不同)Co2+,Zn2+,75 为了使测定结果有较高的灵敏度，应选择被测物质的最大吸收波长的光作为入射光，这称为“最大吸收原则最大吸收原则”。选用最大吸收波长的光进行分析，不仅灵敏度高，且能减少或消除由非单色光引起的对朗伯-比尔定律的偏离。在最大吸收波长处有其他吸光物质干扰测定时，则应根据入射光波长。1 测量波长和吸光度范围的选择测量波长和吸光度范围的选择（1）测量波长的选择）测量波长的选择10.5 吸光光度分析及误差控制吸光光度分析及误差控制75 为了使测定结果有较高的灵敏度，应选择被测物质的最大76例例 丁二酮肟光度法测钢中镍丁二酮肟光度法测钢中镍配合物丁二酮肟镍的最大吸收配合物丁二酮肟镍的最大吸收波长为波长为470 nm，但试样中的铁但试样中的铁用酒石酸钠掩蔽后，在用酒石酸钠掩蔽后，在470 nm处也有一定吸收，干扰镍的测处也有一定吸收，干扰镍的测定。为避免铁的干扰，可以选定。为避免铁的干扰，可以选择波长择波长 520 nm进行测定，虽然进行测定，虽然测镍的灵敏度有所降低，但酒测镍的灵敏度有所降低，但酒石酸铁不干扰镍的测定。石酸铁不干扰镍的测定。76例 丁二酮肟光度法测钢中镍77选择原则：选择原则：“吸收最大，干扰最小吸收最大，干扰最小”灵敏度选择性77选择原则：“吸收最大，干扰最小”灵敏度选择性78（2）吸光度范围的选择）吸光度范围的选择 从从仪仪器器测测量量误误差差的的角角度度来来看看，为为使使测测量量结结果果得得到到较较高高的的准准确确度度，一一般般应应控控制制标标准准溶溶液液和和被被测测试试液液的的吸吸光光度度在在0.20.8范范围围内内。可可通通过过控控制制溶溶液液的浓度的浓度或或选择不同厚度的吸收池选择不同厚度的吸收池来达到目的。来达到目的。78（2）吸光度范围的选择 79（3）参比溶液的选择参比溶液的选择 利利用用参参比比溶溶液液来来调调节节仪仪器器的的零零点点，可可消消除除由由吸吸收收池池壁壁及及溶溶剂剂对对入入射射光光的的反反射射和和吸吸收收带带来来的的误误差差，扣除干扰的影响。扣除干扰的影响。79（3）参比溶液的选择80参比溶液选择参比溶液选择：A）试液及显色剂均无色，蒸馏水作参比溶液。试液及显色剂均无色，蒸馏水作参比溶液。B）显显色色剂剂为为无无色色，被被测测试试液液中中存存在在其其他他有有色色离离子，用不加显色剂的被测试液作参比溶液。子，用不加显色剂的被测试液作参比溶液。C）显显色色剂剂有有颜颜色色，可可选选择择不不加加试试样样溶溶液液的的试试剂剂空白作参比溶液。空白作参比溶液。80参比溶液选择：81D）显色剂和试液均有颜色，可将一份试液加入显色剂和试液均有颜色，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂及其他试剂均按试液与显色剂作用，而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入，以此作为参比溶液，这样就可测定方法加入，以此作为参比溶液，这样就可以消除显色剂和一些共存组分的干扰。以消除显色剂和一些共存组分的干扰。E）改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显色反应，以此溶液作为参比溶液消除干扰。色反应，以此溶液作为参比溶液消除干扰。81D）显色剂和试液均有颜色，可将一份试液加入适当掩蔽剂822 标准曲线的制作标准曲线的制作 光光吸吸收收定定律律:吸吸光光度度与与吸吸光光物物质质的的含含量量成成正正比比，光光度法进行定量的基础，标准曲线制作根据度法进行定量的基础，标准曲线制作根据。方方法法:在在选选择择的的实实验验条条件件下下分分别别测测量量一一系系列列不不同同含含量量的的标标准准溶溶液液的的吸吸光光度度，以以标标准准溶溶液液中中待待测测组组分分的的含含量量为为横横坐坐标标，吸吸光光度度为为纵纵坐坐标标作作图图，得得到到一一条条通通过过原原点点的的直直线线，称称为为标标准准曲曲线线，此此时时测测量量待待测测溶溶液液的的吸吸光光度度，在在标标准准曲曲线线上上可可以以查查到到与与之之相相对对应应的的被被测物质的含量。