结构生物学介绍及进展课件

结构生物学结构生物学，结构生物学的定义结构生物学的定义顾名思义，结构生物学就是研究各种生物顾名思义，结构生物学就是研究各种生物大分子（蛋白质、核酸、糖类等）的结构，大分子（蛋白质、核酸、糖类等）的结构，结构与功能的关系，以及如何在生物体内结构与功能的关系，以及如何在生物体内发挥作用的学科。发挥作用的学科。结构的重要性结构的重要性生物大分子的功能主要取决于其结构。生物大分子的功能主要取决于其结构。结构的异常会引起功能的改变，也是所谓结构的异常会引起功能的改变，也是所谓“构像病构像病”的原因。的原因。疯牛病等构像病的罪魁祸首疯牛病等构像病的罪魁祸首正常的正常的致病的致病的由于结构的变化，由于结构的变化，导致了疯牛病、克导致了疯牛病、克雅氏病（雅氏病（；）等传染性脑海绵）等传染性脑海绵状病变（）。状病变（）。分子生物学：分子生物学：现代生物学的主流方向现代生物学的主流方向分子生物学是现代生物学中最重要的学科，分子生物学是现代生物学中最重要的学科，几乎每年的诺贝尔化学奖，生理学或医学几乎每年的诺贝尔化学奖，生理学或医学奖都授予这方面的研究。奖都授予这方面的研究。研究各种生物大分子的功能以及在生物体研究各种生物大分子的功能以及在生物体中的生物化学过程，是分子生物学最重要中的生物化学过程，是分子生物学最重要的任务。的任务。结构在现代生物学里的中心地位结构在现代生物学里的中心地位在分子生物学中，结构是非常重要的内容。在分子生物学中，结构是非常重要的内容。只有在获得相应分子的结构后才能深入地只有在获得相应分子的结构后才能深入地研究其功能和生化过程。研究其功能和生化过程。举例举例酶蛋白：只有在了解了酶的活性中心的结酶蛋白：只有在了解了酶的活性中心的结构以及如何与底物的结合后，才能真正了构以及如何与底物的结合后，才能真正了解这种酶的作用机理；解这种酶的作用机理；对肌肉中的肌动蛋白和肌球蛋白的结构有对肌肉中的肌动蛋白和肌球蛋白的结构有了详细的了解，才能说明肌肉收缩和非肌了详细的了解，才能说明肌肉收缩和非肌肉细胞运动的机理。肉细胞运动的机理。一共有一共有11项诺贝尔奖授予生物分子结构项诺贝尔奖授予生物分子结构方面的研究。方面的研究。有结构解析方法研究，也有重要的生物有结构解析方法研究，也有重要的生物分子结构和功能研究的工作。分子结构和功能研究的工作。1962 1962 1964 1982 1985 A.1988 a 1997 D.E.C.(),2002 B.W 2003 2006 2009 A.E.内螺旋内螺旋外螺旋外螺旋选择筛选择筛钾离子通道的三维结构图2003年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖钾离子透过细胞膜的输运行为，对体内或是大脑中钾离子透过细胞膜的输运行为，对体内或是大脑中神经信号的传导至关重要。然而离子通道的选择性神经信号的传导至关重要。然而离子通道的选择性透过行为却困扰了生物学家许多年。透过行为却困扰了生物学家许多年。钾离子通道的离子导通机理钾离子通道的离子导通机理通过钾离子通道的三维通过钾离子通道的三维结构，解释了它对离子结构，解释了它对离子的选择性透过机理。的选择性透过机理。（1）“多离子透过多离子透过”的的过程：原先通道里有三过程：原先通道里有三个钾离子被束缚在里面，个钾离子被束缚在里面，只有体积合适的钾离子只有体积合适的钾离子才能通过撞击，将另一才能通过撞击，将另一个钾离子从相反方向弹个钾离子从相反方向弹出，而体积较小的纳离出，而体积较小的纳离子不行。子不行。（2）通道内氨基酸残基的结构，模拟了钾离子在溶液中的水）通道内氨基酸残基的结构，模拟了钾离子在溶液中的水合状态。只有水合的钾离子能够在通道内犹如在水溶液内一样合状态。只有水合的钾离子能够在通道内犹如在水溶液内一样自由地运动。自由地运动。