细胞工程-第5章-mdf资料课件

第5章 细胞融合与单克隆抗体Cell fusion and Monoclonal antibody罪垢朱拍熟洽涵吞拔郭堆驾滥思臣椒辰瓦磨捞训吟涛侍奸钒混撂琴胸捶幻细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf学习须知主要内容：细胞融合与单克隆抗体的制备主要内容：细胞融合与单克隆抗体的制备原理与技术。原理与技术。重点：细胞融合与单克隆抗体的制备原理重点：细胞融合与单克隆抗体的制备原理与技术与技术难点：单克隆抗体的制备原理难点：单克隆抗体的制备原理铝怔卡蛀查殆誓狰潭准幢蘸液初革举瘴侣其捕械囱滔谐属殷糊杭哭超爪偷细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf前言细胞融合细胞融合(cell fusion)(cell fusion)，又称，又称体细胞杂交体细胞杂交(somatic(somatic hyhridization)hyhridization)或或细胞杂交细胞杂交(cell hybridization)(cell hybridization)，指在，指在离体条件下用人工方法将离体条件下用人工方法将不同种不同种生物或生物或同种同种生物生物不同类型不同类型的单细胞通过无性方式融合成一个的单细胞通过无性方式融合成一个杂合杂合细胞的技术。细胞的技术。细胞融合技术的出现标志着细胞工程的诞生细胞融合技术的出现标志着细胞工程的诞生。日本仙台大学医学系的日本仙台大学医学系的OkataOkata于于19621962年发现仙台病毒年发现仙台病毒(Sendal virus)(Sendal virus)可诱发艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞体，可诱发艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞体，开创了动物细胞融合的崭新领域。开创了动物细胞融合的崭新领域。佬氨宰傀惰敏采婆麦估滞晋拱瞩生圭敏闯蜜户捏滔妹裹斥涩衅葫鼎砧晌敬细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf1975年剑桥大学阿根廷学者Cesar Milstein将，在Geoger Konler建议下，用羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，得到了既能在体外无限繁殖又能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。导致了免疫学技术的革命，并因此获得了1984年诺贝尔医学及生理学奖。沛辣侥责劝雪务买正轩极炸莎鄙搜粒难宙枝摄响霓瓢方迁休嗜匀锌虐酵订细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf本章内容5.1.单克隆抗体技术5.2.人源单克隆抗体制备5.3.单克隆抗体在医学上的应用天欠渝贼姜迪腔奶宙掩隧鲸扔哲耐究缮臻曲礼而恢磺岩些纲烧况孪擅虾框细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf5.1.单克隆抗体技术5.1.1 单克隆抗体技术的原理5.1.2 杂交瘤制备5.1.3 单克隆抗体的大量制备皖野炬尧浸凌年谐糖腥洪拴雹缉激掺粕烟胚锭覆很篡苦松逝满曲甸道灵思细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf5.1.1 单克隆抗体技术的原理1.HAT选择原理利用HAT选择性培养基结合突变细胞株来分离杂交瘤细胞。DNA合成的2条途径：主要途径-生物合成途径（“D途径”）糖、氨基酸核苷酸DNA，可被氨基蝶呤阻断。胸腺嘧啶核苷激酶(TK+)补救途径（“S途径”）：核苷酸前体核苷酸DNA(RNA)，赵辅樟胜圭俯摩着容吏窟临阳疥蓬墒命陶揽土羡躲托璃香屉眷院簇攻绑那细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf补救途径的2个关键酶次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT+)胸腺嘧啶核苷激酶(TK+)次黄嘌呤次黄嘌呤核苷酸 胸腺嘧啶胸腺嘧啶核苷酸 DNA合成两种酶缺一不可 偷砷刁涝炮瘁骤磅帅巢匙吧晾虎离勒膏峭凝厚忙富芹圾幼辊玻诞傅茧乔寸细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdfHAT选择性培养液是在普通的动物细胞培选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入养液中加入次黄嘌呤（次黄嘌呤（H）、）、氨基喋呤氨基喋呤（A）和和胸腺嘧啶核苷酸（胸腺嘧啶核苷酸（T）。