测物质的含量。822 标准曲线的制作83理论基础：朗伯理论基础：朗伯-比尔定律比尔定律 相同条件下相同条件下测定不同浓度标准测定不同浓度标准溶液的吸光度溶液的吸光度AAc 作图作图83理论基础：朗伯-比尔定律 相同条件下84*有时标准曲线不通过原点。有时标准曲线不通过原点。可能是由于参比溶液选择不当，可能是由于参比溶液选择不当，吸收池厚度不等，吸收池位置吸收池厚度不等，吸收池位置不妥，吸收池透光面不清洁等不妥，吸收池透光面不清洁等原因所引起的。若有色配合物原因所引起的。若有色配合物的解离度较大，特别是当溶液的解离度较大，特别是当溶液中还有其他配位剂时，使被中还有其他配位剂时，使被测物质在低浓度时显色不完全。测物质在低浓度时显色不完全。找出原因，加以避免。找出原因，加以避免。84*有时标准曲线不通过原点。85依据依据Beer定律，定律，A与与C关系应为经关系应为经过原点的直线过原点的直线3 对朗伯对朗伯-比尔定律的偏离比尔定律的偏离85依据Beer定律，3 对朗伯-比尔定律的偏离86 在吸光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线在吸光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线的情况，特别是当吸光物质浓度较高时，明显地看到的情况，特别是当吸光物质浓度较高时，明显地看到通过原点向浓度轴弯曲的现象通过原点向浓度轴弯曲的现象(吸光度轴弯曲吸光度轴弯曲)。这种。这种情况称为偏离朗伯情况称为偏离朗伯-比尔定律。若在曲线弯曲部分进比尔定律。若在曲线弯曲部分进行定量，将会引起较大的误差。行定量，将会引起较大的误差。86 在吸光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线87偏离朗伯比尔定律偏离朗伯比尔定律的原因主要是仪器或溶液的原因主要是仪器或溶液的实际条件与朗伯的实际条件与朗伯-比尔定比尔定律所要求的理想条件不一致。律所要求的理想条件不一致。87偏离朗伯比尔定律88（1）非单色光引起的偏离）非单色光引起的偏离 *朗朗伯伯-比比尔尔定定律律只只适适用用于于单单色色光光，但由于单色器色散能力的限制和出口狭缝需要保持一定的宽度，所以目前各种分光光度计得到的入射光实际上都是具有某一波段的复合光。由于物质对不同波长光的吸收程度的不同，因而导致对朗伯比尔定律的偏离。88（1）非单色光引起的偏离89*克服非单色光引起的偏离的措施克服非单色光引起的偏离的措施 使用比较好的单色器，从而获得纯度较高的使用比较好的单色器，从而获得纯度较高的 “单色光单色光”，使标准曲线有较宽的线性范围。，使标准曲线有较宽的线性范围。入射光波长选择在被测物质的最大吸收处，保入射光波长选择在被测物质的最大吸收处，保证测定有较高的灵敏度，此处的吸收曲线较为平证测定有较高的灵敏度，此处的吸收曲线较为平坦，在此最大吸收波长附近各波长的光的坦，在此最大吸收波长附近各波长的光的值大值大体相等，由于非单色光引起的偏离要比在其他波体相等，由于非单色光引起的偏离要比在其他波长处小得多。长处小得多。测定时应选择适当的浓度范围，使吸光度读数测定时应选择适当的浓度范围，使吸光度读数在标准曲线的线性范围内。在标准曲线的线性范围内。89*克服非单色光引起的偏离的措施90（2 2）介质不均匀引起的偏离介质不均匀引起的偏离 朗朗伯伯比比尔尔定定律律要要求求吸吸光光物物质质的的溶溶液液是是均均匀匀的的。如如果果被被测测溶溶液液不不均均匀匀，是是胶胶体体溶溶液液、乳乳浊浊液液或或悬悬浮浮液液时时，入入射射光光通通过过溶溶液液后后，除除一一部部分分被被试试液液吸吸收收外外，还还有有一一部部分分因因散散射射现现象象而而损损失失，使使透透射射比比减减少少，因因而而实实测测吸吸光光度度增增加加，便便标标准准曲曲线线偏偏离离直直线线向向吸吸光光度度轴弯曲。故在光度法中应避免溶液产生胶体或混浊。轴弯曲。故在光度法中应避免溶液产生胶体或混浊。