钾离子通道钾离子通道,()3.2.280,69-77(1998)95,649-655(1998)289,123-127(2000)414,37-42(2001)414,43-48(2001)415,287-294(2002)111,967-965(2002)423,3341(2003)结构生物学进展：结构生物学进展：董宇辉董宇辉，同步辐射（同步辐射（）小角散射（小角散射（）自由电子激光（自由电子激光（）同步辐射同步辐射 :.X射线晶体学和是蛋白质射线晶体学和是蛋白质结构测定的主要技术结构测定的主要技术，2012年年10月月2日日99.2%99.2%测定方法测定方法蛋白质结构蛋白质结构X射线晶体学射线晶体学747689616综合方法综合方法45851165总数总数85058各种生各种生物基因物基因组和功组和功能基因能基因组数据组数据基因基因克隆克隆蛋白制备蛋白制备结构测定结构测定结构测定结构测定样品制备样品制备蛋白结构蛋白结构蛋白质结构测定的流程蛋白质结构测定的流程靶标克隆表达可溶纯化结构152721486664081474843802008.6.16 获得生物大分子结构的主要技术获得生物大分子结构的主要技术核磁共振方法：分辨率与灵敏度不够，不能确定分子量很大的核磁共振方法：分辨率与灵敏度不够，不能确定分子量很大的结构，要求样品浓度极高，测定效率低下（几个星期甚至几个结构，要求样品浓度极高，测定效率低下（几个星期甚至几个月的数据收集时间）。月的数据收集时间）。晶体学方法：对样品要求过高，高质量晶体的获得困难。晶体学方法：对样品要求过高，高质量晶体的获得困难。实验耗时实验耗时 单晶难以获得单晶难以获得 相位解析需要特殊单晶相位解析需要特殊单晶 分辨率低分辨率低 灵敏度低灵敏度低?蛋白质晶体蛋白质晶体衍射能力很弱：大部分原子为衍射能力很弱：大部分原子为C、N、O、S；晶体质量差，晶胞大；晶体质量差，晶胞大；相位问题解决困难。相位问题解决困难。理想的光源必须具有以下特点：理想的光源必须具有以下特点：高亮度：衍射能力很弱也可以得到好的数据；高亮度：衍射能力很弱也可以得到好的数据；准直性好：质量差、晶胞大的晶体也可以进准直性好：质量差、晶胞大的晶体也可以进 行实验；行实验；能量可调：多波长反常散射解决相位问题。能量可调：多波长反常散射解决相位问题。同步辐射正好提供了适合的光源。同步辐射正好提供了适合的光源。什么是同步辐射？什么是同步辐射？接接近近光光速速运运动动的的电电子子或或正正电电子子在在改改变变运运动动方方向向时时放放出出的的电电磁磁辐辐射射，因因为为是是在在同同步步加加速速器器上上发发现现的的，所所以以称称为为同同步辐射。步辐射。这这种种辐辐射射强强度度高高、覆覆盖盖的的频频谱谱范范围围广广，可可以以任任意意选选择择所所需需要要的的波波长长且且连连续续可可调调，因因此此成成为为一一种种科科学学研研究究的的新新光光源。源。同步辐射装置示意图同步辐射装置示意图储存环储存环部分图片来自部分图片来自三种发光元件三种发光元件弯转磁铁弯转磁铁扭摆器扭摆器(Wiggler)波荡器波荡器(undulator)图片来自图片来自发光元件发光元件光束线光束线实验站实验站同步辐射的亮度（单同步辐射的亮度（单位时间，单位面积，位时间，单位面积，单位立体角，一定光单位立体角，一定光子能量范围内的光子子能量范围内的光子数）和转靶数）和转靶X光机的比光机的比较。较。图片来自图片来自 设计报告设计报告2p立体角：立体角：1801毫弧度：毫弧度：0.06 三代光源甚至达到三代光源甚至达到10微弧度微弧度实际的蛋白质单晶实际的蛋白质单晶真实单晶体内部不真实单晶体内部不是完美的，可以看是完美的，可以看成有一系列的小晶成有一系列的小晶体镶嵌而成，每个体镶嵌而成，每个小晶体可以认为是小晶体可以认为是完美的晶体。这些完美的晶体。这些小晶体取向无序的小晶体取向无序的程度以程度以“镶嵌度镶嵌度”表表征。征。分子置换法（分子置换法（，），）同晶置换法（同晶置换法（，），）反常散射法（反常散射法（，），）直接法（直接法（）同步辐射覆同步辐射覆盖了一个很盖了一个很宽的频谱范宽的频谱范围，从远红围，从远红外到硬外到硬X光。光。而而X光机只光机只能提供几个能提供几个分立的光子分立的光子能量。能量。（多对同晶置换）（多对同晶置换）设法在蛋白质晶体设法在蛋白质晶体中加入一些重金属中加入一些重金属离子，同时晶体结离子，同时晶体结构不发生大的变化构不发生大的变化（同晶置换），置（同晶置换），置换前后结构因子的换前后结构因子的关系。