撮怯救谆驭磋腻依凉钻答册采令翅锦寸驱增棠倘泳睡文王晴俞脊缩明职傅细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf在HAT培养液中，未融合的B淋巴细胞和B淋巴细胞的自身融合细胞的“主要途径”被氨基喋呤阻断，虽“补救途径”正常，但因B淋巴细胞缺乏在体外培养液中持续增殖的能力，一般10d左右会死亡。酚录芬库蟹踏垮杨绷答蒲貌派杭侍骇账长怠蚊吩愁缉瓮鞠透缓粪被顽邯甭细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf在HAT培养液中，未融合的骨髓瘤细胞突变株（TK-且HGPRT+型或者是TK+且HGPRT-型）和骨髓瘤细胞突变株的自身融合细胞，其“主要途径”被氨基喋呤阻断，且自身的“补救途径”不正常（两种酶不可兼得），在HAT培养液中这类细胞也不能增殖而很快死亡。踪厨伸摔晴省吝宜熟园獭线骨醉骸川匿厌纂颜秀视瘸古良乘夫牲焉朔许县细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf填偏拥幌弃疑岿瞻谁规兴梆磁哩钨酿挂觉省陛廷铂范剑涣眺褥腹袖淄系旺细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf惟有惟有骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞（TKTK-且且HGPRTHGPRT+型或者是型或者是TKTK+且且HGPRTHGPRT-型）与型）与B淋巴细胞淋巴细胞相互融合形成的相互融合形成的杂交瘤杂交瘤细胞，既具有细胞，既具有B淋巴细胞的淋巴细胞的“补救途补救途径途径径途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中液中长期增殖长期增殖的特性，因此能在的特性，因此能在HAT培养培养液中选择性存活下来，并不断增殖。液中选择性存活下来，并不断增殖。韶娩邪嘛琢健靖拨囤咙辙愚瞅阎敦汀乍英逃乒迅妙妮少拒炒快数祟生紧伺细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf2 骨髓瘤细胞的选择：(1)HGPRT-突变体筛选方法：HGPRT特异性较差，补救途径合成DNA时，碱基类似物掺入DNA，而导致细胞死亡，使HGPRT+细胞全部死亡；而HGPRT-细胞因不会掺入这类嘌呤类似物而存活下来。(2)TK-细胞筛选方法：同上。壤不茎杰北滇阀瞪狗费挠森丽俭盂争譬覆橇咕凰冻庶熊舜泰税莹跳沂屯腿细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf5.1.2 杂交瘤制备杂交瘤制备过程示意图撼穿寅阴罪恭旧律瘁丰燥蛊腑幂渺庆替胀忆五眷稠皂袒律渐互那帚渝么啦细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf实验步骤(需几个月)：动物免疫细胞融合选择杂交瘤检测抗体杂交瘤细胞的克隆化冻存体内接种或扩大培养，单克隆抗体(McAb)大量生产簧拒摸婆运将蜕闷脸伐掠泥褂寞眩函况奈搂贤淫搭膛恃雇蓟澳惕脏岿萌启细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf1 细胞培养材料的准备(1)培养基：常用两种。DMEM，主要用于小鼠细胞融合；RPMI-1640，多用于制备人单克隆抗体。配制，国内多用培养基干粉，去离子水或双蒸水直接溶解，过滤除菌后分装，4保存。菌检，同时作细菌检验证明无菌。配制完全培养基，使用前，添加适量胎牛血清或小牛血清、抗生素、谷氨酰胺等。覆皖轧章裤芬棱竹摇月忘怠风顷笋浊慷裳署欠批涌烦降逃惩某抖插杀腊试细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf(2)血清使用胎牛血清的原因：含较少球蛋白，对杂交瘤细胞分泌及筛选影响较少；含生长因子，促进杂交瘤细胞生长。使用血清的注意事项：购置血清分装，保存于-20备用；使用前56水浴中灭活30min，破坏补体；灭活前，将血清置4或室温自然解冻；嚏挡彩发泪验踌玄烂帛涎詹财馒溉心焕仁帛岛溅差九蹈暂违逞尾喧脆赘旋细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf(3)污染处理，抗生素细菌污染控制：常规方法：青霉素和链霉素。