基因治疗专题知识讲座培训ppt课件

本章，我们讨论本章，我们讨论4 4个问题。个问题。1.1.概述概述 2.2.基因治疗的原理基因治疗的原理 3.3.基因治疗中外源基因导入技术基因治疗中外源基因导入技术 4.4.基因治疗的应用研究基因治疗的应用研究基因治疗专题知识讲座7/16/20241 本章，我们讨论4个问题。1 第一节第一节 概概 述述基因治疗专题知识讲座7/16/20242 第一节 概 述基因治疗专题知识讲座8/15/2 人类疾病的发生，往往涉及到内源基因的突变人类疾病的发生，往往涉及到内源基因的突变（如遗传病）和外源基因的入侵（如感染性疾病）。（如遗传病）和外源基因的入侵（如感染性疾病）。机体对外来侵袭抵御体现在以下机体对外来侵袭抵御体现在以下4 4个层次：个层次：1.1.整体水平整体水平，诸如动物的打斗撕咬；，诸如动物的打斗撕咬；2.2.细胞水平细胞水平，如，如MM对对“异已异已”吞噬作用；吞噬作用；3.3.分子水平分子水平，如抗原抗体反应，人可以产生，如抗原抗体反应，人可以产生10106 6抗体分子，对付外来侵袭；抗体分子，对付外来侵袭；4.4.基因水平基因水平，对付外源基因入侵，在原核生，对付外源基因入侵，在原核生物中有一种限制性核酸内切酶可将外源基因水解掉。物中有一种限制性核酸内切酶可将外源基因水解掉。基因治疗专题知识讲座7/16/20243 人类疾病的发生，往往涉及到内源基因的 对于内源基因突变对于内源基因突变:至今未找到令人满意的治疗方法。至今未找到令人满意的治疗方法。基因治疗仅仅处于初始阶段。基因治疗仅仅处于初始阶段。全世界接受基因治疗者全世界接受基因治疗者106106人，受试者人，受试者600600人人基因治疗专题知识讲座7/16/20244 对于内源基因突变:基因治疗专题知识讲座8/15/定义：定义：广义地说广义地说，基因治疗是应用基因或基因产物，基因治疗是应用基因或基因产物，治疗疾病的一种方法。治疗疾病的一种方法。从狭义地说从狭义地说，基因治疗，基因治疗是把外界的正常基因或治疗基因，通过载体转是把外界的正常基因或治疗基因，通过载体转移到人体的靶细胞，进行基因修饰和表达，改移到人体的靶细胞，进行基因修饰和表达，改善疾病的一种治疗手段。善疾病的一种治疗手段。一、基因治疗的概念一、基因治疗的概念 基因治疗是治疗基因突变性疾病的一项根本基因治疗是治疗基因突变性疾病的一项根本性措施，同时它为非基因突变性疾病提供了一性措施，同时它为非基因突变性疾病提供了一个新的治疗手段。个新的治疗手段。基因治疗专题知识讲座7/16/20245定义：广义地说，基因治疗是应用基因或基因产物，治疗疾病的一种二、基因治疗的策略二、基因治疗的策略两个基本策略两个基本策略:原位矫正病变基因原位矫正病变基因基因取代或基因干预基因取代或基因干预基因治疗专题知识讲座7/16/20246二、基因治疗的策略两个基本策略:原位矫正病变基因基因治疗专题 象外科移植手术，切除病变部分，换上正象外科移植手术，切除病变部分，换上正常健康基因，这在目前还难以做到常健康基因，这在目前还难以做到 (一一)原位矫正病变基因原位矫正病变基因(纠正异常碱基纠正异常碱基)图图11-1 11-1 镰形红细胞贫血病人的镰形红细胞贫血病人的HbHb为为HbS(HbS(由由 珠蛋白基因点突变引起珠蛋白基因点突变引起)基因治疗专题知识讲座7/16/20247 象外科移植手术，切除病变部分，换上正常(二二)基基 因因 取取 代代 或或 基基 因因 干干 预预基因置换基因置换(gene replacement)(gene replacement)通过体内基因同源重组通过体内基因同源重组,原位替换病变细胞内的致病基因原位替换病变细胞内的致病基因基因增补基因增补(gene augmentation)(gene augmentation)不除去异常基因，向靶细胞导入外源基因通过非定点不除去异常基因，向靶细胞导入外源基因通过非定点整合，使其表达产物，从而弥补缺陷基因的功能整合，使其表达产物，从而弥补缺陷基因的功能基因干预基因干预(gene interference)(gene interference)在转录或翻译水平阻断某些基因的异常表达。包括反义在转录或翻译水平阻断某些基因的异常表达。包括反义RNARNA、核酶核酶、三链三链DNADNA及干扰及干扰RNARNA技术技术基因治疗专题知识讲座7/16/20248(二)基因取代或基因干预基因置换(gene replace 三、基因治疗中的靶细胞三、基因治疗中的靶细胞 生殖细胞生殖细胞:优点优点治本治本 困难困难生殖生殖(学学)生物学问题生物学问题，极其复杂且不清楚。，极其复杂且不清楚。伦理学问题伦理学问题名人精子库名人精子库”，“美女卵子库美女卵子库”，总是别人的，总是别人的“种种”，不好办，即使这个问题解决，恐怕未必然，不好办，即使这个问题解决，恐怕未必然，爱因斯坦生了个弱智女，马克思后代在开出租车爱因斯坦生了个弱智女，马克思后代在开出租车（不是说开出租车不好，特此声明）（不是说开出租车不好，特此声明）基因治疗专题知识讲座7/16/20249 三、基因治疗中的靶细胞 生殖细胞:名人精子库”体细胞体细胞目前常用体细胞有：目前常用体细胞有：淋巴细胞淋巴细胞 骨髓细胞骨髓细胞 内皮细胞内皮细胞 皮肤纤维细胞皮肤纤维细胞 肝细胞肝细胞 肌细胞肌细胞 角化细胞角化细胞(keratinoyte)(keratinoyte)多种肿瘤细胞多种肿瘤细胞附附:选择靶细胞依据选择靶细胞依据疾病累及的主要部位。疾病累及的主要部位。靶细胞来源的难易程度。靶细胞来源的难易程度。体外培养的成活率和存活时间。体外培养的成活率和存活时间。接受正常基因的能力。接受正常基因的能力。新的正常基因能否在靶细胞能否新的正常基因能否在靶细胞能否 正常表达和持续时间。正常表达和持续时间。基因治疗专题知识讲座7/16/202410体细胞目前常用体细胞有：附:选择靶细胞依据基因治疗专题知 四、基因治疗的途径四、基因治疗的途径 1.1.