第五章-目的基因的获取-课件

目的基因：目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因。准备要分离、改造、扩增或表达的基因。第一节第一节 基因组基因组DNA片段化片段化一、限制性内切酶法一、限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组用限制性内切酶把基因组DNA切成不同切成不同大小的片段。大小的片段。酶切酶切由于带有粘性末端，产物可以直接与载由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。体连接。1.优点优点2.缺点缺点目的基因目的基因内部内部也可能有该内切酶的切点。也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！目的基因也被切成碎片！BamH IBamH IBamH Igene二、随机片段化二、随机片段化1.限制性内切酶局部消化法限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间，使基控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。切开。内切酶识别位点的碱基数内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物的长度和随机程度。影响所切出的产物的长度和随机程度。（1）限制性内切酶的选用原则）限制性内切酶的选用原则1）4bp的内切酶的内切酶平均每平均每46（4096）bp一个切点。一个切点。2）6bp的内切酶的内切酶平均每平均每44（256）bp一个切点。一个切点。随机程度高。如随机程度高。如Hae、AluI、Sau3A。内切酶粘性末端内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连。能与常用克隆位点相连。（Sau3ABamH I）5-G5-GGATCGATCC-3 C-3 3-3-CCTAGCCTAGG-5G-5 BamH IBamH I5-5-GATCGATC-3-3 3-3-CTAGCTAG-5-5 Sau 3A(同尾酶同尾酶)2.机械切割法机械切割法（1）超声波）超声波超声波强烈作用于超声波强烈作用于DNA，可使其断，可使其断裂成约裂成约300bp的随机片段。的随机片段。（2）高速搅拌）高速搅拌1500转转/分下搅拌分下搅拌30min，可产生约，可产生约8kb的随机片段。的随机片段。1976年年H.G.Khorana提出了用化学方法提出了用化学方法合成基因的设想，并于合成基因的设想，并于1979年在年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸酸tRNA基因的论文。基因的论文。第二节第二节 化学合成目的基因化学合成目的基因一、目前常用的方法一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸二酯法、磷酸三酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法亚磷酸三酯法、固相合成法固相合成法自动化合成法。自动化合成法。保护保护dNTP的的3端端P和和5端端OH（1）原理）原理1.磷酸二酯法磷酸二酯法加入的脱氧单核苷酸加入的脱氧单核苷酸起始脱氧单核苷酸起始脱氧单核苷酸 带保护的单核苷酸连接带保护的单核苷酸连接带带5保护的单保护的单核苷酸与带核苷酸与带3保护的另一个保护的另一个单核苷酸以单核苷酸以磷磷酸二酯键酸二酯键连接连接起来起来 用酸或碱的脱保护用酸或碱的脱保护80%乙酸乙酸（2）合成过程）合成过程下一个下一个5端保护的单核苷酸又可以同端保护的单核苷酸又可以同3端保护的二核苷酸聚合。端保护的二核苷酸聚合。原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在单核苷酸都是在3端磷酸和端磷酸和5-OH上都先上都先连接了一个保护基团。连接了一个保护基团。2.磷酸三酯法磷酸三酯法 将第一个核苷酸的将第一个核苷酸的3-OH端固定在端固定在固相支持物固相支持物上。上。固相磷酸三酯合成法固相磷酸三酯合成法是目前通用的合成方法。是目前通用的合成方法。合成的二核苷酸连接处有三个酯键！合成的二核苷酸连接处有三个酯键！固相磷酸三酯合成固相磷酸三酯合成过程过程固相支持物固相支持物结果是全保护的结果是全保护的DNA：5 DMT(4，4-二对甲氧基三苯甲二对甲氧基三苯甲基基),3固相支持物固相支持物,核苷酸之间对氯苯。最后脱保护核苷酸之间对氯苯。最后脱保护固相固相 支持物支持物固相固相 支持物支持物C目前化学合成寡核苷酸大多数是在合成仪上自动进行的，DNA自动合成已采用的是固相磷酸二酯法和亚磷酸三酯法，由于亚磷酸三酯法具有反应速度快，合成效率高和副反应极少等优点，已经在自动合成仪被广泛采用。