关系。一个同晶置换可以得到两个可能的解。一个同晶置换可以得到两个可能的解。两个同晶置换就可以得到唯一的解。两个同晶置换就可以得到唯一的解。“同步辐射同步辐射+硒代硒代+样品冷冻样品冷冻”已经已经成为解析全新结构的标准方法。成为解析全新结构的标准方法。多波长反常衍射（）多波长反常衍射（）可以解析全新结构，如果能够得到足够的可以解析全新结构，如果能够得到足够的同晶置换晶体的话。同晶置换晶体的话。如果蛋白质里有金属离子存在，就可以使如果蛋白质里有金属离子存在，就可以使用方法。用方法。硒代。硒代。原子散射因子原子散射因子选择吸收边附近的几个波长，相当于几个选择吸收边附近的几个波长，相当于几个不同的完全同晶的置换。不同的完全同晶的置换。分子生物学提供了硒代的手段，对于解析分子生物学提供了硒代的手段，对于解析全新结构非常有利。全新结构非常有利。关键是衍射实验使用的关键是衍射实验使用的X射线（能量）波长射线（能量）波长必须可变！必须可变！同步辐射的作用同步辐射的作用同步辐射的加入，大大提高了结构测定的同步辐射的加入，大大提高了结构测定的速度。速度。()图片来自图片来自蛋白质结构的增加蛋白质结构的增加同步辐射促进了蛋白质结构的解析同步辐射促进了蛋白质结构的解析1980-1990年，获得解析的蛋白质数量大幅年，获得解析的蛋白质数量大幅度增加；度增加；1980左右，同步辐射开始应用到蛋白质结左右，同步辐射开始应用到蛋白质结构解析中，构解析中，1990年各种技术趋于成熟，同年各种技术趋于成熟，同步辐射大规模应用于生物大分子结构解析。步辐射大规模应用于生物大分子结构解析。生物学家的评论生物学家的评论生物大分子结构测定影响了生物学几乎所生物大分子结构测定影响了生物学几乎所有的领域。有的领域。几乎每个星期都有激动人心的结构发表在几乎每个星期都有激动人心的结构发表在如和这样的杂志上。如和这样的杂志上。生物大分子晶体学已经比其他任何学科更生物大分子晶体学已经比其他任何学科更多地得益于同步辐射的应用。多地得益于同步辐射的应用。E.，.实验的波长选择实验的波长选择f1f2f3f4四个可选择的波长四个可选择的波长f1：，：，f最大；最大；f2：，：，f最大；最大；f3：；f4：。流行做法：一边收集数据，一边解析结构。流行做法：一边收集数据，一边解析结构。一般完成一般完成f1数据的收集，进行数据的收集，进行f2数据收集时数据收集时就完成相位解析了。就完成相位解析了。几个波长？几个波长？理论上理论上2个波长就足够破解双解了，但是有个波长就足够破解双解了，但是有直接法的帮助，直接法的帮助，1个波长也就足够了。个波长也就足够了。当然波长越多会越好，但是实验时间的延当然波长越多会越好，但是实验时间的延长往往会带来不可预知的因素：辐射损伤，长往往会带来不可预知的因素：辐射损伤，仪器设备的不稳定等。仪器设备的不稳定等。反常衍射的分类反常衍射的分类单波长反常衍射：；单波长反常衍射：；多波长反常衍射：。多波长反常衍射：。波长得到的相角波长得到的相角 三个波长得到的相角三个波长得到的相角烯醇酶烯醇酶-磷酸酶磷酸酶 E1 人源人源“”蛋白蛋白与的组合与的组合 三个波长三个波长同步辐射蛋白质晶体学的发展同步辐射蛋白质晶体学的发展更小的晶体：生长晶体是蛋白质晶体学的更小的晶体：生长晶体是蛋白质晶体学的瓶颈，如果能够解析小晶体的结构将使得瓶颈，如果能够解析小晶体的结构将使得许多困难的结构成为可能。许多困难的结构成为可能。更自动化的实验流程：无论是解析结构还更自动化的实验流程：无论是解析结构还是在药物研究中的应用，大量的尝试需要是在药物研究中的应用，大量的尝试需要自动化的流程。自动化的流程。目前，目前，10微米左右的质量良微米左右的质量良好的晶体已经能够解析出生好的晶体已经能够解析出生物大分子结构。（，发表于物大分子结构。（，发表于J.,367,310-318.2007）：可能达到：可能达到5微米。微米。但是有相当多的生物大分但是有相当多的生物大分子只能够获得子只能够获得1微米左右微米左右的微晶，如左图所示的与的微晶，如左图所示的与老年性痴呆相关的蛋白质老年性痴呆相关的蛋白质很难形成大的单晶。