细胞培养技术课件

病毒培养技术病毒培养技术 任务任务1 1 病毒的动物培养技术病毒的动物培养技术任务任务2 2 病毒的禽胚培养技术病毒的禽胚培养技术任务任务3 3 病毒的细胞培养技术病毒的细胞培养技术1病毒培养技术 任务1 病毒的动物培养技术1任务任务1 病毒的动物培养技术病毒的动物培养技术动物的选择动物的选择 应当选择应当选择SPF动物。选择动物的条件下：动物。选择动物的条件下：选用对病毒易感性高。选用对病毒易感性高。动物健康、体重、年龄尽可能一致，符合培养病动物健康、体重、年龄尽可能一致，符合培养病毒要求。毒要求。遗传特性相似，实验结果具有一致性、准确性和遗传特性相似，实验结果具有一致性、准确性和可比性。可比性。外购动物要了解当地动物群健康，饲养及免疫接外购动物要了解当地动物群健康，饲养及免疫接种情况，接前要经过健康观察，以免误用带有病原种情况，接前要经过健康观察，以免误用带有病原体动物。体动物。2 2任务1 病毒的动物培养技术动物的选择21.皮内接种皮内接种2.皮下接种皮下接种3.肌肉接种肌肉接种4.静脉接种静脉接种5.腹腔接种腹腔接种动物接种途径和方法动物接种途径和方法3 31.皮内接种动物接种途径和方法3 动物接种后的饲养管理与收获病毒动物接种后的饲养管理与收获病毒 1.1.接种病毒后的动物接种病毒后的动物,每天观察和检查规定每天观察和检查规定的各项指标，主要有精神、食欲、粪便、尿液、的各项指标，主要有精神、食欲、粪便、尿液、被毛状态、活动情况和接种部位的局部反应，被毛状态、活动情况和接种部位的局部反应，每天测体温每天测体温1 1次，做好记录。次，做好记录。2.2.出现反应症候动物，按规定方法剖杀，出现反应症候动物，按规定方法剖杀，采取含病毒高的组织脏器。采取含病毒高的组织脏器。4 4 动物接种后的饲养管理与收获病毒 1.接任务任务2 病毒的禽胚培养技术病毒的禽胚培养技术 能力目标：能够运用此项技术完成对能力目标：能够运用此项技术完成对特定病毒的培养。特定病毒的培养。工序过程：工序过程：如何完成此如何完成此项任务？项任务？选择禽胚选择禽胚前孵育前孵育接种接种后孵育后孵育收获病毒收获病毒禽胚的特禽胚的特点点5 5任务2 病毒的禽胚培养技术 能力目标各工序操作要点各工序操作要点工序工序1 1 禽胚的选择禽胚的选择 理想的禽胚是理想的禽胚是SPF鸡胚，常以非免疫鸡胚补充。鸡胚，常以非免疫鸡胚补充。工序工序2 禽胚的接种前禽胚的接种前孵育孵育 孵化前消毒，温度孵化前消毒，温度37.538.5，相对湿度，相对湿度50%60%，定时翻蛋，保证通风。孵化，定时翻蛋，保证通风。孵化45d照照蛋检查，淘汰无精蛋和死胚，孵化至所培养病毒需蛋检查，淘汰无精蛋和死胚，孵化至所培养病毒需要的日龄即可接种。要的日龄即可接种。6 6各工序操作要点工序1 禽胚的选择6工序工序3 禽胚的接种途径禽胚的接种途径各工序操作要点各工序操作要点痘病毒和疱疹病痘病毒和疱疹病毒，毒，1013日龄日龄 流感、新城疫、传流感、新城疫、传支等，支等，911日龄日龄 鹦鹉热衣原体和立克鹦鹉热衣原体和立克次氏体等，次氏体等，68日龄日龄正粘病毒和副粘病正粘病毒和副粘病毒，毒，1011日龄日龄7工序3 禽胚的接种途径各工序操作要点痘病毒和疱疹病毒，10工序工序4 禽胚的接种后禽胚的接种后孵育孵育 接种后，蜡泪封孔，置接种后，蜡泪封孔，置3737下孵化下孵化 ，每天照蛋每天照蛋2 2次以上，通过禽胚的病变初步确次以上，通过禽胚的病变初步确定病毒的存在及增殖情况，淘汰定病毒的存在及增殖情况，淘汰24h24h内死胚。