90（2）介质不均匀引起的偏离91（3）由于溶液本身的化学反应引起的偏离）由于溶液本身的化学反应引起的偏离 溶溶液液中中的的吸吸光光物物质质常常因因解解离离、缔缔合合、形形成成新新化化合合物物或或互互变变异异构构等等化化学学变变化化而而改改变变其其浓浓度度，导导致偏离朗伯致偏离朗伯-比尔定律。比尔定律。91（3）由于溶液本身的化学反应引起的偏离92A 解离解离 大大部部分分有有机机酸酸碱碱的的酸酸式式、碱碱式式对对光光有有不不同同的的吸吸收收性性质质，溶溶液液的的酸酸度度不不同同，酸酸(碱碱)解解离离程程度度不不同同，导导致致酸酸式式与与碱碱式式的的比比例例改改变变，使使溶溶液液的的吸吸光光度度发发生改变。生改变。92A 解离 93B 配位配位 显显色色剂剂与与金金属属离离子子生生成成的的是是多多级级配配合合物物，且且各各级配合物对光的吸收性质不同级配合物对光的吸收性质不同 例例如如在在Fe()与与SCN-的的配配合合物物中中，Fe(SCN)3颜颜色色最最深深，Fe(SCN)2+颜颜色色最最浅浅，故故SCN-浓浓度度越越大大，溶液颜色越深，即吸光度越大。溶液颜色越深，即吸光度越大。93B 配位 94 c 缔合缔合 例如在酸性条件下，例如在酸性条件下，CrO42-会缔合生成会缔合生成Cr2O72-，而它们对光的吸收有很大的不同。而它们对光的吸收有很大的不同。在分析测定中，要控制溶液的条件，使被测在分析测定中，要控制溶液的条件，使被测组分以一种形式存在，以克服化学因素所引起的组分以一种形式存在，以克服化学因素所引起的对朗伯比尔定律的偏离。对朗伯比尔定律的偏离。Beer定律适用的另一个前提：稀溶液定律适用的另一个前提：稀溶液浓度过高会使浓度过高会使c与与A关系偏离定律关系偏离定律94 c 缔合 例如在酸性条件下，CrO42-会缔954 吸光度测量的误差吸光度测量的误差 在吸光光度分析中，仪器测量不准确也是误差在吸光光度分析中，仪器测量不准确也是误差的主要来源。任何光度计都有一定的测量误差。的主要来源。任何光度计都有一定的测量误差。这些误差可能来源于光源不稳定，实验条件偶然这些误差可能来源于光源不稳定，实验条件偶然变动，读数不准确等。变动，读数不准确等。954 吸光度测量的误差96光度计中光度计中,透射比的标尺刻度均匀。吸光度标透射比的标尺刻度均匀。吸光度标尺刻度不均匀。对于同一仪器尺刻度不均匀。对于同一仪器,读数的波动对透射读数的波动对透射比为一定值比为一定值;而对吸光度读数波动则不再为定值。而对吸光度读数波动则不再为定值。吸光度越大吸光度越大,读数波动所引起的吸光度误差也越大读数波动所引起的吸光度误差也越大96光度计中,透射比的标尺刻度均匀。吸光度标97 光度计的读数误差一般为光度计的读数误差一般为0.22(T),由于由于T与浓度与浓度c不是线性关系，故不同浓度时的不是线性关系，故不同浓度时的T引引起的误差不同。起的误差不同。100806040200T%c1 c2 c3 T T T-透光率读数误差透光率读数误差 c c1c1 c2c2 c3c397 光度计的读数误差一般为0.22(T),由于T98 透射比很小或很大时，浓度测量误差都较大，透射比很小或很大时，浓度测量误差都较大，即光度测量最好选吸光度读数在刻度尺的中间即光度测量最好选吸光度读数在刻度尺的中间而不落两端。而不落两端。待测溶液的透射比待测溶液的透射比T在在15%65%之间，或使之间，或使吸光度吸光度A在在0.20.8之间之间，才能保证测量的相对误，才能保证测量的相对误差较小。差较小。