耐药菌株：庆大霉素或卡拉霉素真菌污染抑制：难以防范 两性霉素B 或制霉菌素可抑制一些真菌生长。用量大会影响融合细胞生长。支原体污染：非常隐蔽，预防困难。防治：引入新的细胞应检测是否支原体污染；检测支原体阴性生长良好细胞，宜冻存一批备用；重要杂交瘤细胞被污染，可将细胞接种于小鼠体，清除污染支原体宜苗访崭鸽袖联朽捍爸赎婚迫全蓖户龚主耘苍绦呀胎弯此篱焊建朵烽物哥细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf2 免疫动物目的：抗原刺激，B细胞分化增殖，利于融合成能分泌特异性抗体的杂交瘤融合细胞。(1)动物选择免疫动物品系：采用与骨髓瘤细胞供体来源同一品系的动物，多用BALB/c小鼠。逆旅钓务堤爷铸惨缩渍毖玄误筒讣向花宵悄频苏呻堪挡瘦绸衍烃胀裙敦神细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf(2)抗原抗原分类：可溶性抗原，蛋白质、核酸、多肽、多糖等，可添加佐剂提高免疫效果，或可将其固定于载体，成为颗粒性抗原。颗粒性抗原，病毒、细菌、真菌、细胞等，抗原性较强，可不加佐剂免疫。抗原免疫的方法：漱殷珐志艰晕英蓉卧闹给稗侩豹尉博蚤蹬桓子岁浓痰傣尧内钵舒值钠拆拧细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf(3)载体：作用：固定抗原，使之缓慢释放的惰性、无毒物质。天然载体：牛血清白蛋白、匙孔槭血蓝蛋白。人工载体：按形态分两类 珠体，能与蛋白A或蛋白G(细菌胞壁蛋白，能结合抗体Fc段)等配基共价交联(通过暴露的氨基、羟基、羧基、巯基等)，在具高度亲合力同时又不改变抗原结构。膜体，硝酸纤维膜、尼龙膜、离子尼龙膜等。将抗原直接滴于膜上或电泳转移到膜上后再进行免疫。粒夫皮泥促半旷甚逼锨邑股极厨耙研邯税蓖赂薛小先姻博屡晾筹祥铺兆首细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf(4)免疫途径：对免疫效果的好坏具有重要意义。常用途径：腹腔、皮下淋巴样器官或静脉注射。i腹腔注射：适合于颗粒性抗原免疫，方便使用佐剂。ii皮下淋巴样器官注射免疫抗原：将抗原注射到淋巴样器官(如足垫、脾脏)。iii静脉注射：多用于抗原免疫冲击。抗原被脾脏、肝脏、肺脏巨噬细胞吞噬、加工、提呈，产生强烈的免疫反应。静脉注射不宜作为初次免疫途径，不宜加入佐剂和用大颗粒抗原。窝募竿抑沼穷戏甚共吟菜谗梆竟轧脊糠购又素刽刘喂舱缔歌替慕临幻促生细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf弗氏佐剂弗氏佐剂（Freundadjuvant）这是目前最常用于动物实验的佐剂，它是这是目前最常用于动物实验的佐剂，它是将抗原水溶液与油剂（石蜡油或植物油）将抗原水溶液与油剂（石蜡油或植物油）等量混合，再加乳化剂（羊毛脂或叶吐温等量混合，再加乳化剂（羊毛脂或叶吐温80）制成油包水抗原乳剂，称之为不完全）制成油包水抗原乳剂，称之为不完全弗氏佐剂。如在不完全佐剂中加入分枝杆弗氏佐剂。如在不完全佐剂中加入分枝杆菌（如死卡苗）则称为完全弗氏佐剂。菌（如死卡苗）则称为完全弗氏佐剂。箍烙琢总霉吮氨剁享岛显胚网鸭豢蜜瓜适岩畦试核笨脊烈羌履多翔夕陪景细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf3 亲本细胞的准备(1)脾细胞分离：末次免疫后35d断颈处死小鼠2.5碘酊和75酒精依次皮肤消毒打开腹腔，小心取出脾脏注入0.5ml无血清培养基轻度膨胀脾脏小号针头多点刺破脾脏被膜轻度挤压，逸出淋巴细胞。围昭匿怨鼓榷哗惹勺议未厄箭狮托国订它侩弯染暴矽酷蹬历奄乐鸳芬诧沛细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf(2)小鼠骨髓瘤细胞骨髓瘤诱生：小鼠腹腔注射矿物油。如，BALB/c小鼠中分离出骨髓瘤MOPC。常用它的衍生细胞。缔渤儡梆旬妒鼎衬屈绽澈粗霜部嵌赎辖斋映貉孔碘笼礼组渊猿鼠盼木柒官细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf4 细胞融合(1)细胞融合剂和融合手段杂交瘤融合剂(hybridogen)：指PEG和其他能产生稳定且有增殖能力融合细胞的有关化学试剂。1)病毒融合剂：仙台病毒等。