很难形成大的单晶。目前同步辐射装置希望能提供目前同步辐射装置希望能提供1微米的聚焦光斑解析这微米的聚焦光斑解析这些些 m大小晶体的结构。将大大降低生物大分子结晶的大小晶体的结构。将大大降低生物大分子结晶的门槛，极大地推动结构生物学研究和药物研发的进展。门槛，极大地推动结构生物学研究和药物研发的进展。1 m量级蛋白质晶体的结构解析量级蛋白质晶体的结构解析同步辐射提供了解析蛋白质结构最适合的同步辐射提供了解析蛋白质结构最适合的光源。光源。同步辐射的广泛应用，分子生物学技术的同步辐射的广泛应用，分子生物学技术的发展以及蛋白质晶体学理论、软件的完善，发展以及蛋白质晶体学理论、软件的完善，使得解析蛋白质结构成为相对比较常规的使得解析蛋白质结构成为相对比较常规的技术。技术。小角散射小角散射 .获得生物大分子结构的困难获得生物大分子结构的困难核磁共振方法：分辨率与灵敏度不够，不能确定分子量很大的核磁共振方法：分辨率与灵敏度不够，不能确定分子量很大的结构，要求样品浓度极高，测定效率低下（几个星期甚至几个结构，要求样品浓度极高，测定效率低下（几个星期甚至几个月的数据收集时间）。月的数据收集时间）。晶体学方法：对样品要求过高，晶体不是想得到就能得到的。晶体学方法：对样品要求过高，晶体不是想得到就能得到的。实验耗时实验耗时 单晶难以获得单晶难以获得 相位解析需要特殊单晶相位解析需要特殊单晶 分辨率低分辨率低 灵敏度低灵敏度低 技术可以研究溶液状态的蛋白，但是技术可以研究溶液状态的蛋白，但是受到很多限制受到很多限制测定一系列二维、三维测定一系列二维、三维核磁共振谱，通过谱峰核磁共振谱，通过谱峰位置计算原子之间的键位置计算原子之间的键长、键角、二面角等立长、键角、二面角等立体化学参数，从而得到体化学参数，从而得到整个分子的三维结构。整个分子的三维结构。存在的限制：存在的限制：灵敏度不够：需要很浓的溶灵敏度不够：需要很浓的溶液液分辨率不高：存在分子量上分辨率不高：存在分子量上限（限（39）采集速度慢：样品稳定性问采集速度慢：样品稳定性问题题缺少弱相互作用和中间体捕缺少弱相互作用和中间体捕获技术获技术膜蛋白结构的测定方法不完膜蛋白结构的测定方法不完善善蛋白质晶体学的问题主要在于样品蛋白质晶体学的问题主要在于样品得到晶体得到晶体探测衍射点强度探测衍射点强度确定衍射相位确定衍射相位得到电子密度分布得到电子密度分布进而获得原子位置进而获得原子位置主要问题：主要问题：单晶难于制备，特别是复合物单晶难于制备，特别是复合物解析相位需要特殊晶体解析相位需要特殊晶体小角散射（）小角散射（）不需要晶体，在溶液中就可进行实验。不需要晶体，在溶液中就可进行实验。不受分子量限制。不受浓度限制。不受分子量限制。不受浓度限制。实验时间短，对样品稳定性要求低。实验时间短，对样品稳定性要求低。仪器设备简单，可以开展原位实验。仪器设备简单，可以开展原位实验。图片来自图片来自 8 .小角散射所需的样品小角散射所需的样品50微升溶液；微升溶液；蛋白浓度在蛋白浓度在0.1-10；分子量在几千至几亿；分子量在几千至几亿；单分散（）。单分散（）。图片来自图片来自 8 .小角散射的优点小角散射的优点对样品的要求很低：溶液样品既可，分子量、对样品的要求很低：溶液样品既可，分子量、浓度不拘，稳定性不用很高。浓度不拘，稳定性不用很高。有些时候结晶会引起一些结构上的变化（由有些时候结晶会引起一些结构上的变化（由于结晶时候的于结晶时候的 导致），小角散射实验在溶液导致），小角散射实验在溶液中进行，更好地反映生物大分子的真实状态。中进行，更好地反映生物大分子的真实状态。实验相对简单快速，提供了原位研究动态过实验相对简单快速，提供了原位研究动态过程的可能性。程的可能性。小角散射（小角散射（1D）衍射（衍射（3D）1条谱线条谱线上万个衍射点上万个衍射点结构信息（结构信息（3D）图片来自图片来自 8 .小角散射的缺点小角散射的缺点小角散射得到的信息量很少，要得到三维小角散射得到的信息量很少，要得到三维的结构信息是很困难的。只能得到一些比的结构信息是很困难的。只能得到一些比较粗略、低分辨的信息，如生物大分子的较粗略、低分辨的信息，如生物大分子的大小、形状等。