间接体内疗法（间接体内疗法（ex vivoex vivo）体外将治疗基因体外将治疗基因靶细胞内靶细胞内,再将经基因修饰再将经基因修饰靶细胞靶细胞病人病人,使这种外源基因使这种外源基因(细胞细胞)在体内表达，在体内表达，从而达到基因治疗目的从而达到基因治疗目的.(.(目前多采用这种疗法目前多采用这种疗法)。2.2.体内法体内法(in vivo)(in vivo)外源基因外源基因直接导入体内有关组织器官直接导入体内有关组织器官进入进入相应组织器官进行表达相应组织器官进行表达从而达到基因治疗目的。从而达到基因治疗目的。基因治疗专题知识讲座7/16/202411 四、基因治疗的途径 1.间接体内疗法（ex vi 基基 因因 治治 疗疗 的的 基基本本原原理理第第 二二 节节基因治疗专题知识讲座7/16/202412 基因治疗的 基本原理第 二 节基因基因治疗的基本程序基因治疗的基本程序(基本原理或基本步骤基本原理或基本步骤)：治疗性基因的选择治疗性基因的选择基因载体的基因载体的选择选择 病毒载体病毒载体 非病毒载体非病毒载体靶细胞的选择靶细胞的选择 体细胞体细胞 生殖细胞生殖细胞载体与治疗基因载体与治疗基因重组及筛选鉴定重组及筛选鉴定将重组将重组DNADNA导入靶细胞导入靶细胞,检测目的检测目的基因和标记基因的表达产物基因和标记基因的表达产物基因治疗专题知识讲座7/16/202413基因治疗的基本程序(基本原理或基本步骤)：治疗性基因的选择基基因治疗的基本程序基因治疗的基本程序(基本原理或基本步骤基本原理或基本步骤)：基因转移基因转移 间接体内疗法间接体内疗法 直接体内疗法直接体内疗法转导细胞的筛转导细胞的筛选与鉴定选与鉴定回输体内回输体内利用标记基因和目的基因的表达产物利用标记基因和目的基因的表达产物利用核酸分子杂交利用核酸分子杂交考核疗效和安全性考核疗效和安全性基因治疗专题知识讲座7/16/202414基因治疗的基本程序(基本原理或基本步骤)：基因转移 基因工程基因工程 基因治疗基因治疗1.目的基因目的基因 应用或研究基因应用或研究基因 标志基因标志基因+治疗基因治疗基因2.载载 体体 (原核或真核原核或真核)(真核真核)3.靶靶 细细 胞胞 原、真核原、真核 真真 核核4.DNA体外重组体外重组 5.重组重组DNA导入宿主细胞导入宿主细胞 6.后处理后处理 基因治疗与基因工程的比较基因治疗与基因工程的比较基因治疗专题知识讲座7/16/202415 第第 三三 节节基基 因因 转转 移移 技技 术术基因治疗专题知识讲座7/16/202416 第 三 节基因转移技术基因治疗专题知识讲座8 生物学方法生物学方法 非生物学方法非生物学方法逆转录病毒载体逆转录病毒载体 磷酸钙共沉淀法磷酸钙共沉淀法 腺病毒载体腺病毒载体 质粒质粒DNA/脂质体法脂质体法腺相关病毒载体腺相关病毒载体 电击法电击法单纯疱疹病毒载体单纯疱疹病毒载体 受体介导转移法受体介导转移法 注射法注射法以逆转录病毒法最为常用，以磷酸钙法最为便宜（经济），以注射以逆转录病毒法最为常用，以磷酸钙法最为便宜（经济），以注射法最为简捷，最值得研究和推广应用（笑话，也最危险。）法最为简捷，最值得研究和推广应用（笑话，也最危险。）转移基因方法转移基因方法基因治疗专题知识讲座7/16/202417 生物学方法 基因治疗专题知识讲座7/16/202418基因治疗专题知识讲座8/15/202318 一一.病毒载体病毒载体转基因的生物学方法转基因的生物学方法（一）逆转录病毒的生活（命）周期（一）逆转录病毒的生活（命）周期逆转录病毒载体逆转录病毒载体（二）逆转录病毒的基因组结构（二）逆转录病毒的基因组结构(三三)逆转录病毒载体结构功能特点逆转录病毒载体结构功能特点 (四四)重组逆转录病毒载体结构重组逆转录病毒载体结构（五）重组逆转录病毒的制备（五）重组逆转录病毒的制备（六）重组逆转录病毒基因转移系统（六）重组逆转录病毒基因转移系统（七）逆转录病毒载体介导基因转移的安全性问题（七）逆转录病毒载体介导基因转移的安全性问题基因治疗专题知识讲座7/16/202419 一.病毒载体转基因的生物学方法 1.1.吸附吸附病毒衣壳糖蛋白与细胞膜受体特异性结合，吸病毒衣壳糖蛋白与细胞膜受体特异性结合，吸 附在膜受体上。附在膜受体上。2.2.入胞入胞病毒核酸进入病毒核酸进入hosthost细胞，逆转录，整合到细胞，逆转录，整合到 host DNA host DNA 中去，转录、复制中去，转录、复制 3.3.病毒颗粒成熟病毒颗粒成熟病毒核酸和病毒蛋白装配成成熟病毒核酸和病毒蛋白装配成成熟 病毒颗粒病毒颗粒 4.4.病毒颗粒的释放病毒颗粒的释放释放的子病毒又可感染其它细释放的子病毒又可感染其它细 胞，每个细胞可以释放胞，每个细胞可以释放10105 5子病毒。子病毒。（一）逆转录病毒的生活（命）周期（一）逆转录病毒的生活（命）周期基因治疗专题知识讲座7/16/202420 1.吸附病毒衣壳糖蛋白与细胞膜受体特异性结合，吸（图图11-2 Rous11-2 Rous肉瘤病毒毒粒结构示意图肉瘤病毒毒粒结构示意图基因治疗专题知识讲座7/16/202421 图11-2 Rous肉瘤病毒毒粒结构示意图基因1.1.一般特征一般特征(1)(1)正链正链RNARNA病毒病毒 即与即与mRNAmRNA极性相同（极性相同（5353），反之为），反之为(一一)；(2)5(2)5有有m m7 7GpppGppp帽，帽，33有有polypoly（A A）尾；）尾；(3)(3)病毒进入细胞后，经本身逆转录成双链病毒进入细胞后，经本身逆转录成双链cDNAcDNA分子分子细胞核并整细胞核并整合到宿主染色体合到宿主染色体,这种整合病毒这种整合病毒DNADNA称为称为前病毒前病毒(provirus)(provirus)(不管是不管是源于源于RNARNA还是还是DNA)(DNA)(并非所有逆转录病毒都致癌并非所有逆转录病毒都致癌)。（二）逆转录病毒的基因组结构（二）逆转录病毒的基因组结构基因治疗专题知识讲座7/16/2024221.