3 3、亚磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、亚磷酸三酯法(1)脱二苯甲基保护基 加入ZnBr2或二氯乙酸，脱去4，4二对甲氧基三苯甲基，释放出与载体相连的寡聚核苷酸单体1上的5OH。(2)活化新的碱基 核苷酸单体2 的3端的二异丙基亚磷酸酰上的磷酸的OH用-氰乙基或甲基保护，准备和前一个碱基进行反应。(3)缩合反应 在弱强四唑的存在下，新加入带保护基的核苷酸单体2与单体1发生缩合反应，形成3，5磷酸二酯键，其中，磷为3价，即形成了亚磷酸三酯中间产物。(4)盖帽反应 加入乙酸酐，使极少数尚未参加缩合反应的核苷酸单体1 中的5OH乙酰化，从而达到封闭的作用，终止其以后参加缩台反应的可能性，以减少发生合成错误的机会。(5)氧化反应 形成的3一5磷酸二酯键由于磷为3价，即亚磷酸酯，不稳定，能被酸或碱解离。加入I2将其氧化，使之转化为磷酸三酯，其中磷为5价。三价三价五价五价如此经过多次循环，直到合成所需长度如此经过多次循环，直到合成所需长度为止，再用浓为止，再用浓NH4OH将将DNA从固相上洗从固相上洗脱下来，最后除去脱下来，最后除去NH4OH，在真空中，在真空中抽干，样品即可溶于适量的水中进行纯抽干，样品即可溶于适量的水中进行纯化分析。化分析。要注意的问题要注意的问题:合成方向合成方向3 5核苷酸单体的磷酸基团在核苷酸单体的磷酸基团在3端端亚磷酸亚磷酸三酯法的磷为三酯法的磷为3价磷，需要氧化。价磷，需要氧化。化学合成的化学合成的DNA片段一般在片段一般在200bp以内。以内。二、二、化学合成化学合成DNA片段的组装片段的组装用用T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶使各个片段的使各个片段的5端带端带上磷酸。上磷酸。1.互补连接法互补连接法预先设计合成的片段之间都有预先设计合成的片段之间都有互补互补区域区域，不同片段之间的互补区域能，不同片段之间的互补区域能形成有形成有断点断点的完整双链。的完整双链。（2 2）5端磷酸化端磷酸化（1 1）互补配对）互补配对（合成的（合成的DNADNA单链的单链的55端是端是-OH-OH）T4 DNA连接酶连接酶T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶使使5-OH磷酸化磷酸化完整的完整的DNA双链双链（3 3）连接酶连成完整双链连接酶连成完整双链2.互补延伸连接法互补延伸连接法预先设计的片段之间有预先设计的片段之间有局部互补区局部互补区，可以，可以相互作为另一个片段延长的引物，用相互作为另一个片段延长的引物，用DNA聚合酶聚合酶延伸成完整的双链。延伸成完整的双链。3 5 5 3 5 3 T4DNA连接酶连接酶Klenow片段片段引物引物1.直接合成基因直接合成基因三、三、寡聚核苷酸化学合成的优点寡聚核苷酸化学合成的优点2.合成引物（合成引物（20mer左右）左右）（1 1）mRNA的含量很低，很难作的含量很低，很难作cDNA 3.合成探针序列合成探针序列4.定点突变合成定点突变合成合成带有合成带有定点突变定点突变的基因片段。的基因片段。（2）有些基因比较短，化学合成费用较低）有些基因比较短，化学合成费用较低DNA合成仪合成仪5.合成人工接头或衔接物合成人工接头或衔接物含有各种酶切位点含有各种酶切位点人工接头人工接头（Adaptor）或）或衔衔接物接物（Linker）序列。）序列。EcoRIEcoRI LinkerAdaptor衔接物衔接物用化学合成法合成的一段用化学合成法合成的一段10-12bp的特定的特定限制性内切酶识别位点序列的限制性内切酶识别位点序列的平端双链平端双链。人工接头人工接头用化学合成法合成的一段用化学合成法合成的一段不等长不等长双链双链DNA序列，一头平末端、另一头粘性末端，序列，一头平末端、另一头粘性末端，粘性粘性末端末端某种酶切所产生的粘性末端）。某种酶切所产生的粘性末端）。AATTCG GAATTC CTTAAG 将某种生物细胞的将某种生物细胞的整个基因组整个基因组DNA切割切割成大小合适的片段，并将成大小合适的片段，并将所有这些片段所有这些片段都与适当的载体连接，引入相应的宿主都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中细胞中保存和扩增保存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的物体的全部基因全部基因，称为基因文库。，称为基因文库。一、基因文库的构建一、基因文库的构建1.基因文库（基因文库（gene library）第三节第三节 目的基因的保存和扩增目的基因的保存和扩增（2 2）目前常用的载体目前常用的载体 2.