大小、形状等。衍射可以获得非常多的衍射点强度，能够衍射可以获得非常多的衍射点强度，能够解析出三维的结构来。解析出三维的结构来。相对于晶体学衍射，小角散射的理论还不相对于晶体学衍射，小角散射的理论还不够成熟。够成熟。经典应用经典应用生物大分子（散射体）的大小、分布；生物大分子（散射体）的大小、分布；大致形状（球形、柱形、椭球形等）。大致形状（球形、柱形、椭球形等）。分子越大，实验越容易：和晶体学正好相分子越大，实验越容易：和晶体学正好相反。反。最近发展最近发展可以拟合出生物大分子的形状：可以拟合出生物大分子的形状：利用一系列球谐函数表征分子外形，这个利用一系列球谐函数表征分子外形，这个外形（包络）之外密度为零，之内是均匀外形（包络）之外密度为零，之内是均匀的密度。的密度。或者用一系列的虚拟原子（或者用一系列的虚拟原子（）或者虚拟残）或者虚拟残基来描述生物大分子，调整这些虚拟原子基来描述生物大分子，调整这些虚拟原子或者虚拟残基的位置来确定分子形状。或者虚拟残基的位置来确定分子形状。M.B.,V.V.D.I.J.(1997).30,811815用球谐函数展开来表示生用球谐函数展开来表示生物大分子形状。拟合展开物大分子形状。拟合展开系数，使得计算谱线与实系数，使得计算谱线与实验最接近。需要正则化方验最接近。需要正则化方法来进行拟合。法来进行拟合。程序：程序：D.I.，J.(1992).25,495503用虚拟原子来表示生物大分子形状。模用虚拟原子来表示生物大分子形状。模拟退火这些虚拟原子的位置，使得计算拟退火这些虚拟原子的位置，使得计算谱线与实验最接近。谱线与实验最接近。程序：程序：和和 D.I.，(1999).76,28792886重建晶体结构中丢失部分重建晶体结构中丢失部分晶体衍射中看不到的部分一般都是一些柔性的区域。利用小角散射可以拟合出这晶体衍射中看不到的部分一般都是一些柔性的区域。利用小角散射可以拟合出这些区域来。些区域来。程序：程序：,，(2002).83,31123125生物大分子复合物生物大分子复合物已知各亚基分子结构，已知各亚基分子结构，而复合物结构未知；改而复合物结构未知；改变亚基相对位置及取向变亚基相对位置及取向来拟合实验谱线。来拟合实验谱线。程序：程序：,，J.(2001).34,527532研究实例（一）研究实例（一）从基因到功能：脱氨酶从基因到功能：脱氨酶206：S.5();a2+;,.,206159.DNA.,.,.2O2+2+.A2+.AGTCCT,:;T,:.206:,;.E.,.2.8.,(2).1.65.:8:0.1M,1.5M(4)24,15%().20C,3.:10,1,552.:0.1M,1.6M(4)24,12%().20C,5.(3,45).71,99,102.a,.:();:().A.a.:;:.研究实例（二）：研究实例（二）：来源于光合细菌来源于光合细菌 的的 ()。结合后导致构型变化，以结合特定的。这个蛋结合后导致构型变化，以结合特定的。这个蛋白属于白属于 ()家族，与家族，与 ()()类似。类似。.,J.(2004)341,651668.图片来自图片来自 8 .图片来自图片来自 8 .图片来自图片来自 8 .在结合后的变化并不支持晶在结合后的变化并不支持晶体学研究的结果。体学研究的结果。：的结合对大小改变很小。增强的结合对大小改变很小。增强了蛋白之间的相互作用，表面了蛋白之间的相互作用，表面电荷分布改变了。电荷分布改变了。图片来自图片来自 8 .的结果的仔细分析否认的结果的仔细分析否认了的机制。了的机制。以及以及P(r)的变化远比机的变化远比机制导致的小。制导致的小。图片来自图片来自 8 .导致晶体学结构出问题的原因：导致晶体学结构出问题的原因：结晶时产生的结晶时产生的 通过晶体学得到的结构计算出来的曲线和实验明显不同，通过晶体学得到的结构计算出来的曲线和实验明显不同，说明在结晶过程中说明在结晶过程中 改变了蛋白的结构。改变了蛋白的结构。晶体学结构中两个晶体学结构中两个结合区域明显不对称结合区域明显不对称（而结合区域却是（而结合区域却是对称的），这种结构对称的），这种结构并不常见。