一般特征（二）逆转录病毒的基因组结构基因治疗专题知识讲座 图图11-3 11-3 逆转录病毒基因组的基本结构逆转录病毒基因组的基本结构 2 2基因组结构基因组结构基因治疗专题知识讲座7/16/202423 图11-3 逆转录病毒基因组的基本结构 2基 (三三)逆转录病毒载体结构功能特点逆转录病毒载体结构功能特点 保留病毒的保留病毒的LTR,LTR,去除病毒的结构基因去除病毒的结构基因,加加上一个抗性标记基因上一个抗性标记基因LTRLTRLTRLTRNeoNeoAmpAmpr roriEoriE基因治疗专题知识讲座7/16/202424 (三)逆转录病毒载体结构功能特点 保留病毒的L (四四)重组逆转录病毒载体结构重组逆转录病毒载体结构保留病毒的保留病毒的LTR,LTR,用目的基因和抗性标记基用目的基因和抗性标记基因置换了病毒的结构基因因置换了病毒的结构基因LTRLTRLTRLTRNeoNeoAmpAmpr roriEoriETarget geneTarget gene基因治疗专题知识讲座7/16/202425 (四)重组逆转录病毒载体结构保留病毒的LTR 常用逆转录病毒载体的结构示意图常用逆转录病毒载体的结构示意图 基因治疗专题知识讲座7/16/202426 常用逆转录病毒载体的结构示意图 基因治疗专题知识 （五）重组逆转录病毒的制备（五）重组逆转录病毒的制备 是将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆是将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转录病毒（辅助病毒）导入哺乳细胞内而制备成转录病毒（辅助病毒）导入哺乳细胞内而制备成的一种特殊的细胞系，这种细胞因携带有逆转录的一种特殊的细胞系，这种细胞因携带有逆转录病毒基因组而大量产生病毒包装蛋白，而辅助病病毒基因组而大量产生病毒包装蛋白，而辅助病毒自身缺乏包装信号（毒自身缺乏包装信号（序列）而不能包装序列）而不能包装,不产不产生病毒颗粒。生病毒颗粒。1 1包装细胞包装细胞 (1)(1)包装细胞定义包装细胞定义基因治疗专题知识讲座7/16/202427 （五）重组逆转录病毒的制备 是将缺失了包装 为了获得感染能力为了获得感染能力,逆转录病毒载体不含病毒的结构基因逆转录病毒载体不含病毒的结构基因,不能产生不能产生gaggag、polpol、envenv 野生型野生型MO-MLVMO-MLV可供这些蛋白质，为什么不用野生型可供这些蛋白质，为什么不用野生型M MO O-MLV-MLV？包装后会产生大量有复制能力的野生型病毒颗粒，进入包装后会产生大量有复制能力的野生型病毒颗粒，进入体内可能大量复制，具有插入突变危险，特别是插入激活癌基因，体内可能大量复制，具有插入突变危险，特别是插入激活癌基因，灭活抑癌基因危险，不利于治疗用。灭活抑癌基因危险，不利于治疗用。所以要设计一种细胞所以要设计一种细胞重组逆转录病毒载体只能在其重组逆转录病毒载体只能在其中包装成重组逆转录病毒颗粒（确切的说，只有一次感染能力），中包装成重组逆转录病毒颗粒（确切的说，只有一次感染能力），但能从中释放出来到靶细胞，这就是包装细胞，不产生复制能力但能从中释放出来到靶细胞，这就是包装细胞，不产生复制能力的野生型包装结构。的野生型包装结构。(2)(2)为什么要包装细胞？为什么要包装细胞？基因治疗专题知识讲座7/16/202428 为了获得感染能力,逆转录病毒载体不含病毒的结构基 (3)(3)三代包装细胞三代包装细胞第一代包装细胞第一代包装细胞22细胞系细胞系:这种细胞的基因组中整合有仅仅缺失包装信这种细胞的基因组中整合有仅仅缺失包装信号的号的MLVMLV前病毒基因组。只要与载体（含）之间有一次前病毒基因组。只要与载体（含）之间有一次重组，就可以产生有复制能力的野生型病毒。重组，就可以产生有复制能力的野生型病毒。第第2 2代包装细胞代包装细胞 PA317PA317细胞系细胞系:含逆转录病毒含逆转录病毒PAM3PAM3基因组，缺失基因组，缺失信号及部信号及部分分5 5 LTRLTR，3 3 LTRLTR被被SV40SV40的多聚的多聚A A化信号取代化信号取代,与载体至少与载体至少要经过要经过2 2次独立的重组才能形成有复制能力的野生型病毒次独立的重组才能形成有复制能力的野生型病毒 第第3 3代包装细胞代包装细胞 CRIP:CRIP:含含2 2种逆转录病毒基因组种逆转录病毒基因组,每种不仅缺失每种不仅缺失信号信号 ,且仅含病毒的部分结构基因且仅含病毒的部分结构基因,经过多次独立重组，才能经过多次独立重组，才能产生有复制能力的野生型病毒产生有复制能力的野生型病毒 基因治疗专题知识讲座7/16/202429 (3)三代包装细胞第一代包装细胞2细胞系:2 2重组逆转录病毒的制备重组逆转录病毒的制备-LTRLTRLTRLTRNeoNeoLTRLTRLTRLTRNeoNeoTarget geneTarget geneLTRLTRLTRLTRgaggag polpol envenv形成假病毒形成假病毒,出芽释放到细胞外出芽释放到细胞外逆转录病毒载体逆转录病毒载体重组逆转录重组逆转录病毒载体病毒载体转染进包装细胞转染进包装细胞,整合后转录成整合后转录成RNARNA重组逆转录病毒的重组逆转录病毒的RNARNA被病毒蛋白包装被病毒蛋白包装包装细胞已整合包装细胞已整合有缺失有缺失的逆转的逆转录病毒基因录病毒基因,可产可产生病毒的结构蛋生病毒的结构蛋白白基因治疗专题知识讲座7/16/2024302重组逆转录病毒的制备-LTRLTRNe （六）重组逆转录病毒基因转移系统（六）重组逆转录病毒基因转移系统1 1逆转录病毒介导基因转移的靶组织细胞逆转录病毒介导基因转移的靶组织细胞 靶细胞的最基本要求靶细胞的最基本要求:细胞表面具有逆转录病毒相应的受体细胞表面具有逆转录病毒相应的受体 最常用作基因治疗的靶有：最常用作基因治疗的靶有：骨髓干细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、骨髓干细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞，还包肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞，还包括所有的肿瘤细胞括所有的肿瘤细胞 基因治疗专题知识讲座7/16/202431 （六）重组逆转录病毒基因转移系统1逆转录病毒介 2 2基因转移的方法与途径基因转移的方法与途径 ex vivo分离培养宿主细胞分离培养宿主细胞,离体转移基因离体转移基因,效率高，效率高，但大多人体组织细胞原代培养比较困难。