构建基因文库的载体选用构建基因文库的载体选用载体能够容载的载体能够容载的DNA片段大小直接影响到构片段大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的建完整的基因文库所需要的重组子重组子的数目。的数目。载体容量越大，所要求的载体容量越大，所要求的DNA片段数目片段数目越少，所需的越少，所需的重组子重组子越少。越少。（1 1）对载体的要求）对载体的要求 载体系列：载体系列：容量为容量为 24 kp cosmid载体：载体：容量为容量为 50 kb YAC：容量为容量为 1 Mb BAC:容量为容量为 300 kb断点完全随机，片段长度合适于载体连接。断点完全随机，片段长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。不能用一般的限制性内切酶消化法。（1）染色体）染色体DNA大片段的制备大片段的制备3.基因文库构建的一般步骤基因文库构建的一般步骤超声波（超声波（300bp）或机械搅拌（）或机械搅拌（8kb）。）。物理切割法：物理切割法：内切酶内切酶Sau3A进行局部消化。可得到进行局部消化。可得到10-30kb的随机片段。的随机片段。酶切法：酶切法：（2）载体与基因组）载体与基因组DNA大片段的连接大片段的连接 粘性末端直接连接粘性末端直接连接载体与外源载体与外源DNA大片段的两个末端大片段的两个末端都有相同的粘性末端。都有相同的粘性末端。如：如：Sau3A与与BamHI的酶切末端。的酶切末端。直接连接、人工接头或同聚物加尾。直接连接、人工接头或同聚物加尾。人工接头法（人工接头法（adapter）人工合成的限制性内切酶粘性末端片段。人工合成的限制性内切酶粘性末端片段。各种酶的接头可以向公司定做或购买。各种酶的接头可以向公司定做或购买。接上人工接头接上人工接头粘性末端粘性末端CCCCCC末端转移酶末端转移酶粘性末端粘性末端 同聚物加尾同聚物加尾4.基因组文库的大小基因组文库的大小一个文库要包含一个文库要包含99%的基因组的基因组DNA时所时所需要的克隆数目。需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文库包含了整个基因组文库包含了整个基因组DNA的概率（的概率（99%）f:插入载体的插入载体的DNA片段的平均长度占整个基因片段的平均长度占整个基因 组组DNA的的百分数百分数N：所需的重组载体数（克隆数）：所需的重组载体数（克隆数）ln以以e为底为底 的对数的对数例如：人的基因组是例如：人的基因组是 3109 bp，插入，插入DNA片段的平均片段的平均长度如果是度如果是1.7104 bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61GfN=4.61GfG：Genome大小；大小；f：fragment大小大小N=4.61Gf=4.6131091.7104=8.11051.cDNA以以mRNA为模板为模板逆转录逆转录出的出的DNA称称cDNA。2.cDNA library二、二、cDNA文库的构建文库的构建mRNAcDNA3 3 5 5 反转录酶反转录酶引物引物利用某种生物的利用某种生物的总总mRNA合成合成cDNA，再将，再将这些这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称行保存和扩增，称cDNA文库。文库。（1）不含内含子序列不含内含子序列。（2）可以在细菌中直接表达。）可以在细菌中直接表达。（3）包含了所有）包含了所有编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因。（4）比）比DNA文库小文库小的多，容易构建。的多，容易构建。4.构建构建cDNA文库的一般步骤文库的一般步骤（1）总）总RNA（total RNA）提取）提取3.cDNA文库的特点文库的特点提取总提取总RNA有商业化的试剂盒（有商业化的试剂盒（kit）。）。分离分离mRNA用商业化的用商业化的Oligo dT纤维柱。纤维柱。利用利用mRNA都含有一段都含有一段polyA尾巴，尾巴，将将mRNA从总从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。等）中分离纯化。mRNA只占总只占总RNA的的1%-2%。（2）mRNA的分离纯化的分离纯化 原理原理 mRNA的分离纯化的分离纯化Column（柱）（柱）反转录酶反转录酶（3）cDNA的合成的合成 cDNA第一链合成第一链合成逆转录酶能以逆转录酶能以RNA为模板合成为模板合成DNA。用用Oligo dT（或随机引物）作引物，合（或随机引物）作引物，合成成cDNA的第一链。的第一链。mRNAcDNA3 5 5 AAAAAAATTTTTTTOligo dT引物引物用用碱碱处理或用处理或用RNaseH降解降解mRNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的mRNA。