并不常见。图片来自图片来自 8 .图片来自图片来自 8 .研究实例（三）：研究实例（三）：来源于来源于（巴西固氮螺菌）的（巴西固氮螺菌）的 (谷氨酸合成酶，谷氨酸合成酶，)。细菌的细菌的 ()包括两个亚基：包括两个亚基：a亚基，亚基，162；b亚基，亚基，52.3。a亚基结构已知：亚基结构已知：10。b亚基有个类似物：亚基有个类似物：50520 (1h7w)。（。（）.,.,.,S.,.,B.&.(2003).J.,278,299332L-glutamate NADP(+)L-glutamine 2-oxoglutarate NADPH+谷氨酸合成酶是一种含有中心的黄素蛋白，催化谷氨酸合成酶是一种含有中心的黄素蛋白，催化谷酰胺的酰胺基还原转移到谷酰胺的酰胺基还原转移到2-酮戊二酸（酮戊二酸（2）的）的2位上。根据不同的酶种类，这个过程需要或者，位上。根据不同的酶种类，这个过程需要或者，还需要或者，中心是必须的。细菌的需要，真核还需要或者，中心是必须的。细菌的需要，真核生物的需要。生物的需要。这个酶和谷酰胺合成酶（这个酶和谷酰胺合成酶（）是微生物和植物中氮）是微生物和植物中氮素同化（素同化（）的主要途径，在动物中的作用还不清）的主要途径，在动物中的作用还不清楚。楚。细菌包含的细菌包含的（）由（）由a、b两个部分组成，包含两个部分组成，包含1个，个，1个和个和3个不同的个不同的。的催化机理示意图的催化机理示意图活性的是活性的是a和和b亚基组成的。亚基组成的。小角散射结果表明小角散射结果表明a亚基在溶液中是亚基在溶液中是4聚体；聚体；b亚基是单体和二聚体混合。两个亚基组成亚基是单体和二聚体混合。两个亚基组成的在溶液中是的在溶液中是4聚体。聚体。实验结果：实验结果：1：a亚基；亚基；2：；：；3：b亚基。亚基。黑点：实验数据；黑点：实验数据；红线：红线：模型（外形）；模型（外形）；绿色点划线：绿色点划线：a2（曲线（曲线1）和）和a4b（曲线（曲线2）晶体学模型；）晶体学模型；绿色三角（曲线绿色三角（曲线3）：单体）：单体b；绿色圆（曲线绿色圆（曲线3）：二体）：二体b；蓝线：刚体拟合后的蓝线：刚体拟合后的a4（曲线（曲线1）和）和()4；蓝色圆（曲线蓝色圆（曲线3）：拟合后的）：拟合后的b单体与二体混合模型。单体与二体混合模型。a4a4b2b2a4a4重叠重叠在上在上外形外形a4a4b2b2a4a4()4()4最终确定的结构：最终确定的结构：4 4聚的聚的a a亚基外围包围亚基外围包围着着4 4个个b b亚基。亚基。小角散射提供了研究生物大分子溶液状态小角散射提供了研究生物大分子溶液状态的一种方便手段。的一种方便手段。实验数据能够提供的信息量不多，但是在实验数据能够提供的信息量不多，但是在有部分晶体结构的情况下，小角散射能够有部分晶体结构的情况下，小角散射能够发挥相当重要的作用。发挥相当重要的作用。小角散射研究生物大分子溶液结构仍是一小角散射研究生物大分子溶液结构仍是一种正在发展的技术，有很大的提升余地。种正在发展的技术，有很大的提升余地。自由电子激光自由电子激光 发展才是硬道理。发展才是硬道理。邓小平邓小平各种生各种生物基因物基因组和功组和功能基因能基因组数据组数据基因基因克隆克隆蛋白制备蛋白制备结构测定结构测定结构测定结构测定样品制备样品制备蛋白结构蛋白结构晶体，晶体，晶体！晶体，晶体，晶体！靶标靶标克隆克隆表达表达可溶可溶纯化纯化结构结构15272 1486664081474843802008.6.16 解决的方法：分子不排队，让光子排队解决的方法：分子不排队，让光子排队探测器探测器分子分子相干光源相干光源利用一束相干性很好、强度很高的利用一束相干性很好、强度很高的X光来照光来照射分子，记录下相干散射的强度，也能得到射分子，记录下相干散射的强度，也能得到分子中原子的结构。分子中原子的结构。晶体的衍射：虽然每一个光子到达晶体的时间晶体的衍射：虽然每一个光子到达晶体的时间（位相，）是无规的，但是晶体内原子空间排列（位相，）是无规的，但是晶体内原子空间排列的有序性限定了出射光子只能沿着有限的方向，的有序性限定了出射光子只能沿着有限的方向，因此出射的因此出射的X射线强度还是很高的，可以很容易射线强度还是很高的，可以很容易就探测得到。