内死胚。各工序操作要点各工序操作要点病毒感染指征：病毒感染指征：死亡死亡充血、出血或出现坏死灶充血、出血或出现坏死灶畸形畸形出现痘斑出现痘斑8 8工序4 禽胚的接种后孵育 接种后，蜡泪封工序工序5 5 病毒的收获病毒的收获 各工序操作要点各工序操作要点 绒毛尿囊膜接种绒毛尿囊膜接种 尿囊膜接种尿囊膜接种卵黄囊接种卵黄囊接种羊膜腔接种羊膜腔接种9工序5 病毒的收获 各工序操作要点 绒毛尿囊膜接种 尿照照 蛋蛋10照 蛋任务实例病毒的尿囊腔接种培养技术10尿囊腔接种法尿囊腔接种法11尿囊腔接种法兽用生物制品技术11接种部位消毒接种部位消毒12接种部位消毒任务实例病毒的尿囊腔接种培养技术12尿囊腔接种尿囊腔接种13尿囊腔接种任务实例病毒的尿囊腔接种培养技术13收获尿囊液收获尿囊液每枚鸡胚收获尿囊液每枚鸡胚收获尿囊液68ml14收获尿囊液每枚鸡胚收获尿囊液68ml任务实例病毒的尿囊影响禽胚培养病毒的因素影响禽胚培养病毒的因素 种蛋质量种蛋质量 1.病原微生物；病原微生物；2.母源抗体；母源抗体；3.抗生素抗生素 孵化技术孵化技术 1.温度温度 控制在控制在3739.5。有些病毒对温度比较敏感，。有些病毒对温度比较敏感，如鸡胚接种传染性支气管炎病毒后，不应超过如鸡胚接种传染性支气管炎病毒后，不应超过37；2.湿度湿度 鸡胚孵化湿度标准为鸡胚孵化湿度标准为53%57%，水禽胚孵化湿，水禽胚孵化湿度比鸡胚高度比鸡胚高5%10%；3.通风通风 禽胚发育是需氧量较大，加强通风换气；禽胚发育是需氧量较大，加强通风换气；4.翻蛋翻蛋 及时翻动促进发育等，但因地制宜。及时翻动促进发育等，但因地制宜。接种技术接种技术 通常鸡胚发育到通常鸡胚发育到1314日龄，鸭胚发育至日龄，鸭胚发育至1516日龄，日龄，尿囊液含量最高，平均尿囊液含量最高，平均68 ml，羊水，羊水12ml。1515影响禽胚培养病毒的因素15任务任务3 3 病毒的细胞培养技术病毒的细胞培养技术子任务子任务1 细胞培养细胞培养技术技术u培养常用的细胞培养常用的细胞 上皮细胞、成纤维细胞上皮细胞、成纤维细胞u细胞培养的方式细胞培养的方式 原代培养：原代培养：从直接取自生物体细胞、组织或器官从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。开始的培养。次代培养：次代培养：将原代细胞培养物轻微消化后，再洗将原代细胞培养物轻微消化后，再洗下分装至含新鲜培养液的培养管中继续培养。下分装至含新鲜培养液的培养管中继续培养。传代培养：传代培养：将培养细胞以一个培养瓶转移或移植将培养细胞以一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶中进行培养。到另一个培养瓶中进行培养。1616任务3 病毒的细胞培养技术子任务1 细胞培养技术16细胞培养技术（细胞培养技术（cell culture)cell culture)细胞培养技术是选用各种细胞的最佳生细胞培养技术是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。