mRNAcDNA3 3 5 5 反转录酶反转录酶引物引物mRNAcDNA第一链第一链3 3 5 5 引物引物cDNA第一链第一链3 5 引物引物 降解降解mRNA模板模板或或RNaseH碱碱剩下的剩下的cDNA单链的单链的3末端一般形成一个末端一般形成一个弯弯回来的双链发卡结构回来的双链发卡结构（机理不明），可成（机理不明），可成为合成第二条为合成第二条cDNA链的引物。用链的引物。用DNA聚聚合酶合成第二链合酶合成第二链DNA.。cDNA第一链第一链5 cDNA第二链合成第二链合成DNA聚合酶聚合酶cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链5 3 cDNA第二链合成第二链合成去掉发卡结构去掉发卡结构核酸酶核酸酶S1用用核酸酶核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会可以切掉发卡结构（但这会导致导致cDNA中有用的序列被切掉！）。中有用的序列被切掉！）。cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链5 3 cDNA第一链第一链cDNA第二链第二链5 3 5 3 这种酶能识别这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小，并将其降解成许多小片段片段。妙用妙用RNaseH小片段正好成为小片段正好成为DNA聚合酶的引物，聚合酶的引物，用来合成用来合成冈崎片段冈崎片段。DNA Pol I除去引物并修补后再使用除去引物并修补后再使用DNA连接酶连接酶连成一整条连成一整条DNA链。链。mRNAcDNA3 5 反转录酶反转录酶引物引物mRNAcDNA第一链第一链3 5 引物引物mRNAcDNA第一链第一链3 5 mRNAmRNADNA 聚合酶聚合酶DNA 聚合酶聚合酶cDNA第二链第二链cDNA第一链第一链3 5 RNaseHDNA ligase去引物去引物在双链在双链cDNA末端接上末端接上人工接头人工接头，即可与载，即可与载体连接，转入受体菌。体连接，转入受体菌。或借助或借助末端转移酶末端转移酶给载体和双链给载体和双链cDNA的的3端分别加上几个端分别加上几个C或或G，成为粘性末端。，成为粘性末端。5.5.cDNA与载体连接：与载体连接：接上人工接头接上人工接头粘性末端粘性末端CCCCCC末端转移酶末端转移酶6.cDNA文库的大小文库的大小一个一个cDNA文库要包含文库要包含99%的的mRNA时时所需要的克隆数目。所需要的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文库包含了完整文库包含了完整mRNA的概率（的概率（99%）:某一种低丰度（不足某一种低丰度（不足14份拷贝）份拷贝）mRNA占细胞整个占细胞整个mRNA的比例的比例N：所需的重组载体数（克隆数）：所需的重组载体数（克隆数）1n1n三、文库的查询（三、文库的查询（screening）用目的基因探针与文库中的重组用目的基因探针与文库中的重组载体进行载体进行Southern blot杂交。杂交。文库文库载体载体探针探针电泳后杂交电泳后杂交放射自显影放射自显影测序分析测序分析第四节第四节 目的基因的分离和扩增目的基因的分离和扩增一、从一、从mRNA分离目的基因分离目的基因1.探针柱分离特异探针柱分离特异mRNA根据已知的基因序列合成探针，结合根据已知的基因序列合成探针，结合到到纤维素柱纤维素柱上，用来分离纯化该基因上，用来分离纯化该基因的的mRNA。富集富集特定基因的特定基因的mRNA或或cDNA模板。模板。纤纤 维维 柱柱探针探针DNA探针探针DNA探针探针DNA探针探针DNATotal mRNA纤纤 维维 柱柱探针探针DNA探针探针DNA探针探针DNA探针探针DNA过柱过柱与探针碱基互补的与探针碱基互补的mRNA结合结合到柱上，其它到柱上，其它mRNA流走。流走。特异特异mRNA洗脱洗脱RT-PCR2.mRNA消解杂交消解杂交原理：原理：羟基磷灰石柱羟基磷灰石柱结合结合DNA-RNA或或DNA-DNA双链，双链，不结合单链不结合单链DNA。（Hydroxylapatite column）从表达从表达A蛋白蛋白和不表达和不表达A蛋白的组织细胞中蛋白的组织细胞中分别提取和分离分别提取和分离总总mRNA。将表达将表达A蛋白的蛋白的mRNA合成合成cDNA第一链。第一链。再同不表达再同不表达A蛋白的总蛋白的总mRNA杂交成杂交成cDNA-mRNA双链。双链。不能杂交的不能杂交的cDNA就包括特异表达的就包括特异表达的A基因基因的的cDNA单链。单链。用用羟基磷灰石柱羟基磷灰石柱收集单链收集单链cDNA，合成为双，合成为双链链DNA进行扩增、克隆、测序。进行扩增、克隆、测序。