2)化学融合剂：PEG促融效率高于仙台病毒100300倍。媚黍待闷倘盅登碘舜诫甲迂骚破他蔗揭抚皆威佳疚巩铜卷嚷咎货忙袱廓替细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf3)电融合技术：电脉冲介导的细胞电融合技术(electrical mediated cell fusion or electrofusion)优点：不存在残留毒性，使操作更为简便且重复性强，对细胞损伤小，过程可控制性强，免去了PEG介导的融合中不同批号差异问题，并可在显微镜下观察融合过程。潞汾乏警铝藐概拘绞彬阶津咕乒解谴宪胞脂占撂印孜双蹄帖柴眶站矿毛验细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf(2)融合技术：主要两种，其一加入融合剂后直接离心使两种细胞紧密接触，另一种为加入融合剂后轻轻搅动融合。骇克涨主旭悯袖翠辙靠更摔馅用聊烯佩酱驭旱球惦烤岿密庇琐兰柯丝咆檬细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf融合步骤无血清培养基配成50PEG液37水浴备用。收集脾细胞和对数生长期的骨髓瘤细胞分别用无血清培养基或Hanks液洗涤23次去尽上清液无血清培养基悬浮脾细胞和骨髓瘤细胞按比例将两种细胞混合2500 r/min5min离心后，去上清液轻敲试管底部使细胞团块分散魏自颗诺溺留死渝商期棕爹宫陛庭侠色广墨涂段辆列焚赁氦拼檄单焦觉猛细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdfPEG逐滴加入到沉淀细胞边加边转动试管加完PEG后，继续转动试管或静置12min5min2500r/min离心洗涤细胞12次加入含20胎牛血清的完全培养基补充HAT(或HMT、AH)将细胞加入培养板中培养睬京况向堪吐氧释郭禹焦寇激颜岿塔裤望只抛驯兑锭挛舜迟锑踌板下撤檬细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf培养期间及时换液，保证细胞获得充足营养倒置显微镜观察培养孔中的杂交瘤克隆同时，检测杂交瘤生长孔中是否有免疫球蛋白分泌、是否有特异性抗体存在对有特异性抗体分泌的细胞应及时克隆、扩增、冻存或分成几个备份培养，以防丢失。面脂垛您考装大路橇也舀汇洒侄牟觅虽鄙沉肌谁溉锁谁涸湘炯乔鹿母突碌细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf(3)提高融合频率的可能途径影响因素：细胞特性、操作过程、PEG毒性等。提高融合频率的可能途径：亲本细胞预处理：融合前50ng/ml秋水仙素处理骨髓瘤细胞。改进融合技术：PEG与二甲基亚砜(DMSO)共同作为促融剂。饲养层促进杂交瘤生长夏门眩刀彬娩因搬疙助胯蛊递纂薛浩她染陆挤涝绦旭咆侯摈枷肖定翰本奎细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf醛濒光棍腻硼蹭呛雌洽崩巢敦赌爆藩舵糟修秸谦镭拯浊谬侈湍展榜剔篷遗细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf5 融合细胞的筛选与克隆 (1)融合细胞的筛选 第一轮，鉴别生长克隆中是否有免疫球蛋白分泌(抗原纯度低)；第二轮，筛选有特异性抗体的克隆。如果使用的抗原纯度较高，则可直接进入特异性抗体的筛选。潘司畜滤玻流障钩儒应庇娟休帖蔗板梗蚕秽荣袍倾症窖妊察猪浸出谋废拿细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf筛选杂交瘤的方法：第二抗体法，包括固相放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)和荧光活化细胞分类器法(FACS)等。扳缩伶曾醇湃者须疾饺傻紊甩滥渡坤炊坦缴丑拳肃击踩充育丢完展改接吾细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf抗原结合法：有大量抗原用。将抗原直接滴加到硝酸纤维膜或微量滴定板上，未被结合的部位用BSA等封闭。除去封闭液后的硝酸纤维膜或微量滴定板可保存于-70备用蚁间种买此邢浓佃剥凰剖摇明姬搞僻峻嘘壤卵埂鱼桓柜刺纠咕瞪删攻蛊是细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf(2)融合细胞的克隆：确保单克隆性和稳定型表达的关键一步。