98 透射比很小或很大时，浓度测量误差都较大，即光度测量99仪器测量误差仪器测量误差99仪器测量误差100仪器测量误差仪器测量误差100仪器测量误差101浓度测量的相对误差与浓度测量的相对误差与T(或或A)的关系的关系1086420204060800.70.40.20.1AT%Er(36.8)0.434实际工作中，应控制实际工作中，应控制T在在1565,A在在0.20.8之间之间101浓度测量的相对误差与T(或A)的关系10864202010210.6 光度分析法的应用和其它吸光光度法光度分析法的应用和其它吸光光度法一、一、单一组分测定单一组分测定1)金属离子金属离子:Fe-phen,Ni-丁二酮肟丁二酮肟,Co-钴试钴试剂剂2)磷的测定磷的测定:DNA中含中含P9.2%,RNA中含中含P9.5%,可得核酸量可得核酸量.H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO412MoO3+12NH4NO3+12H2O磷钼黄磷钼黄(小小)磷钼磷钼(V)蓝蓝(大大)Sn2+10210.6 光度分析法的应用和其它吸光光度法一、单一103二、多组分的测定二、多组分的测定a)在 1处测组分处测组分x,在 2处测组分处测组分yb)在 1处测组分处测组分x;在在 2处测总吸处测总吸收收,扣除扣除x吸收吸收,可求可求y103二、多组分的测定在1处测组分x,在2处测组分yb104二、多组分的测定二、多组分的测定 x 1,y 1,x 2,y 2由由x,y标液在标液在 1,2处分别测得处分别测得c)x,y组分不能直接测定组分不能直接测定A1=x 1bcx+y 1bcy (在 1处测得处测得A1)A2=x 2bcx+y 2bcy (在 2处测得处测得A2)104二、多组分的测定 xl1,eyl1,exl105三、三、示差吸光光度法示差吸光光度法普通分光光度法一般只适于测定微量组分，当待测普通分光光度法一般只适于测定微量组分，当待测组分含量较高时，将产生较大的误差。需采用示差组分含量较高时，将产生较大的误差。需采用示差法。即提高入射光强度，并法。即提高入射光强度，并采用浓度稍低于待测溶采用浓度稍低于待测溶液浓度的标准溶液作参比溶液液浓度的标准溶液作参比溶液A=Ax-As=b(cx-cs）=bc105三、示差吸光光度法普通分光光度法一般只适于测定微量组106三、三、示差吸光光度法示差吸光光度法设：待测溶液浓度为设：待测溶液浓度为cx，标准溶液浓度为标准溶液浓度为cs(cs cx)Ax=b cx，As=b cs=x-s=b(cx-cs）=bc 测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液的吸光度之差溶液的吸光度之差。由标准曲线上查得相应的。由标准曲线上查得相应的c值，则待测溶液浓度值，则待测溶液浓度cx：cx=cs+c 106三、示差吸光光度法设：待测溶液浓度为cx，标准溶液浓107示差法标尺扩展原理：示差法标尺扩展原理：普通法：普通法：cs的的T=10%；cx的的T=5%示差法：示差法：cs 做参比，做参比，调调T=100%则：则：cx的的T=50%；标尺扩展标尺扩展10倍倍107示差法标尺扩展原理：普通法：cs的T=10108四、四、双波长分光光度法双波长分光光度法 不需空白溶液作参比；两个单色器获得两不需空白溶液作参比；两个单色器获得两束单色光束单色光(1 1和和2 2)；以参比波长以参比波长1 1处的吸光处的吸光度度A A11作为参比，来消除干扰。在分析浑浊或作为参比，来消除干扰。在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时显示出很大的优越背景吸收较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面都比性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提高。单波长法有所提高。108四、双波长分光光度法 不需空白溶液作参比；两个109双波长分光光度法双波长分光光度法A A2 A1 (2 1)b c 两波长处测得的吸光度差值两波长处测得的吸光度差值A与待测组分浓与待测组分浓度度c成正比。成正比。1和和2分别表示待测组分在分别表示待测组分在1和和2处的摩尔吸光系数。处的摩尔吸光系数。测量波长测量波长2和参比波长和参比波长1的选择与组合的选择与组合109双波长分光光度法A A2 A1 (2110基本要求：基本要求：在选定的两个波长在选定的两个波长1和和2处待测组分的吸光度应处待测组分的吸光度应具有足够大的差值。