AAA组织组织B组织组织总总mRNA（A）总总mRNA（B）含蛋白含蛋白A的的mRNA不含蛋白不含蛋白A的的mRNA总总cDNA第一链第一链A杂交杂交内含蛋白内含蛋白A 的的cDNA羟基磷灰石柱羟基磷灰石柱过柱过柱吸收吸收RNA-DNA单链滤过单链滤过羟基磷灰石柱羟基磷灰石柱BAcDNA文库文库3.mRNA差异显示差异显示PCR（DD RT-PCR）mRNA differential display RT-PCR（1）3端的锚定引物端的锚定引物Oligo(dT)引物的引物的3端加两个核苷酸端加两个核苷酸（倒数第二个不再是（倒数第二个不再是T）。）。AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3 5 NMTTTTTTTTM：A、G or C N:A、G、T or C5 3（2）12种锚定引物种锚定引物AGTTTTTTTT5 3 CGTTTTTTTT5 3 GGTTTTTTTT5 3 TGTTTTTTTT5 3 AATTTTTTTT5 3 CATTTTTTTT5 3 GATTTTTTTT5 3 TA TTTTTTTT5 3 ACTTTTTTTT5 3 CCTTTTTTTT5 3 GCTTTTTTTT5 3 TCTTTTTTTT5 3（3）5端的随机引端的随机引物物10 mer AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3 5 NMTTTTTTTT5 3 扩增扩增cDNA。RTNMTTTTTTTT5 cDNA 3 NNNNNNNNNN5 3 NNNNNNNNNN5 3 cDNA第二链，并第二链，并PCR（4）随机引物与锚定引物成对扩增）随机引物与锚定引物成对扩增12种锚定引物，若与种锚定引物，若与20种随机引物，可种随机引物，可组成组成240组引物。组引物。引物组合：引物组合：240组在能分出组在能分出20000多条带！多条带！实验结果：实验结果：如果每条带相当于一种如果每条带相当于一种mRNA，20000 mRNA基本上反映了一种特定细胞中基本上反映了一种特定细胞中全部的全部的mRNA。在测序胶上，每组扩出在测序胶上，每组扩出50-100条长条长度为度为100-500bp的带。的带。（5）随机）随机-锚定引物锚定引物PCR的产物电泳比较的产物电泳比较不同组织的不同组织的240组引物组合组引物组合PCR产物在产物在测序胶中电泳。测序胶中电泳。选择有差异的带，进一步选择有差异的带，进一步PCR作探针。作探针。筛选文库，找到差别基因的全长序列。筛选文库，找到差别基因的全长序列。二、二、PCR技术获得目的基因技术获得目的基因1.直接从基因组中扩增直接从基因组中扩增（1）提取基因组）提取基因组DNA作模板作模板（2）根据）根据已知已知目的基因序列设计引物目的基因序列设计引物（3）PCR扩增扩增真核生物基因组含有内含子！真核生物基因组含有内含子！适合扩增原核生物基因。适合扩增原核生物基因。(一一)已知目的基因序列已知目的基因序列原核基因组部分原核基因组部分原核细胞原核细胞提取基因组提取基因组DNAPCR扩增扩增（1）提取基因组）提取基因组 total RNA（2）反转录合成总）反转录合成总cDNA作模板作模板（4）PCR扩增扩增（3）根据）根据已知已知目的基因序列设计引物目的基因序列设计引物2.从从mRNA中扩增中扩增:RT-PCR原核生物不易得到原核生物不易得到mRNA，也不含有，也不含有polyA尾。尾。适合扩增真核生物基因。适合扩增真核生物基因。目的基因目的基因 的引物的引物1反转录成目的基因反转录成目的基因cDNA第一链第一链目的基因目的基因 的引物的引物2目的目的 基因基因cDNA第二链第二链PCRmRNA(二二)未知目的基因序列未知目的基因序列（1）反向）反向PCR 扩增两个扩增两个引物外侧引物外侧的未知序列的未知序列把线性把线性DNA模板转变成环形分子。模板转变成环形分子。templatetemplate3 5 5 3（传统（传统PCRPCR只扩增两个引物质之间的已知序列）。只扩增两个引物质之间的已知序列）。技术关键：技术关键：使引物的外侧序列使引物的外侧序列“转变转变”成内侧序列。成内侧序列。(2)盒式盒式PCR盒式PCR（Cassette PCR）是利用Cassette(人工合成的带有适当限制性内切酶粘末端较长的双链DNA分子)和Cassette 上的引物，特异性扩增目的基因组DNA未知区域的一种有效的方法。原理原理首先用适当的在已知DNA区没有识别位点的酶切割，产生含上下游未知区域DNA分子，然后与含有对应限制酶切位点的Cassette进行连接，接着用Cassette 引物1（C1）和根据已知区域设计的特异引物1（S1）进行第一次扩增，最后用 Cassette 引物2（C1）和根据已知区域设计的特异引物2（S2）进行第二次扩增。在设计上Cassette的5端为-OH，所以目的DNA的3末端和Cassette的5末端连接部位形成缺口。