存条件对活细胞进行培养和研究的技术。即：利用机械、酶或化学方法使活体动即：利用机械、酶或化学方法使活体动物组织或传代细胞分散成单个乃至物组织或传代细胞分散成单个乃至24个细个细胞团悬液的培养，胞团悬液的培养，使之能继续生存、生长、使之能继续生存、生长、增殖的一种方法。增殖的一种方法。广义上广义上:还包括组织培养、器官培养。还包括组织培养、器官培养。17细胞培养技术（cell culture)培养常用的细胞培养常用的细胞 上皮细胞、成纤维细胞上皮细胞、成纤维细胞 根据培养细胞的染色体和繁殖特性，可分为：根据培养细胞的染色体和繁殖特性，可分为：原代细胞原代细胞 直接利用新鲜动物组织经胰蛋白酶消化、分直接利用新鲜动物组织经胰蛋白酶消化、分散，获得单个细胞，如鸡胚成纤维细胞，此细胞对病毒的检测散，获得单个细胞，如鸡胚成纤维细胞，此细胞对病毒的检测最为敏感，但制备和应用不方便。最为敏感，但制备和应用不方便。二倍体细胞（细胞株）二倍体细胞（细胞株）由原代细胞或次代细胞选育出由原代细胞或次代细胞选育出具有特殊生物学性质和标记的细胞，如猪肾细胞株（具有特殊生物学性质和标记的细胞，如猪肾细胞株（PK-15）和乳仓鼠肾细胞株（和乳仓鼠肾细胞株（BHK-21）等。适用于病毒性生物制品的制）等。适用于病毒性生物制品的制备，常用于疫苗生产，安全可靠。备，常用于疫苗生产，安全可靠。传代细胞（非二倍体细胞系、异倍体细胞）传代细胞（非二倍体细胞系、异倍体细胞）指不再指不再保持原来细胞的二倍体细胞数，在体外可以无限传代的细胞，保持原来细胞的二倍体细胞数，在体外可以无限传代的细胞，如人子宫癌细胞（如人子宫癌细胞（HeLa细胞）和鼠肾腺癌细胞（细胞）和鼠肾腺癌细胞（RAG细胞）细胞）等。有致癌性，不能用于疫苗生产，多用于病毒的分离鉴定。等。有致癌性，不能用于疫苗生产，多用于病毒的分离鉴定。1818培养常用的细胞 上皮细胞、成纤维细胞18 1.培养液培养液：生长液、维持液，：生长液、维持液，Eagle氏液、氏液、RPMI-1640、199、DMEM、MEM等营养液等营养液。2.细胞接种量细胞接种量:适宜。适宜。3.pH：一般为：一般为7.07.4因细胞种类不同而略有差异。因细胞种类不同而略有差异。4.温度温度：一般为：一般为3738。5.气体气体：氧气和二氧化碳。：氧气和二氧化碳。6.无菌条件无菌条件：培养的全过程都要求严格的无菌条件：培养的全过程都要求严格的无菌条件。u细胞培养的基本条件细胞培养的基本条件1919 1.培养液：生长液、维持液，Eagle氏液、RPM 各种组织是靠细胞间质黏合而成的，要获得各种组织是靠细胞间质黏合而成的，要获得分散的细胞，必须破坏细胞间质。分散细胞的方法分散的细胞，必须破坏细胞间质。分散细胞的方法的三种：的三种：机械分散法机械分散法：适用于细胞间连接较松的组织，：适用于细胞间连接较松的组织，如禽胚组织。如禽胚组织。酶消化法酶消化法：此法适用于原代细胞的制备及细：此法适用于原代细胞的制备及细胞的传代培养。胞的传代培养。螯合剂分散法螯合剂分散法：一般只用于单层细胞的分散。：一般只用于单层细胞的分散。2020 各种组织是靠细胞间质黏合而成的，要获 1.