但大多人体组织细胞原代培养比较困难。in vivo重组逆转病毒载体直接注射的途径主要有：重组逆转病毒载体直接注射的途径主要有：采用静脉注射途径采用静脉注射途径直接将产生重组逆转录病毒载体的包装细直接将产生重组逆转录病毒载体的包装细胞注射到组织或肿瘤中胞注射到组织或肿瘤中直接将表达载体，直接将表达载体，基因治疗专题知识讲座7/16/202432 2基因转移的方法与途径 ex vivo分离培养 3 3重组逆转录病毒靶向基因转移重组逆转录病毒靶向基因转移 重组逆转录病毒前病毒整合位点的靶向性重组逆转录病毒前病毒整合位点的靶向性 大多数前病毒的整合作用是随机的，对大多数前病毒的整合作用是随机的，对DNase IDNase I超敏区超敏区域和转录活化区域的整合是具有优先整合的倾向性。在肿域和转录活化区域的整合是具有优先整合的倾向性。在肿瘤中前病毒优先与细胞原癌基因和染色体脆性位点整合。瘤中前病毒优先与细胞原癌基因和染色体脆性位点整合。通过基因转移的方法与途径限制受感染细胞通过基因转移的方法与途径限制受感染细胞 ex vivo:ex vivo:被感染的靶细胞被预先选择，细胞靶向性能够被感染的靶细胞被预先选择，细胞靶向性能够很好地实现很好地实现 in vivo:in vivo:将重组病毒注射到特定的组织器官或其腔体内，将重组病毒注射到特定的组织器官或其腔体内，以达到较好的组织细胞选择性基因转移的目的，如进行肿以达到较好的组织细胞选择性基因转移的目的，如进行肿瘤实体内注射，使重组病毒主要感染肿瘤细胞。瘤实体内注射，使重组病毒主要感染肿瘤细胞。基因治疗专题知识讲座7/16/202433 3重组逆转录病毒靶向基因转移 重组逆转录病毒 病毒感染水平的限制病毒感染水平的限制 利用逆转录病毒对人类细胞的某些亚群具有限制性的利用逆转录病毒对人类细胞的某些亚群具有限制性的亲嗜性亲嗜性。如如HIVHIV和和HTLV-1 HTLV-1 基因转录水平的限制基因转录水平的限制 在逆转录病毒载体中导入具有基因表达调节作用的序列在逆转录病毒载体中导入具有基因表达调节作用的序列利用利用-甲胎蛋白基因的肝组织特定性调节成分与甲胎蛋白基因的肝组织特定性调节成分与TKTK基基因相连因相连基因治疗专题知识讲座7/16/202434 病毒感染水平的限制 利用逆转录病毒对人类细胞5LTRNeoAmproriE3LTR插入外源cDNA5LTRNeoAmproriE3LTRcDNASLTRSLTR转录g pemRNAmRNA病毒蛋白质包装完成假病毒颗包装，分泌到包装细胞培养上清液中。逆转录感染靶细胞前病毒前病毒插入外源基因转录mRNA翻译蛋白质G418筛选逆转录病毒载体转染靶细胞的基本过程转染包装细胞，转录出RNA基因治疗专题知识讲座7/16/2024355LTRNeoAmproriE3LTR插入外源cDNA （七）逆转录病毒载体介导基因转移的安全性问题（七）逆转录病毒载体介导基因转移的安全性问题1 1产生野生型病毒产生野生型病毒 存在有复制能力的野生型病毒，主要来源于载体存在有复制能力的野生型病毒，主要来源于载体和和不含不含序列的辅助病毒重组成野生型病毒序列的辅助病毒重组成野生型病毒 2 2逆转录病毒载体插入的破坏性逆转录病毒载体插入的破坏性 逆转录病毒载体携带的基因在受体细胞染色体上的基因逆转录病毒载体携带的基因在受体细胞染色体上的基因组合是随机的。与临近基因相互作用组合是随机的。与临近基因相互作用,可能激活癌基因，可能激活癌基因，灭活抑癌基因或破坏细胞生长的必需基因。灭活抑癌基因或破坏细胞生长的必需基因。3 3污染问题污染问题 基因治疗专题知识讲座7/16/202436 （七）逆转录病毒载体介导基因转移的安全性问题1 由于病毒的感染性和寄生特性，由于病毒的感染性和寄生特性，使现在约使现在约85%85%基因治疗临基因治疗临床项目采用病毒载体。但是病毒载体存在免疫原性高、毒性床项目采用病毒载体。但是病毒载体存在免疫原性高、毒性大、目的基因容量小，靶向特异性差，制备复杂及费用较高大、目的基因容量小，靶向特异性差，制备复杂及费用较高等不足。所以人们愈来愈重视非病毒法的研究。等不足。所以人们愈来愈重视非病毒法的研究。非病毒载体的本质是将基因治疗中基因看作为药物，非病毒载体的本质是将基因治疗中基因看作为药物，然后从药剂和药理学的角度如何把基因导入靶细胞或组织、然后从药剂和药理学的角度如何把基因导入靶细胞或组织、器官并进行表达。器官并进行表达。基因作为药物发挥治疗作用的关键问题是基因作为药物发挥治疗作用的关键问题是导入的靶向性，表达的有效性和可调控性。导入的靶向性，表达的有效性和可调控性。二二.非病毒载体非病毒载体 转基因的非生物学方法转基因的非生物学方法基因治疗专题知识讲座7/16/202437 二.非病毒载体 转基因的非生物学方法基因治疗非病毒载体优缺点非病毒载体优缺点优优 点点 缺缺 点点1.不需包装细胞，不需包装细胞，制备易、省时、制备易、省时、滴度也不受限制，并且可对质粒滴度也不受限制，并且可对质粒或其他形式核酸进行快速分析；或其他形式核酸进行快速分析；2.对基因大小或核酸类型不限；对基因大小或核酸类型不限；3.免疫原性低，急性毒性小，对免疫原性低，急性毒性小，对受试者比较安全；受试者比较安全；4.可具有特异靶向性，可具有特异靶向性，并能转移并能转移至非分裂期细胞并有效表达；至非分裂期细胞并有效表达；5.