因此第一次PCR反应从引物C1开始延伸反应在连接部位终止，控制了非特异性扩增。只有从引物S1延伸合成的DNA链，才能成为引物C1的模板，进行扩增反应。再用内侧引物（C2，S2）进一步进行巢式PCR，高效特异地扩增目的DNA未知区域。(3)RACE技术技术 RACE（Rapid Amplification of cDNA ends）是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA 第一条链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3或5之间的未知序列的方法,分别称为3-RACE或 5-RACE。锚定(Anchored PCR)和反向PCR都可以用于RACE技术，经典RACE就是基于锚定PCR技术原理设计的，而高特异性的RACE是借助于反向PCR技术。3-RACE原理原理 TTTTT-Q1-Q05AAAAA3 QTTTTTT-Q1-Q0第一链第一链cDNAQT第一次扩增 GSP1Q0第二次扩增Q1 GSP2反转录图图 经典经典3-RACE5-RACE原理原理第一链第一链cDNA53 ORF GSP-RTGSP-RT 逆转录逆转录 cDNA 加尾加尾 第一链第一链cDNAGSP-RTAAAA 第一次扩增 Q1-TTTT AAAA第二次扩增Q1图图 经典经典5-RACEGSP1GSP2高特异性的5-RACE原理原理高特异性的RACE基于反向PCR扩增技术,它利用已知序列内部高特异性的嵌套引物进行扩增的原理，故具有较高的特异性。A A A A A A3已知序列Pi 5端磷酸化特异引物逆转录逆转录 A A A A A A3已知序列RNaseH降解掉mRNAT4RNALigase环化单链cDNAA2 A1 S1 S2 PCR1 A1、S1PCR2S2、A2三、转座子标签法三、转座子标签法转座子是一类可以在同一条染色体不同位点或不同染色体间转移的一段特殊的DNA。原理转座子插入基因失活或突变构建纯合突变株基因组文库转座子为探针筛选出包含目的基因片段的阳性克隆目的基因片段为探针筛选野生型的植株构建的基因组文库测序目的基因标签法目的基因标签法 转座子 导入(含转座子的显性纯合体)A A*（隐性纯合体）a a(显性表型)Aa（突变或隐性表型）A*a 自交 aa A*a（突变纯合子）（突变纯合子）A*A*建基因文库建基因文库 目的基因对应的显性目的基因对应的显性隐性性状个体都有隐性性状个体都有非目的基因标签法非目的基因标签法 转座子 导入(含转座子的显性纯合体)A A*（显性纯合体）AA（突变或显性表型）A*A 自交 AA A*A（突变纯合子）（突变纯合子）A*A*建基因文库建基因文库（显性纯合体）AA 关注的是一群因关注的是一群因关注的是一群因关注的是一群因转座子插入引起转座子插入引起转座子插入引起转座子插入引起突变的性状的基突变的性状的基突变的性状的基突变的性状的基因，目的是筛选因，目的是筛选因，目的是筛选因，目的是筛选于某一性状相关于某一性状相关于某一性状相关于某一性状相关的几个基因的几个基因的几个基因的几个基因转座子探针转座子探针 转座子标签法流程图转座子标签法流程图 突变纯合子基因文库 转座子转座子目的片段目的片段 亚克隆亚克隆 PCR获得全长基因获得全长基因 筛选 野生型植野生型植株基因文库株基因文库全长目的基因 四、图位克隆法四、图位克隆法图位克隆：图位克隆：图位克隆：图位克隆：根据目的基因在基因组上的位置特性而不根据目的基因在基因组上的位置特性而不根据目的基因在基因组上的位置特性而不根据目的基因在基因组上的位置特性而不 是其编码产物来进行基因克隆。是其编码产物来进行基因克隆。是其编码产物来进行基因克隆。是其编码产物来进行基因克隆。基因定位的基本步骤：基因定位的基本步骤：1、通过、通过DNA连锁分析、染色体缺失或平衡易位等连锁分析、染色体缺失或平衡易位等方法将目的基因或其突变定位到染色体上。方法将目的基因或其突变定位到染色体上。2、在目的基因的一侧或两侧确定一条或两条紧密、在目的基因的一侧或两侧确定一条或两条紧密连锁的连锁的RFLP或或RAPD分子标记，也可以是已知序分子标记，也可以是已知序列基因片段，两者统称为列基因片段，两者统称为DNA分子标记。分子标记。3、利用紧密连锁的分子标记序列作探针，通过、利用紧密连锁的分子标记序列作探针，通过染染色体步移、染色体登陆色体步移、染色体登陆等技术逐步逼近并最终将目等技术逐步逼近并最终将目的基因分离出来。的基因分离出来。1、染色体步、染色体步移移染色体步移：利用与目的基因紧密连锁的标记DNA片段为探针筛选基因组文库，用已获得的阳性克隆的DNA片段的末端DNA为探针继续筛选，如此进行下去，直到获得含目的基因两侧序列为止。