就探测得到。分子的散射：在原子空间排列无序的条件下，出分子的散射：在原子空间排列无序的条件下，出射光子的方向不受限制，因此出射的射光子的方向不受限制，因此出射的X射线强度射线强度变得非常微弱。入射变得非常微弱。入射X射线的光子如果没有确定射线的光子如果没有确定的位相关系（相干），那么即使目前最强的光源，的位相关系（相干），那么即使目前最强的光源，这些无序到达的光子产生的信号还是弱得无法探这些无序到达的光子产生的信号还是弱得无法探测。（强度相加，测。（强度相加，N个光子个光子N倍信号）倍信号）除非入射除非入射X射线的光子射线的光子“排着整齐的队伍排着整齐的队伍”，具，具有确定的位相关系（相干），散射的光子产生的有确定的位相关系（相干），散射的光子产生的信号就有确定的相位关系，能够进行振幅叠加，信号就有确定的相位关系，能够进行振幅叠加，N个光子产生个光子产生N2倍信号（类似共振）。倍信号（类似共振）。关键：光源关键：光源目前的光源（包括第三代同步辐射）还不目前的光源（包括第三代同步辐射）还不能提供足够的强度和相干性；能提供足够的强度和相干性；能够满足条件的光源是：能够满足条件的光源是：X射线自由电子激射线自由电子激光（）。光（）。理由：原子分辨率需要理由：原子分辨率需要X光；强度和相干性光；强度和相干性需要激光。需要激光。什么是自由电子激光？什么是自由电子激光？让产生同步辐射的电子同时发光（光子让产生同步辐射的电子同时发光（光子相位相同），这样就得到激光。这个过相位相同），这样就得到激光。这个过程和常规的激光（可见光、红外、紫外程和常规的激光（可见光、红外、紫外激光）是类似的。激光）是类似的。溶菌酶溶菌酶 30 可能的问题可能的问题分子损伤：极高的强度会使分子完全离解，分子损伤：极高的强度会使分子完全离解，但是可以在分子离解之前就得到足够的信但是可以在分子离解之前就得到足够的信号，计算机模拟证实了这一点。号，计算机模拟证实了这一点。相位问题：过采样技术（）可以解决这个相位问题：过采样技术（）可以解决这个问题。问题。探测技术：需要发展。探测技术：需要发展。实验技术：如何获得单分子的散射信号，实验技术：如何获得单分子的散射信号，需要研究。需要研究。作用下溶菌酶分子的离解作用下溶菌酶分子的离解2的脉冲可以得到可靠的结构，的脉冲可以得到可靠的结构，5以上会有误差，以上会有误差，10以上基本不可用。以上基本不可用。实验技术的问题实验技术的问题强度很高的，怎么固定样品？既然能够把强度很高的，怎么固定样品？既然能够把样品在瞬间挥发，也会在瞬间挥发固定样样品在瞬间挥发，也会在瞬间挥发固定样品的样品架！品的样品架！实验技术（实验技术（1）：）：实验技术（实验技术（2）：）：把蛋白质固定在非晶态的冰里面。把蛋白质固定在非晶态的冰里面。类似冷冻电镜技术。类似冷冻电镜技术。使用一束脉冲足够短的激光，使用一束脉冲足够短的激光，就可以得到可信的散射信号。就可以得到可信的散射信号。但是散射信号如何变成结构（电但是散射信号如何变成结构（电子密度）？相位还是探测不到。子密度）？相位还是探测不到。晶体衍射相位问题的根源：傅立叶晶体衍射相位问题的根源：傅立叶取样定律和衍射的中心对称性取样定律和衍射的中心对称性结构解析就是求出晶胞内电子密度分布：结构解析就是求出晶胞内电子密度分布：需要得出需要得出N个点的密度个点的密度r(,1,)，必须知道，必须知道N个振个振幅幅F(1,)和相位和相位 j(1,)。由于由于r必须为实数，必须为实数，F()()，j()()。因此只有。因此只有2个独个独立的衍射峰强度可以测量。立的衍射峰强度可以测量。晶体限制了可能获得衍射的位置：必须满晶体限制了可能获得衍射的位置：必须满足定律。足定律。有有N个未知数，但是只有个未知数，但是只有2个实验值（或者个实验值（或者方程）。采集多套数据就是增加了实验值方程）。采集多套数据就是增加了实验值（或者方程）的数目。（或者方程）的数目。如果样品不是晶体，那么可以在任何地方如果样品不是晶体，那么可以在任何地方探测到散射信号：。