制备方便且重复性好，制备方便且重复性好，具有完具有完全人工合成和大规模生产可行性，全人工合成和大规模生产可行性，因此较简单和廉价。因此较简单和廉价。1.转移效率较病毒载体低。转移效率较病毒载体低。2.基因表达持续时间短；基因表达持续时间短；3.许多问题仍需求助病毒或病毒许多问题仍需求助病毒或病毒成分解决。成分解决。基因治疗专题知识讲座7/16/202438非病毒载体优缺点优 点 缺 点1.不需包装细胞1.1.方法方法 用一定比例的磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸用一定比例的磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸共溶于氯仿共溶于氯仿制备成双层磷脂的封闭囊泡制备成双层磷脂的封闭囊泡超声波处理超声波处理将待转移外源基因将待转移外源基因DNADNA包入包入制备成脂质体制备成脂质体/质粒质粒DNADNA复合物复合物利用其能与细胞膜融合的特性，可将质粒利用其能与细胞膜融合的特性，可将质粒DNADNA转入细胞中。转入细胞中。2.2.优点优点 脂质体作为载体可以携带各种脂质体作为载体可以携带各种DNADNA片段，且片段，且在转移途中保护基因不被核酸酶降解。在转移途中保护基因不被核酸酶降解。3.3.缺点缺点 转移效率低、制备麻烦、商品较贵。转移效率低、制备麻烦、商品较贵。（一）脂质体介导的转移方法（一）脂质体介导的转移方法基因治疗专题知识讲座7/16/2024391.方法 用一定比例的磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸共溶于 1阳离子脂质体阳离子脂质体 由带正电荷的脂类如四胺基去污剂、胆固醇阳离子由带正电荷的脂类如四胺基去污剂、胆固醇阳离子衍生物、二酰基甘油和多胺的脂类衍生物和中性辅衍生物、二酰基甘油和多胺的脂类衍生物和中性辅助脂类如二油酰基磷脂酰乙醇胺（助脂类如二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPEDOPE）或二油酰）或二油酰基磷脂酰胆碱（基磷脂酰胆碱（DOPCDOPC）等摩尔混合组成。等摩尔混合组成。通过电荷的相互作用，阳性电荷的脂质体和带通过电荷的相互作用，阳性电荷的脂质体和带阴电荷的阴电荷的DNADNA之间可以有效地形成复合物。由于具之间可以有效地形成复合物。由于具有多余的正电荷，复合体可以与细胞膜带负电荷的有多余的正电荷，复合体可以与细胞膜带负电荷的唾液酸结合，然后通过内吞作用摄取载体复合体。唾液酸结合，然后通过内吞作用摄取载体复合体。基因治疗专题知识讲座7/16/202440 1阳离子脂质体 由带正电荷的脂类如四胺基去污剂 2 2阴离子（阴离子（anionicanionic）脂质体）脂质体 含有磷脂酰丝氨酸或含含有磷脂酰丝氨酸或含50%50%二棕榈磷脂酰甘油二棕榈磷脂酰甘油,由于由于磷脂和寡聚核苷酸均带负电荷，磷脂和寡聚核苷酸均带负电荷，必须在脂质体中加必须在脂质体中加入钙离子入钙离子方可提高包装效率。由阴离子脂质体转运方可提高包装效率。由阴离子脂质体转运的寡聚核苷酸首先定位细胞核，也延长了寡聚核苷的寡聚核苷酸首先定位细胞核，也延长了寡聚核苷酸在细胞内的保留时间。酸在细胞内的保留时间。阴离子脂类可以置换阳离子脂质阴离子脂类可以置换阳离子脂质/DNA/DNA复合体的复合体的DNADNA 基因治疗专题知识讲座7/16/202441 2阴离子（anionic）脂质体 含有磷脂酰 3 3pHpH敏感型脂质体敏感型脂质体 可由二油酰胆碱（可由二油酰胆碱（DOPEDOPE）、胆固醇和油酸以）、胆固醇和油酸以4 4：4 4：2 2（摩尔比）组成（摩尔比）组成 DOPEDOPE决定了脂质体在中性决定了脂质体在中性pHpH条件下的稳定性和酸条件下的稳定性和酸性条件下与细胞融合的能力性条件下与细胞融合的能力 酸性条件下可导致其脂肪酸羧基的质子化而引起酸性条件下可导致其脂肪酸羧基的质子化而引起六角晶相的形成导致膜融合的发生六角晶相的形成导致膜融合的发生 基因治疗专题知识讲座7/16/202442 3pH敏感型脂质体 可由二油酰胆碱（DOPE）（二）受体介导的基因转移技术（二）受体介导的基因转移技术 1.1.方法方法 利用细胞表面各种特定受体的配基为利用细胞表面各种特定受体的配基为“导弹头导弹头”与多价阳离子聚合物（或能与其它能强烈吸附与多价阳离子聚合物（或能与其它能强烈吸附DNADNA物质物质相连接），构成导向性运输载体，通过细胞内吞作用，将相连接），构成导向性运输载体，通过细胞内吞作用，将目的基因靶向性地移至某种特定细胞内基因转移的方法。目的基因靶向性地移至某种特定细胞内基因转移的方法。2.2.特点：特点：受体介导内吞作用具有：受体介导内吞作用具有：1 1）细胞组织器官特异性；细胞组织器官特异性；2 2）转移效率高。转移效率高。3.3.举例：举例：此法研究较多的是唾液酸糖蛋白与转铁蛋白。此法研究较多的是唾液酸糖蛋白与转铁蛋白。如：利用唾液酸糖蛋白（配体）携带表达载体已如：利用唾液酸糖蛋白（配体）携带表达载体已成功地将目的基因转移至肝细胞内，获得目的基因表达。成功地将目的基因转移至肝细胞内，获得目的基因表达。基因治疗专题知识讲座7/16/202443 （二）受体介导的基因转移技术 1.方法 利用 （三）注射法（三）注射法1 1直接注射直接注射 将裸露将裸露DNADNA直接注入肌肉内，外源基因在肌肉中的表达直接注入肌肉内，外源基因在肌肉中的表达量与注入的外源性基因含量成正比，与溶液体积无关。量与注入的外源性基因含量成正比，与溶液体积无关。