单层细胞培养法单层细胞培养法 用胰酶将剪碎的组织或传代细胞分散成用胰酶将剪碎的组织或传代细胞分散成26个成个成团的细胞，接种到培养瓶或培养板上，让细胞贴壁团的细胞，接种到培养瓶或培养板上，让细胞贴壁生长，静置培养或转瓶生长培养。生长，静置培养或转瓶生长培养。2.悬浮细胞培养法悬浮细胞培养法（搅拌培养）（搅拌培养）通过振荡或转动装置使细胞始终分散悬浮于培养通过振荡或转动装置使细胞始终分散悬浮于培养液内的培养方法。液内的培养方法。3.微载体培养微载体培养 通过搅拌悬浮在培养液内，使微小细胞在载体表通过搅拌悬浮在培养液内，使微小细胞在载体表面繁殖成单层的一种细胞培养技术，兼有单层和悬面繁殖成单层的一种细胞培养技术，兼有单层和悬浮细胞培养的优点。浮细胞培养的优点。u细胞培养方法细胞培养方法2121 1.单层细胞培养法 细胞培养方法21犊牛肝脏单层细胞犊牛肝脏单层细胞22犊牛肝脏单层细胞22鸡胚成纤维细胞培养鸡胚成纤维细胞培养鸡胚的处理鸡胚的处理9-119-11日龄的鸡胚日龄的鸡胚23鸡胚成纤维细胞培养鸡胚的处理9-11日龄的鸡胚23鸡胚成纤维细胞培养鸡胚成纤维细胞培养鸡胚的处理鸡胚的处理9 9日龄鸡胚日龄鸡胚1111日龄鸡胚日龄鸡胚24鸡胚成纤维细胞培养鸡胚的处理9日龄鸡胚11日龄鸡胚24鸡胚成纤维细胞培养鸡胚成纤维细胞培养鸡胚的处理鸡胚的处理25鸡胚成纤维细胞培养鸡胚的处理25鸡胚成纤维细胞培养鸡胚成纤维细胞培养鸡胚的处理鸡胚的处理26鸡胚成纤维细胞培养鸡胚的处理26子任务子任务2 2 病毒培养技术病毒培养技术细胞的选择细胞的选择选择相应易感动物的组织细胞。选择相应易感动物的组织细胞。细胞培养病毒条件细胞培养病毒条件血清血清：促进细胞生长和贴壁的成分。：促进细胞生长和贴壁的成分。温度温度：多数为：多数为37。pH 值值：pH在在7.67.8 接毒量与接毒方法接毒量与接毒方法：一般按维持液的：一般按维持液的110%接入接入。2727子任务2 病毒培养技术细胞的选择27病毒增值指标与收获病毒增值指标与收获 多数病毒在敏感细胞增殖可引起细胞代谢等方多数病毒在敏感细胞增殖可引起细胞代谢等方面的变化，发生形态改变，即细胞病变（面的变化，发生形态改变，即细胞病变（CPE）。）。通常用通常用CPE作为判定病毒毒力的指标，即计算病毒作为判定病毒毒力的指标，即计算病毒的的TCID50。CPE显微镜下主要表现为：显微镜下主要表现为：细胞圆缩细胞圆缩 细胞融合形成合胞体细胞融合形成合胞体 轻微病变轻微病变 有些病毒在细胞上增殖并不产生有些病毒在细胞上增殖并不产生CPE，可检查，可检查包涵体和血凝性作为病毒增殖的指标。包涵体和血凝性作为病毒增殖的指标。2828病毒增值指标与收获 多数病毒在敏感细胞增检测病毒检测病毒正常细胞正常细胞病变细胞病变细胞29检测病毒正常细胞病变细胞29复习思考题复习思考题1.解释概念：解释概念：原代细胞原代细胞 二倍体细胞二倍体细胞 传代细胞传代细胞 单层细胞培养单层细胞培养 悬浮培养悬浮培养 微载体培养微载体培养2.用动物培养病毒时，如何选择动物？用动物培养病毒时，如何选择动物？3.用禽胚培养病毒的接种方法有哪些？如何收获用禽胚培养病毒的接种方法有哪些？如何收获病毒？病毒？4.细胞培养法有哪些种类？有何特点？