探测到散射信号：。傅立叶取样定律如是说：傅立叶取样定律如是说：实空间长度实空间长度L，分成，分成N份；倒易空间长度份；倒易空间长度P，也分成，也分成N份；份；倒易空间长度仍为倒易空间长度仍为P，分成，分成2N份；那么实空份；那么实空间长度为间长度为2L，也分成，也分成2N份。份。但是实空间只有但是实空间只有L的长度有密度，其余区域的长度有密度，其余区域密度可以设为密度可以设为0。晶体：只能在特定的位置上晶体：只能在特定的位置上得到衍射，数据量受到限制。得到衍射，数据量受到限制。非晶体：不受衍射条件的限非晶体：不受衍射条件的限制，可以得到任意量的数据。制，可以得到任意量的数据。由于数据采样取点间由于数据采样取点间隔变小，后的空间变隔变小，后的空间变大，但是分子的大小大，但是分子的大小是确定的，只有部分是确定的，只有部分空间有电子密度。空间有电子密度。(a)A (b)(a )(a).(c)(b).,400,342(1999).(d).+相位问题解决了，我们可以得相位问题解决了，我们可以得到一个电子密度。到一个电子密度。但是这个密度是一个二维的密度，和但是这个密度是一个二维的密度，和我们需要的三维结构怎么联系起来？我们需要的三维结构怎么联系起来？单颗粒重构单颗粒重构可以证明，这个二维的电子密度就是样品可以证明，这个二维的电子密度就是样品三维电子密度在入射的方向上的积分：非三维电子密度在入射的方向上的积分：非常类似。常类似。多个分子散射信号的平均：借鉴冷冻电镜多个分子散射信号的平均：借鉴冷冻电镜单颗粒重构技术。单颗粒重构技术。各个颗粒的取向必须通过衍射图精确获得。各个颗粒的取向必须通过衍射图精确获得。于是我们得到了三维电子密度。于是我们得到了三维电子密度。病毒的真实结构病毒的真实结构2，3模拟实验得到结构模拟实验得到结构提供的其他机遇（一）提供的其他机遇（一）时间分辨时间分辨极快的脉冲提供了研究生物大分子在发挥极快的脉冲提供了研究生物大分子在发挥功能时结构变化的研究手段；功能时结构变化的研究手段；不仅在静态，而且在动态的情况下得到结不仅在静态，而且在动态的情况下得到结构，使我们能够对生物大分子结构和功能构，使我们能够对生物大分子结构和功能的研究进入到一个全新的领域。的研究进入到一个全新的领域。机遇和困难机遇和困难得得到到某某个个蛋蛋白白的的结结构构以以后后，利利用用的的时时间间分分辨辨手手段段，可可以以探探测测到到极极短短时时间间内内结结构构的的变变化，揭示蛋白质参与反应的动力学过程。化，揭示蛋白质参与反应的动力学过程。仍然需要首先有结构；仍然需要首先有结构；快速响应的探测器；快速响应的探测器；激发态的理论描述非常不成熟。激发态的理论描述非常不成熟。上的纳米晶衍射实验：证明了在样品损坏之前可以获得衍射图像上的纳米晶衍射实验：证明了在样品损坏之前可以获得衍射图像以解析结构。以解析结构。但是，晶体还是需要的但是，晶体还是需要的如何在不需要晶体的情况下获得原子分辨如何在不需要晶体的情况下获得原子分辨级的结构，还有很长的路要走级的结构，还有很长的路要走目前的强度可以获得满意的纳米晶体衍射目前的强度可以获得满意的纳米晶体衍射图像，但是获得单个蛋白分子的衍射还需图像，但是获得单个蛋白分子的衍射还需要提高要提高1-2个数量级。个数量级。实验、数据分析、结构解析上的困难还未实验、数据分析、结构解析上的困难还未完全解决。完全解决。结构生物学技术的发展，有可能让我们不结构生物学技术的发展，有可能让我们不需要结晶就可以得到原子分辨率的蛋白质需要结晶就可以得到原子分辨率的蛋白质结构，甚至不需要很好的纯化。结构，甚至不需要很好的纯化。甚至可能观察到蛋白质结构的变化过程，甚至可能观察到蛋白质结构的变化过程，把蛋白质发挥功能的过程象电影一样记录把蛋白质发挥功能的过程象电影一样记录下来。下来。一些参考书籍和文献一些参考书籍和文献梁栋材著，梁栋材著，“X射线晶体学基础射线晶体学基础”（第二版）（第二版），科学出版社，科学出版社，2006年。年。舍伍德著，舍伍德著，“晶体、晶体、X射线和蛋白质射线和蛋白质”，科，科学出版社，学出版社，1985年。年。Thank you for attention!