筛选 已知的分子标记基因 未知的目的基因350kbYAC 基因组文库分子标记探针筛选 阳性克隆a探针a探针b阳性克隆b重复筛选直到获得目的基因含目的基因的克隆图 染色体步移筛选目的基因2 2、染色体登陆、染色体登陆、染色体登陆、染色体登陆如基因组文库的平均插入片段的长度大于目如基因组文库的平均插入片段的长度大于目的基因与已知分子标记的物理距离，就可以的基因与已知分子标记的物理距离，就可以通过筛库直接获得含目的基因的大片段克隆，通过筛库直接获得含目的基因的大片段克隆，接着从中分离出目的基因。这样就完全避开接着从中分离出目的基因。这样就完全避开了步移，这种方法称为了步移，这种方法称为染色体登陆染色体登陆。染色体步移往往因为得不到重叠克隆而被染色体步移往往因为得不到重叠克隆而被打断造成前功尽弃或因为基因组的复杂性打断造成前功尽弃或因为基因组的复杂性高而遇到重复序列改变步移方向误入歧途。高而遇到重复序列改变步移方向误入歧途。分子标记 Marker 目的基因 Target gene 100kb 探针 基因组文库 插入DNA 100kb 阳性克隆进一步证实目的基因图 染色体登陆筛选目的基因第五节第五节 酵母双杂交系统酵母双杂交系统Yeast Two Hybrid System(Interaction trap)90年代，纽约大学的年代，纽约大学的S.Field等建立。等建立。有效地分离能与一种已知的靶蛋白相互有效地分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质作用的蛋白质二、酵母双杂交系统的原理二、酵母双杂交系统的原理许多真核生物的许多真核生物的转录激活因子转录激活因子都是由两个都是由两个在结构上可以分开的、功能上也相互独立在结构上可以分开的、功能上也相互独立的的结构域结构域组成。组成。1.结构域（结构域（Domain）合作）合作一、酵母双杂交系统的作用一、酵母双杂交系统的作用例如：例如：啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子GAL4:DNA binding domainActive domainNC1-147aa768-881aa上游激活序列（上游激活序列（UAS）转录机转录机GAL4效应基因效应基因结合结合结合结合激活转录激活转录只要只要DNA binding domain（DNA-BD）与）与Active domain（AD）靠近就能够表现转录激活活性。）靠近就能够表现转录激活活性。实验发现：实验发现：转录表达转录表达2.拆开拆开 DomainDNA binding domainActive domain上游激活序列（上游激活序列（UAS）转录机转录机GAL4效应基因效应基因结合结合用重组用重组DNA技术把技术把GAL4的两个的两个Domain分分开，就开，就丧失丧失了激活效应基因的能力。了激活效应基因的能力。不能转录不能转录3.重组重组Domain用重组用重组DNA技术把这两个技术把这两个Domain分别与分别与两个不同的多肽连接。两个不同的多肽连接。Active domain蛋白蛋白A蛋白蛋白BDNA binding domain在体内，蛋白在体内，蛋白A与蛋白与蛋白B是否能结合。是否能结合。通过效应基因是否被激活来检查：通过效应基因是否被激活来检查：4.观察报告基因表达观察报告基因表达上游激活序列（上游激活序列（UAS）转录机转录机GAL4效应基因效应基因蛋白蛋白ADNA binding domain转录激活转录激活domain蛋白蛋白BGAL4的的DB domain与与AD Domain也不也不能靠近能靠近，所以仍然不能启动效应基因，所以仍然不能启动效应基因的转录。的转录。不能转录不能转录（1）如果蛋白）如果蛋白A与蛋白与蛋白B不能相互结合不能相互结合上游激活序列（上游激活序列（UAS）转录机转录机GAL4效应基因效应基因蛋白蛋白ADNA binding domain转录激活转录激活domain蛋白蛋白B激活转录激活转录GAL4的的DB domain与与AD Domain也能也能靠近靠近，所以能启动效应基因的转录。，所以能启动效应基因的转录。转录表达转录表达（2）如果蛋白）如果蛋白A与蛋白与蛋白B能相互结合能相互结合双杂交原理双杂交原理X基因和基因和Y基因基因产物的相互结产物的相互结合，导致合，导致reporter gene表表达。达。Reporter gene表表达就可说明达就可说明X基基因产物于因产物于Y基因基因产物能结合。产物能结合。三、构建双杂交体系的宿主菌三、构建双杂交体系的宿主菌 删除基因组中的内源野生型删除基因组中的内源野生型GAL4基因基因使酵母菌只能利用使酵母菌只能利用载体载体表达的表达的GAL4蛋白。蛋白。如：如：SFY526;HF7c等菌株。等菌株。四、构建报告基因（四、构建报告基因（reporter gene）GAL4激活组氨酸合成酶的表达，使酵母激活组氨酸合成酶的表达，使酵母菌能生长在菌能生长在组氨酸缺乏培养基组氨酸缺乏培养基上。上。GAL4的效应基因是的效应基因是his3/lacZ/URA3。