2 2显微注射法显微注射法 采用特别的显微注射器在显微镜下把重组采用特别的显微注射器在显微镜下把重组DNADNA导入靶细胞导入靶细胞 显微注射法显微注射法:在显微镜下将注射器针头穿过细胞膜后刺入在显微镜下将注射器针头穿过细胞膜后刺入细胞核，将重组细胞核，将重组DNADNA直接注入受体细胞核中直接注入受体细胞核中 穿刺法穿刺法:在显微镜下用显微注射针穿刺细胞膜及核膜，在显微镜下用显微注射针穿刺细胞膜及核膜，将重组将重组DNADNA加入细胞培养液中，使细胞周围的重组加入细胞培养液中，使细胞周围的重组DNADNA有有机会进入细胞中机会进入细胞中 基因治疗专题知识讲座7/16/202444 （三）注射法1直接注射 将裸露DNA直接注入肌 （四）电泳冲介导法（电穿孔法）（四）电泳冲介导法（电穿孔法）是对受体细胞加入高压电脉冲，使细胞上形是对受体细胞加入高压电脉冲，使细胞上形成许多瞬间小孔，从而使不同细胞之间的原生质成许多瞬间小孔，从而使不同细胞之间的原生质发生融合，或使外源发生融合，或使外源DNADNA通过细胞膜上出现瞬间通过细胞膜上出现瞬间小孔而进入细胞。小孔而进入细胞。（五）超声介导的转染方法（五）超声介导的转染方法（六）微粒轰击法（六）微粒轰击法(七七)磷酸钙共沉淀法磷酸钙共沉淀法基因治疗专题知识讲座7/16/202445 （四）电泳冲介导法（电穿孔法）是对受体细胞 三、非病毒载体的优化策略三、非病毒载体的优化策略（一）靶向性问题（一）靶向性问题 利用细胞表面特异性表达的受体或蛋白来解利用细胞表面特异性表达的受体或蛋白来解决靶向性（决靶向性（targetingtargeting）问题）问题 例如例如:唾液酸糖蛋白（唾液酸糖蛋白（asialo-glycoproteinasialo-glycoprotein，ASGPASGP）能与肝细胞上去唾液酸糖蛋白受体特）能与肝细胞上去唾液酸糖蛋白受体特异性结合并介导内吞的特点，将异性结合并介导内吞的特点，将ASGPASGP与携带与携带DNADNA的多聚阳离子多肽共价结合，证明的多聚阳离子多肽共价结合，证明DNADNA主要进入主要进入肝细胞并能高效表达肝细胞并能高效表达 靶向性配体主要有单克隆抗体、病毒胞膜蛋靶向性配体主要有单克隆抗体、病毒胞膜蛋白、生长因子或激素等白、生长因子或激素等 配体和配体和DNADNA连接的物质主要有多聚赖氨酸、精蛋连接的物质主要有多聚赖氨酸、精蛋白和阳离子脂质体，白和阳离子脂质体，DNADNA嵌合剂、嵌合剂、DNADNA抗体等抗体等 基因治疗专题知识讲座7/16/202446 三、非病毒载体的优化策略（一）靶向性问题 （二）内吞小泡释放（二）内吞小泡释放（endosome releasingendosome releasing）问题）问题促进促进DNADNA从内吞小泡释放策略：从内吞小泡释放策略：利用抑制溶酶体的药物、融合型脂类、利用抑制溶酶体的药物、融合型脂类、pHpH敏感脂质体敏感脂质体或有侧链的多聚阳离子和星状树突体等来破坏内吞小泡或有侧链的多聚阳离子和星状树突体等来破坏内吞小泡膜以释放其中的膜以释放其中的DNADNA；通过耦联技术，利用病毒或病毒蛋白、细菌蛋白、通过耦联技术，利用病毒或病毒蛋白、细菌蛋白、短肽等。短肽等。基因治疗专题知识讲座7/16/202447 （二）内吞小泡释放（endosome relea （三）转运入核问题（三）转运入核问题 SV40 SV40的大的大T T抗原的抗原的PKKKRKVPKKKRKV序列序列、VP1VP1、肽核酸和、肽核酸和聚乙烯亚胺（聚乙烯亚胺（PEIPEI）可以促进）可以促进DNADNA的核转运。的核转运。（四）基因及其表达调控问题（四）基因及其表达调控问题 通过优化启动子、增强子、内含子、终止序列及密通过优化启动子、增强子、内含子、终止序列及密码子的使用来提高载体质粒上靶基因的表达和安全性。码子的使用来提高载体质粒上靶基因的表达和安全性。入核问题也可属于此范畴。入核问题也可属于此范畴。基因治疗专题知识讲座7/16/202448 （三）转运入核问题 SV40的大T抗原的 第第 四四 节节反反 义义 R RN NA A、核核酶酶和和三三链链 D DN NA A在在 基基 因因 治治 疗疗 中中 的的 应应 用用 基因治疗专题知识讲座7/16/202449 第 四 节反义RNA、核酶和三链DNA在基因 核酸包括核酸包括DNADNA和和RNARNA，都是遗传物质，所以反，都是遗传物质，所以反义核酸可称作反义基因，即义核酸可称作反义基因，即能通过互补碱基与能通过互补碱基与DNADNA或或mRNAmRNA互补的核酸分子。互补的核酸分子。反义反义RNARNA技术、核酶技术、三链技术、核酶技术、三链DNADNA技术，技术，广义地说，这广义地说，这3 3者可以统称为反义核酸技术者可以统称为反义核酸技术，3 3者之间有一定联系，也有一定的区别。者之间有一定联系，也有一定的区别。一一.反义核酸的概念反义核酸的概念基因治疗专题知识讲座7/16/202450 核酸包括DNA和RNA，都是遗传物质，所以反义核酸1.1.反义反义RNARNA（antisense RNAantisense RNA）:与与mRNAmRNA互补的互补的RNA RNA。结合时，。结合时，可阻止可阻止mRNAmRNA翻译产生蛋白质翻译产生蛋白质。2.2.核酶（核酶（ribozymeribozyme）：具有催化功能的：具有催化功能的RNARNA称为核酶。其与称为核酶。其与相应相应mRNAmRNA结合后能发挥酶活性，将结合后能发挥酶活性，将mRNAmRNA降解。降解。3.3.三链三链DNA(DNA(反义基因反义基因)：是人工合成的寡核苷酸：是人工合成的寡核苷酸（oligodexynucleotide,olgoDToligodexynucleotide,olgoDT），其进入机体，以胞吞），其进入机体，以胞吞方式进入细胞，可直接结合到方式进入细胞，可直接结合到DNADNA双链的特定部位，形成三双链的特定部位，形成三聚体，影响转录因子结合，使转录过程不能启动。聚体，影响转录因子结合，使转录过程不能启动。二二.反义核酸用于基因治疗的基本原理反义核酸用于基因治疗的基本原理基因治疗专题知识讲座7/16/202451二.