细胞培养法有哪些种类？有何特点？5.细胞培养病毒需要哪些条件？细胞培养病毒需要哪些条件？3030复习思考题1.解释概念：30细胞培养的必备设施细胞培养的必备设施无菌实验室无菌实验室超净工作台超净工作台恒温培养箱恒温培养箱其他设备（电热干燥箱、冰箱、水纯其他设备（电热干燥箱、冰箱、水纯化装置、普通光学显微镜、倒置显微化装置、普通光学显微镜、倒置显微镜、细胞液氮储存器、离心机、恒温镜、细胞液氮储存器、离心机、恒温水域锅、消毒器、抽滤装置等）水域锅、消毒器、抽滤装置等）3131细胞培养的必备设施无菌实验室31 血清的主要成分血清的主要成分 血清是由血浆去除纤维蛋白而形成，血清中含有各种血血清是由血浆去除纤维蛋白而形成，血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长活性是达到生理平衡的。机物等，这些物质对促进细胞生长活性是达到生理平衡的。血清的主要作用血清的主要作用 提供基本营养物质提供基本营养物质 提供贴壁和扩展因子（提供贴壁和扩展因子（FNFN、LNLN）提供激素及各种生长因子（提供激素及各种生长因子（FGFFGF、EGFEGF、PDGF)PDGF)提供结合蛋白提供结合蛋白 对培养中的细胞提供某些保护作用对培养中的细胞提供某些保护作用血清血清3232 血清的主要成分血清32 血清的使用与储存血清的使用与储存 使用前的处理使用前的处理 56灭活灭活30min 去除补体成分去除补体成分 储存条件储存条件 灭活后分装成小包装（灭活后分装成小包装（10mL、20mL、50mL），），20 储存；使用前储存；使用前4 融化。融化。使用浓度使用浓度 一般为一般为520，最常用的是，最常用的是10。血清血清3333 血清的使用与储存血清33气体环境和气体环境和pHpHu氧（氧（O2）参加细胞的三羧酸循环，产生能量以供给细参加细胞的三羧酸循环，产生能量以供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。胞生长、增殖和合成各种所需成分。采用开放式培养时（碟皿或培养瓶松盖培养采用开放式培养时（碟皿或培养瓶松盖培养或培养板培养），一般要把细胞置于或培养板培养），一般要把细胞置于95空气加空气加5二氧化碳的混合气体环境中。二氧化碳的混合气体环境中。u二氧化碳（二氧化碳（CO2）CO2既是细胞的代谢产物，又是细胞生长所既是细胞的代谢产物，又是细胞生长所必需的成分，并与维持培养液的必需的成分，并与维持培养液的pH有关。有关。3434气体环境和pH氧（O2）34upH值值 大多数细胞适于在大多数细胞适于在pH 7.27.4条件下生长，条件下生长，低于低于pH 6.8或高于或高于pH 7.6对细胞有害，甚至造成对细胞有害，甚至造成细胞退化或死亡。细胞退化或死亡。细胞对碱性不如对酸性的变化耐受，偏酸细胞对碱性不如对酸性的变化耐受，偏酸的条件比偏碱的环境对细胞生长有利。的条件比偏碱的环境对细胞生长有利。随细胞随细胞数量的增多、代谢加强，释放数量的增多、代谢加强，释放CO2增多，使增多，使pH 降低。为了维持培养基恒定的降低。为了维持培养基恒定的pH，多在培养基，多在培养基中加入磷酸盐等缓冲剂。中加入磷酸盐等缓冲剂。3535pH值35THE END