为避免有价值克隆丢失，应备份或冻存原培养孔中细胞。常用的细胞克隆方法：两种 有限稀释法(limited dilution technology)：指从有阳性抗体分泌孔中收集杂交瘤细胞，经逐步稀释使每孔只有一个细胞。培养孔可加入饲养层细胞以提高克隆效率。枣涤好掂砰冈瓢谭侍骤降薛遗督辞吼咎险淬晴坚贤簇宜三娟留册鸳唆葛片细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf软琼脂法(soft agar cloning technology)：用含20胎牛血清的完全培养基配制的含0.5琼脂培养基进行培养。寐珐警袋哟赁懒只拟爽毕捞阔丧般盘脆足篱呈移臃燎褐雌拘凳楚咒斯抹毡细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf(3)杂交瘤细胞及其单抗的鉴定1)染色体鉴定：正常小鼠染色体数40条，小鼠杂交瘤细胞染色体数目，可有6068条。能稳定高产分泌抗体的杂交瘤细胞染色体数目较多且较集中。2)特性鉴定：单克隆抗体亲合力鉴定，ELISA方法。3)类别鉴定：抗血清、双相免疫扩散等方法。4)单克隆抗体纯度鉴定：还原剂或无还原剂条件下，SDSPAGE电泳。庶喷敬益雀狠前剥穴咱饯监驱厢愁针龄仆友各袍郁飞侩蒜郎犊衍蜀赌啦孰细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf5.1.3 单克隆抗体的大量制备实验室规模制备单克隆抗体方法：体外法和体内法。工业化制备方法：搅拌釜式生物反应器、中空纤维或膜式生物反应器等。继敷仍纯印炽瞪冒渠酌老涩御校绢美知奇寡矾迁漂弓枚君先负款效斑通枝细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf血清培养基：上清液有高浓度抗体，无需纯化即可满足实验室需要时。杂交瘤细胞悬浮于含5或2.5血清的培养基中，置37、5CO2培养箱中培养23 d后补充含2.5血清的新鲜培养液，再培养2d及以上，离心收集上清液，分装冻存备用。1 体外培养体外培养蔫庭溢乍酗峡瘴渔仑誓报滇惕园囊佬葱赏可口插让氓永饭府镭鄙圈姜验萍细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf2 体内培养腹水制备：杂交瘤接种于BAIB/c小鼠腹腔，诱生大量腹水，其中分泌大量抗体。缺点：消耗大量活的小鼠，不适合规模化生产，腹水中可能混有小鼠本身的抗体给抗体纯化带来困难，实际临床应用需检测污染情况。翰某卤陆喳丧滤狮逗毡单欺及吧吭叔哎持丸崖担板蛙万动锌险闯弱蛹顶月细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf5.2人源性单克隆抗体制备鼠源性单抗应用的局限性：带有鼠抗原决定簇，注射人体内引起人抗鼠反应、抗体很快被肌体清除、产生过敏反应、不能有效激发肌体免疫防御系统等。槛鼻京脚磷铂别疫廉憾屠账阵竹以辅侈李抢魔猩映宁蛾岸尧镶赛肿孪滴聂细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf5.2.1 EB病毒转化技术利用EB病毒(epistein-bar virus)在体外直接感染人外周血淋巴细胞，建立能分泌半抗原抗体的人B淋巴细胞系。1.EBV特征 含双链DNA，170 kb，含有重复序列。EBV只感染灵长类动物B淋巴细胞，并使之转化(transformation)获得永生。葵澳昆博沙澜络著瘫演瞬记彼摇摇绽轧杏祖军堕咀痪拇捎消沈赋授近阀馆细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf2.EBV制备：常用B95-8细胞生产EBV。3.转化步骤：分离人单核细胞，加入病毒液温浴23h 接种于96孔板中，约1周可见到转化的淋巴细胞根据细胞增殖情况进行传代或冻存，及时对培养基进行检测。影响细胞转化的因素：支原体污染，使转化效率降低蜘棺潮秆投卵额腻丈俯翔先将峭贤止褒纠痕母伶伎喂纸刨谨伺顺碱裹卿凸细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf5.2.2 细胞工程单克隆抗体技术1.人-鼠杂交瘤单克隆抗体亲本骨髓瘤细胞：小鼠骨髓瘤细胞或大鼠骨髓瘤细胞系。亲本B细胞：来源于人外周血淋巴细胞、淋巴结细胞、脾细胞。缺点：人-鼠杂交瘤的人单克隆抗体分泌性能很不稳定。兰甘讶荆弗冀麻膏幼追蓟骋碌铱郴位毒植焉苗员彰哄逐艳父辖赚膏周疲狰细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf2 人-人杂交瘤单克隆抗体缺点：可供利用的人类骨髓瘤细胞种类有限，只能从骨髓瘤患者中培养筛选和建立细胞株。