具有足够大的差值。选定的波长选定的波长1和和2处干扰组分应具有相同吸光度，处干扰组分应具有相同吸光度，即：即：Ay=A y2 A y1=0故：故：Ax+y=A x=(x2x1)bcx此时：测得的吸光度差此时：测得的吸光度差A只与待测组分只与待测组分x的浓度呈线的浓度呈线性关系，而与干扰组分性关系，而与干扰组分y无关。若无关。若x为干扰组分，则也为干扰组分，则也可用同样的方法测定可用同样的方法测定y组分。组分。110基本要求：在选定的两个波长1和2处待测组分的吸光111双波长分光光度法消除干扰双波长分光光度法消除干扰在 2，A 2=Ax2+Ay2在在 1，A 1=Ax1+Ay1 A=A 2-A 1 =Ax2+Ay2(Ax1+Ay1)=Ax2 Ax1 =AxAy2 Ay1 Ax=(x2 x1)bcx消除了消除了y的干扰的干扰X被测被测Y干扰干扰211Ay1AX1Ay2AX2A/nm111双波长分光光度法消除干扰在2，A2=Ax2+112双波长分光光度法消除浑浊背景干扰双波长分光光度法消除浑浊背景干扰 1 2AA 1-A 2=A Ac例例 牛奶中微牛奶中微量量Fe的测定的测定112双波长分光光度法消除浑浊背景干扰 1 113五五 一元弱酸离解常数的测定一元弱酸离解常数的测定HL HLKaH+L/HL配制一系列配制一系列c相同相同,pH不同的溶液不同的溶液,测测A(设设b=1cm).113五 一元弱酸离解常数的测定HL 114五五 一元弱酸离解常数的测定一元弱酸离解常数的测定HL HLKaH+L/HL高酸度下，几乎全部以高酸度下，几乎全部以HL存在，可测得存在，可测得AHLHLc(HL)；低酸度下，几乎全部以低酸度下，几乎全部以L存在，可测得存在，可测得 AL Lc(HL).代入整理：代入整理：114五 一元弱酸离解常数的测定HL 115HLL或115HLL 或116MO吸收曲线吸收曲线Aa(HL)Ab(L)123456Ab654321Aa350400450500550600/nmA曲线曲线pHpH1 11.10,1.381.10,1.382 22.652.653 33.063.064 43.483.485 53.983.986 65.53,6.805.53,6.80由每份溶液的由每份溶液的一对一对pH、A，可求得一个可求得一个Ka,取平均值即可取平均值即可.116MO吸收曲线Aa(HL)Ab123456Ab65432117MO离解常数的测定离解常数的测定作图法作图法AHL3.32(pKa)123456ApH=pKapHAL0.60.40.20-0.2-0.4-0.63.04.0pH3.34117MO离解常数的测定作图法AHL3.32(pKa)12118六六 配合物组成的测定配合物组成的测定(1)饱和法饱和法(摩尔比法摩尔比法):固定固定cM,改变改变cR 固定一种组分固定一种组分(通常是金属离子通常是金属离子M)的浓度，改的浓度，改变配位剂变配位剂(R)的浓度，得到一系列的浓度，得到一系列R/M比值比值不同的溶液，并配制相应的试剂空白作参比液，不同的溶液，并配制相应的试剂空白作参比液，分别测定其吸光度。以吸光度分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标，为纵坐标，R/M为横坐标作图。为横坐标作图。118六 配合物组成的测定(1)饱和法(摩尔比法):固定1191:13:1c(R)/c(M)A1.0 2.0 3,0 1191:13:1c(R)/c(M)A1.0 120（2）连续变化法）连续变化法(又称等摩尔系列法又称等摩尔系列法)cM+cR=c，改改变变cM和和cR的的相相对对量量，配配制制一一系系列列溶溶液液，在在有有色色配配合合物物的的最最大大吸吸收收波波长长处处测测量量这这一一系系列列溶溶液液的的吸吸光光度度。