此外还有其他营养缺陷。此外还有其他营养缺陷。1.穿梭质粒（穿梭质粒（shuttle plasmid）五、构建双杂交体系的穿梭质粒五、构建双杂交体系的穿梭质粒既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母菌中复制和表达的质粒。菌中复制和表达的质粒。2.双杂交体系需要两种穿梭质粒双杂交体系需要两种穿梭质粒分别携带分别携带已知的靶蛋白基因已知的靶蛋白基因和携带和携带未未知基因知基因序列。序列。靶基因按正确的读码结构和取向克隆在靶基因按正确的读码结构和取向克隆在GAL4的的BD之后。之后。（1）BD-plasmidP:ADH1启动子。启动子。T:ADH1终止子。终止子。筛选标志：筛选标志：TRP核定位信号是核定位信号是GAL4本身的一部分本身的一部分ADH：Alcohol dehydrogenase（2）AD-plasmid外源基因按正确阅读框克隆到外源基因按正确阅读框克隆到GAL4的的AD片段之后。片段之后。P:ADHI启动子。启动子。T:ADHI终止子。终止子。筛选标志：筛选标志：LEU2核定位信号是核定位信号是SV40SV40的的T T抗原的抗原的序列序列六、酵母双杂交的实验过程六、酵母双杂交的实验过程1.把蛋白把蛋白A插入到插入到BD质粒上（质粒上（pGBT9）2.把蛋白把蛋白B插入到插入到AD质粒上（质粒上（pGAD424）3.两种重组质粒共同转化酵母菌（两种重组质粒共同转化酵母菌（HF7c）报告基因：报告基因：HIS（合成组氨酸）（合成组氨酸）4.筛选观察筛选观察（1）存活选择）存活选择在缺少在缺少亮氨酸（亮氨酸（LEU）和色氨酸（）和色氨酸（TRP）培培养基上筛选养基上筛选双载体双载体转化子。转化子。双载体转化才能合成双载体转化才能合成亮氨酸和色氨亮氨酸和色氨酸酸，菌体存活。，菌体存活。Trp-Leu-在缺少在缺少组氨酸（组氨酸（HIS）、亮氨酸（）、亮氨酸（LEU）和）和色氨酸（色氨酸（TRP）的培养基上筛选蛋白的培养基上筛选蛋白A和蛋和蛋白白B能相互作用的双载体转化子。能相互作用的双载体转化子。（2）蛋白结合选择）蛋白结合选择His-Trp-Leu-第五章第五章 作业作业1、什么是基因组文库、什么是基因组文库(genomic library)?构建基因组文库，构建基因组文库，涉及哪些基涉及哪些基本过程本过程?它同遗传学上的基因库有什么不同它同遗传学上的基因库有什么不同?2、构建、构建cDNA文库时需要用到哪些工具酶？文库时需要用到哪些工具酶？3、什么是、什么是cDNA文库文库(complement DNA library)?同基因组同基因组文库有何差别文库有何差别?化学合成化学合成DNA亚磷酸三酯法亚磷酸三酯法亚磷酸三酯法亚磷酸三酯法(1)脱二苯甲基保护基(2)活化新的碱基(3)缩合反应(4)盖帽反应(5)氧化反应化学合成化学合成DNA的用处的用处1.直接合成基因直接合成基因2.合成引物（合成引物（20mer左右）左右）3.合成探针序列合成探针序列4.定点突变合成定点突变合成5.合成人工接头或衔接物合成人工接头或衔接物 将某种生物细胞的将某种生物细胞的整个基因组整个基因组DNA切割切割成大小合适的片段，并将成大小合适的片段，并将所有这些片段所有这些片段都与适当的载体连接，引入相应的宿主都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中细胞中保存和扩增保存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的物体的全部基因全部基因，称为基因文库。，称为基因文库。基因文库（基因文库（gene library）cDNA 文文库库利用某种生物的利用某种生物的总总mRNA合成合成cDNA，再将，再将这些这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称行保存和扩增，称cDNA文库。文库。2.mRNA消解杂交消解杂交原理：原理：羟基磷灰石柱羟基磷灰石柱结合结合DNA-RNA或或DNA-DNA双链，双链，不结合单链不结合单链DNA。AAA组织组织B组织组织总总mRNA（A）总总mRNA（B）含蛋白含蛋白A的的mRNA不含蛋白不含蛋白A的的mRNA总总cDNA第一链第一链A杂交杂交内含蛋白内含蛋白A 的的cDNA羟基磷灰石柱羟基磷灰石柱过柱过柱吸收吸收RNA-DNA单链滤过单链滤过羟基磷灰石柱羟基磷灰石柱BAcDNA文库文库mRNA差异显示差异显示PCR（DD RT-PCR）反向反向PCR 盒式盒式PCRRACE技术技术 转座子标签法转座子标签法图位克隆法图位克隆法1、染色体步、染色体步移移染色体步移：利用与目的基因紧密连锁的标记DNA片段为探针筛选基因组文库，用已获得的阳性克隆的DNA片段的末端DNA为探针继续筛选，如此进行下去，直到获得含目的基因两侧序列为止。