反义核酸用于基因治疗的基本原理基因治疗专题知识讲座8/11 1）抗肿瘤：）抗肿瘤：就是应用反义核酸在转录和翻译水平就是应用反义核酸在转录和翻译水平阻断某些异常基因的表达，以期阻断瘤细胞内异阻断某些异常基因的表达，以期阻断瘤细胞内异常信号的传导，使瘤细胞进入正常分化轨道或引常信号的传导，使瘤细胞进入正常分化轨道或引起细胞凋亡。起细胞凋亡。2 2）抗病毒：）抗病毒：用反义用反义DNADNA或反义或反义RNARNA阻断阻断DNADNA复制，复制，转录和翻译，从而达到抗病毒目的。转录和翻译，从而达到抗病毒目的。反义核酸在基因治疗中的应用反义核酸在基因治疗中的应用基因治疗专题知识讲座7/16/2024521）抗肿瘤：就是应用反义核酸在转录和翻译水平阻断某些异常基因反义反义RNARNA的应用方法有两种的应用方法有两种 1 1）体外合成反义体外合成反义RNARNA直接作用细胞，细胞吸收后发直接作用细胞，细胞吸收后发挥作用；挥作用；2 2）构建表达质粒，转入细胞，转录出反义构建表达质粒，转入细胞，转录出反义RNARNA发挥发挥作用。作用。三三.反义核酸技术反义核酸技术（一）反义（一）反义RNARNA技术技术意义意义:抑制一些有害基因的表达或失控基因的过度表达抑制一些有害基因的表达或失控基因的过度表达 基因治疗专题知识讲座7/16/202453反义RNA的应用方法有两种 三.反义核酸技术（一）解决的首要问题解决的首要问题:1 1专一性转移问题专一性转移问题 进行基因治疗时，反义进行基因治疗时，反义RNARNA必须专一性转移到病变细胞中必须专一性转移到病变细胞中 2 2反义反义RNARNA进入靶细胞前的降解问题进入靶细胞前的降解问题 反义反义RNARNA抗抗RNaseRNase的能力不强的能力不强 受体介导的反义受体介导的反义RNARNA转移技术是解决上述两个问题的一条十转移技术是解决上述两个问题的一条十分有希望的途径。分有希望的途径。基因治疗专题知识讲座7/16/202454 解决的首要问题:1专一性转移问题 进行基因治 受体介导反义受体介导反义RNARNA转移技术转移技术针对上述针对上述2 2个问题人们设计一种反义个问题人们设计一种反义RNARNA运载工具，如：运载工具，如：ASGP-PL ASGP-PL（脱唾液酸血清类粘蛋白一多聚赖氨酸（脱唾液酸血清类粘蛋白一多聚赖氨酸)，能将反义，能将反义RNARNA运至肝细胞发挥作用；运至肝细胞发挥作用；利用受体介导反义利用受体介导反义RNARNA在抑制在抑制c-mycc-myc和乙肝病毒基和乙肝病毒基因的表达方面有所研究，基本上克服了上述弱点。因的表达方面有所研究，基本上克服了上述弱点。基因治疗专题知识讲座7/16/202455 受体介导反义RNA转移技术针对上述2个问题人们设1 1）安全性高：）安全性高：反义反义RNARNA只针对特异的只针对特异的mRNAmRNA分子，不改变所调节基分子，不改变所调节基因的结构，并且最终在细胞内降解，不留因的结构，并且最终在细胞内降解，不留“残渣残渣”。2 2）设计制备方便：）设计制备方便：设计复盖设计复盖55端的反义端的反义RNARNA可以封帽反应可以封帽反应（mRNAmRNA不能进入核糖体），即可抑制特定基因表达和功能。制备不能进入核糖体），即可抑制特定基因表达和功能。制备也较简单：也较简单：体外转录得到，体外转录得到，利用表达载体在体内转录得到利用表达载体在体内转录得到3 3）具有剂量调节效应；）具有剂量调节效应；4 4）能直接作用某些）能直接作用某些RNARNA病毒；病毒；5 5）发展：）发展：设计设计“抗降解抗降解”RNA”RNA，可以延长反义，可以延长反义RNARNA寿命；设计寿命；设计“反义反义RNA+RNA+核酶核酶”复合功能体、既有复合功能体、既有“封闭封闭”又有又有“切割切割”作用。作用。3.3.应用前景：应用前景：基因治疗专题知识讲座7/16/2024561）安全性高：反义RNA只针对特异的mRNA分子，不改变所调1.1.核酶设计应考虑的因素核酶设计应考虑的因素 核酶由核酶由“两端引导序列两端引导序列+中间保守序列中间保守序列”组成，组成，引导序列取决于靶序列的碱基组成引导序列取决于靶序列的碱基组成,中间保守序列：是酶活性的结构域中间保守序列：是酶活性的结构域,酶活性中心酶活性中心包括结合部位和催化中心，包括结合部位和催化中心，（二）核酶（二）核酶（ribozymeribozyme）技术）技术 核酶两端的引导序列与靶核酶两端的引导序列与靶RNARNA分子的序列互补，分子的序列互补，起着识别和结合底物的作用。起着识别和结合底物的作用。设计的基本原则是核酶分子与靶部位结合后能形设计的基本原则是核酶分子与靶部位结合后能形成酶活性结构域成酶活性结构域 基因治疗专题知识讲座7/16/2024571.核酶设计应考虑的因素（二）核酶（ribozyme）技术 人工设计的核酶人工设计的核酶粗线表示合成的核酸分子粗线表示合成的核酸分子细线表示天然的核酸分子细线表示天然的核酸分子X 表示一致性序列表示一致性序列箭头表示切断点箭头表示切断点基因治疗专题知识讲座7/16/202458人工设计的核酶粗线表示合成的核酸分子基因治疗专题知识讲座8/化学合成：提供序列顺序，由厂家合成、很方便。化学合成：提供序列顺序，由厂家合成、很方便。体外转录体外转录:a:a 据靶序列先合成据靶序列先合成DNADNA双链；双链；b b 将将dsDNAdsDNA克隆到表达载体上；克隆到表达载体上；c c 利用表达载体转录获得核酶。利用表达载体转录获得核酶。2.2.核酶制备：核酶制备：基因治疗专题知识讲座7/16/202459 2.核酶制备：基因治疗专题知识讲座8/15/20235外源导入：借助脂质体包裹导入细胞内。外源导入：借助脂质体包裹导入细胞内。内源导入：借助逆转录病毒表达载体转染。内源导入：借助逆转录病毒表达载体转染。导入细胞的同时，分别导入报告基因与反义表达载导入细胞的同时，分别导入报告基因与反义表达载体（带报告基因）作对照，用以检测载体的表达能力，体（带报告基因）作对照，用以检测载体的表达能力，以区别抑制作用是核酶还是反义以区别抑制作用是核酶还是反义RNA。3.3.