当当溶溶液液中中配配合合物物MRn浓浓度度最大时，最大时，cR/cM比值为比值为n 当当cM/c为为0.5时，配位比为时，配位比为1:1 当当cM/c为为0.33，配位比为，配位比为1:2 当当cM/c=0.25时，配位比为时，配位比为1:3120（2）连续变化法(又称等摩尔系列法)121等摩尔连续变化法等摩尔连续变化法:M:R=1:10.50.33cM/ccM/cM:R=1:2121等摩尔连续变化法:M:R=1:10.50.33cM/c122例：例：精精密密称称取取B12样样品品25.0mg，用用水水溶溶液液配配成成100ml。精精密密吸吸取取10.00ml，又又置置100ml容容量量瓶瓶中中，加加水水至至刻刻度度。取取此此溶溶液液在在1cm的的吸吸收收池池中中，于于361nm处处测测定定吸吸光光度度为为0.507，求求B12的百分含量？（百分吸光系数为的百分含量？（百分吸光系数为207）解：解：122例：精密称取B12样品25.0mg，用水溶液配成123 分析应用分析应用 痕量金属分析痕量金属分析临床分析临床分析食品分析食品分析123 分析应用 痕量金属分析124邻二氮菲分光光度法测定铁邻二氮菲分光光度法测定铁 根据朗伯根据朗伯-比耳定律：比耳定律：A=bc当入射光波长当入射光波长及光程及光程b一定时，在一定浓度一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓与该物质的浓度度c成正比。成正比。只要绘出以吸光度只要绘出以吸光度A为纵坐标，浓度为纵坐标，浓度c为横为横坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，就可坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。的含量。124邻二氮菲分光光度法测定铁 根据朗伯-比耳定律：A=b125在在pH=29的溶液中，的溶液中，Fe2+与邻二氮菲与邻二氮菲(phen)生成稳定生成稳定的桔红色配合物的桔红色配合物Fe(phen)32+此配合物的此配合物的lgK稳稳=21.3，摩尔吸光系数，摩尔吸光系数510=1.1104 Lmol-1cm-1，而，而Fe3+能与邻二氮菲生成能与邻二氮菲生成3 1配合物，呈配合物，呈淡蓝色，淡蓝色，lgK稳稳=14.1。所以在加入显色剂之前，应用盐。所以在加入显色剂之前，应用盐酸羟胺酸羟胺(NH2OHHCl)将将Fe3+还原为还原为Fe2+，其反应式：，其反应式：2Fe3+2NH2OHHCl 2Fe2+N2+H2O+4H+2Cl-测定时控制溶液的酸度为测定时控制溶液的酸度为pH5较为适宜。较为适宜。125在pH=29的溶液中，Fe2+与邻二氮菲(phen)1261.标准溶液配制标准溶液配制10gmL-1铁标准溶液配制铁标准溶液配制 系列标准溶液配制系列标准溶液配制:取取6个个50mL容量瓶，分别加容量瓶，分别加入铁标准溶液入铁标准溶液0.00，2.00，4.00，6.00，8.00，10.00mL，然后加入，然后加入1mL盐酸羟胺，盐酸羟胺，2.00mL邻二邻二氮菲，氮菲，5mLNaAc溶液，每加入一种试剂都应初步溶液，每加入一种试剂都应初步混匀。用去离子水定容至刻度，充分摇匀，放置混匀。用去离子水定容至刻度，充分摇匀，放置10min。1261.标准溶液配制1272.吸收曲线的绘制吸收曲线的绘制用用1cm比色皿，以试剂空白为参比溶液，选定浓度下，比色皿，以试剂空白为参比溶液，选定浓度下，测定各溶液的吸光度。在坐标纸上，以波长为横坐测定各溶液的吸光度。在坐标纸上，以波长为横坐标，吸光度标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。为纵坐标，绘制标准曲线。510nm1272.吸收曲线的绘制510nm1283.标准曲线标准曲线(工作曲线工作曲线)的绘制的绘制用用1cm比色皿，以试剂空白为参比溶液，在选定波长比色皿，以试剂空白为参比溶液，在选定波长下，测定各溶液的吸光度。在坐标纸上，以铁含量下，测定各溶液的吸光度。在坐标纸上，以铁含量为横坐标，吸光度为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。为纵坐标，绘制标准曲线。1283.标准曲线(工作曲线)的绘制