核酶导入细胞的两种方法核酶导入细胞的两种方法基因治疗专题知识讲座7/16/202460外源导入：借助脂质体包裹导入细胞内。3.核酶导入细胞的两种方1.1.意义意义:（三）反义基因（三）反义基因(三链三链DNA)DNA)技术技术通过形成三链通过形成三链DNA,DNA,完全抑制特定基因的表达完全抑制特定基因的表达 。三链。三链DNADNA被称为被称为“能够攻击病毒和癌细胞而不损害健康组能够攻击病毒和癌细胞而不损害健康组织织”的新型基因药物。的新型基因药物。2.2.作用机制作用机制:合成的同聚嘌呤或同聚嘧啶脱氧寡核苷酸（合成的同聚嘌呤或同聚嘧啶脱氧寡核苷酸（ODNODN）在一定条件下也可以与双螺旋在一定条件下也可以与双螺旋DNADNA分子中的同聚嘌呤分子中的同聚嘌呤同聚嘧啶区段结合形成局部的分子间三链同聚嘧啶区段结合形成局部的分子间三链DNA,DNA,可干扰可干扰核蛋白因子或聚合酶与核蛋白因子或聚合酶与DNADNA的这一位点结合，因此三链的这一位点结合，因此三链DNADNA能够在转录水平上抑制基因表达。能够在转录水平上抑制基因表达。基因治疗专题知识讲座7/16/2024611.意义:（三）反义基因(三链DNA)技术通过形成三链DNA 3 3、技术关键、技术关键:专一性：专一性：针对靶序列设计高度选择性的反义基因；针对靶序列设计高度选择性的反义基因；稳定性：稳定性：通过化学修饰，使反义基因能抵抗体内核酸通过化学修饰，使反义基因能抵抗体内核酸酶的进攻，延长反义基因的寿命。酶的进攻，延长反义基因的寿命。摄取及分布摄取及分布:直接通过扩散作用进入细胞内，同时还直接通过扩散作用进入细胞内，同时还通过细胞内吞作用入胞通过细胞内吞作用入胞 。ODN ODN的摄取过程是一个依赖的摄取过程是一个依赖于碱基序列长度、活性及饱和的内循环过程。于碱基序列长度、活性及饱和的内循环过程。基因治疗专题知识讲座7/16/202462 3、技术关键:专一性：针对靶序列设计高度选择性 第第 五五 节节基基因因治治疗疗的的应应用用研研究究 基因治疗专题知识讲座7/16/202463 第 五 节基因治疗的应用研究 基因治疗专题知 除外伤性疾病外，所有疾病都是遗传因素（内因）与除外伤性疾病外，所有疾病都是遗传因素（内因）与环境因素（外因）相互作用结果环境因素（外因）相互作用结果。遗传因素起主要作用疾病如：遗传因素起主要作用疾病如：血友病、白化病、苯酮尿血友病、白化病、苯酮尿 症等；症等；环境因素起主要作用疾病如：环境因素起主要作用疾病如：传染病、营养性疾病等；传染病、营养性疾病等；二者都起重要作用疾病如：二者都起重要作用疾病如：糖尿病、高血压、冠心病、糖尿病、高血压、冠心病、肿瘤、精神分裂症等。肿瘤、精神分裂症等。目前发现：单基因病目前发现：单基因病40004000多种，多基因病不少于多种，多基因病不少于10001000种，染色体病种，染色体病100100多种，随着传染病与营养性疾病的多种，随着传染病与营养性疾病的有效控制和科技经济文化的进一步发展，遗传病患病率有有效控制和科技经济文化的进一步发展，遗传病患病率有相对上升趋势。相对上升趋势。基因治疗专题知识讲座7/16/202464 除外伤性疾病外，所有疾病都是遗传因素（内因）与环境（一）（一）3 3个考虑因素和个考虑因素和3 3个困难：个困难：1.31.3个考虑因素：个考虑因素：1 1）对该病有关基因应详尽了解，）对该病有关基因应详尽了解，能在实验中克隆该能在实验中克隆该基因，并能导入真核细胞中表达；基因，并能导入真核细胞中表达；2 2）只需产生较少量原来缺陷基因表达产物就能矫正）只需产生较少量原来缺陷基因表达产物就能矫正疾病；疾病；3 3）即使导入基因过渡表达，对机体也无不良反应。）即使导入基因过渡表达，对机体也无不良反应。一一.遗传病的基因治疗遗传病的基因治疗基因治疗专题知识讲座7/16/202465（一）3个考虑因素和3个困难：一.遗传病的基因治疗基因治疗专2.32.3个困难：个困难：1 1）导入外源基因调控问题）导入外源基因调控问题 导入外源基因（治疗基因）接受体内调控系统的导入外源基因（治疗基因）接受体内调控系统的统一调控，这在目前难以做到，有待进一步研究统一调控，这在目前难以做到，有待进一步研究。2 2）有些遗传病是某些特殊细胞损伤造成的，这些）有些遗传病是某些特殊细胞损伤造成的，这些细胞不易取出供体外基因工程操作用细胞不易取出供体外基因工程操作用3 3）单基因遗传病，缺陷只局限于某一个发病的基因，）单基因遗传病，缺陷只局限于某一个发病的基因，但其造成临床结果往往广泛累及多个脏器但其造成临床结果往往广泛累及多个脏器目前只有几种体细胞适用体外基因治疗目前只有几种体细胞适用体外基因治疗基因治疗专题知识讲座7/16/2024662.3个困难：1）导入外源基因调控问题 导入外源基因（治1.1.腺苷脱氨酶（腺苷脱氨酶（adenosine deaminse,ADAadenosine deaminse,ADA）催化反应）催化反应 腺嘌呤脱氧核苷腺嘌呤脱氧核苷 次黄嘌呤苷次黄嘌呤苷次黄嘌呤次黄嘌呤黄嘌黄嘌呤呤尿酸尿酸(醇式醇式)()(人和猿的终产物人和猿的终产物)2.ADA2.ADA缺陷生化代谢障碍及其临床症状缺陷生化代谢障碍及其临床症状 ADA ADA缺陷缺陷 腺嘌呤核苷酸代谢受阻腺嘌呤核苷酸代谢受阻dATPTdATPT淋巴细淋巴细胞胞DNADNA链不断崩解，同时激活链不断崩解，同时激活DNADNA依赖的依赖的ADP-ADP-核糖聚合酶的活核糖聚合酶的活性性,降低降低NADNAD水平，使蛋白质合成减少细胞死亡，同时也影响水平，使蛋白质合成减少细胞死亡，同时也影响B B细胞功能。细胞功能。ADA ADA缺陷常伴有重症联合免疫缺陷（缺陷常伴有重症联合免疫缺陷（SCIDSCID）症状。）症状。ADA（二）腺苷脱氨酶（二）腺苷脱氨酶（ADAADA）缺陷遗传病的基因治疗）缺陷遗传病的基因治疗基因治疗专题知识讲座7/16/2024671.腺苷脱氨酶（adenosine deaminse,ADA 1 1）单个核细胞的分离）单个核细胞的分离：使