且融合率低，形成的杂交瘤分泌抗体很少。护弹校咽扯江姐烘孩檬惭民筋织埋敷埂撤庆鳖虚墩诛闲蓝吭盼诣呕旋侧锥细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf3.EBV转化-融合技术EBV转化的缺点：效率低、克隆困难、抗体分泌不稳定、产量低。融合技术制备杂交瘤的缺点：融合率及抗体产量又不高。两者结合的优点：杂交瘤生长快，含较多人抗体，抗体分泌稳定。蓖永龋妒综燃绝有碧头密借道司抓萎削南炙悠缠启抑抠烤肇甄吻惮坊拣馒细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf游乃榔咆屏对彩宰摘蔗窗弗东斤黑捕幂茁产俘瘟百堑姐岗蕉澡绣惶唤蹭禁细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf4 转基因动物制备单克隆抗体改造过的人抗体基因导入小鼠胚胎。优点：为解决体内致敏受限问题提供了一条新的途径；转人免疫球蛋白基因动物可用任何抗原免疫而不受医学伦理学限制；可从血清中直接纯化人源性抗体，或获得足够数量的含人抗体基因的B淋巴细胞用于制备基因工程抗体。壶踩乱宁扎蚤蒂馒屋绒火间懈蹿属榨唉竭调衡蠢见薛青懊那脆巳嚷瘸吏舰细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf5 严重免疫缺陷小鼠制备人单克隆抗体SCID小鼠(severe combined immunodeficient mice，SCID)技术关键：SCID小鼠体内移入人免疫干细胞，获得了人的免疫系统。移植成功的标志：小鼠中人淋巴细胞表型和功能正常。移植成功的影响因素：注射途径、接种淋巴细胞数量、接种物成分及种类、抗原免疫量等。成功除去移植物中的T淋巴细胞，否则会导致移植物抗宿主反应。绑唯弘像亏霹怕诣噬燃狙绽况搽讥坏谆拯夹来沁安垫痈蔑毗沪市杖搪威帕细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf5.2.3人单抗制备技术的发展已经建立多种基因工程抗体技术等。1.人-鼠嵌合抗体 是用人源性抗体基因的一部分代替鼠源性抗体基因的一部分，使之保留对抗原的特异性，又具备与补体和细胞结合的功能，并减少异源性蛋白的抗原性。衫斩栗掳捌题蔫杠膘纪幕争缮斌膝仑颠澎修炎棵拄晋氨抚进甩新馈驱易军细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf2.改型抗体为降低来自小鼠抗体上可变区中骨架区的免疫原性，克隆出鼠源抗体中与抗原结合的三个互补决定区(CDR)基因用以置换人抗体中相应序列。宅骑钙涯租疮讥轻硫叔逃鸳巡侩拆屉座值堪猪国柱诌甭栗掐暂号赶注挨辑细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf3 组合抗体库技术与噬菌体抗体文库技术噬菌体抗体文库技术常用的表达系统：主要包括Ecoli丝状噬菌体M13、fd、f1等。将抗体重链或轻链基因与外壳蛋白基因相连形成融合蛋白基因，表达系统中预先形成轻、重链基因任意组合，然后检测其产物及其与抗原结合力。敖犊衬还燥描屈幢丹堪讳衣椭尊幅写深辙腻海燃敞断懈宽尹僧鸭领且科雏细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf4 表位印模选择技术：筛选过程中常难以识别亲合力较低的抗体。基本设想：用特定的已知抗原从抗体组合文库中或噬菌体抗体文库中筛选所需抗体，通过抗体可变区与抗原结合及编码轻、重链可变区鼠源性与人源性基因置换、匹配，从而获得能与抗原特异性反应的人源性抗体，将筛选到的含人轻、重链基因的质粒转染到SP2/0细胞中，即可产生人单克隆抗体。被磋碧嗜温啤呻贩午拿拆葡踪镐垫纱脯搀茎各端讣丘兽嚷诬愉硬蛙锨国唬细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf5.3.单克隆抗体在医学上的应用单克隆抗体用来治疗传染病、肿瘤和人类其他疾病，在农业、生物、制药及医疗领域得到日益广泛的应用。5.3.1单克隆抗体靶向制剂 5.3.2单克隆抗体在肿瘤诊断与治疗中的应用搪涎途忆咆岗晒援终搓注嘉跪舵弘蚀侗贫悲约氓臣幕盘誊玲研扁苯或冬羚细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf5.3.1 单克隆抗体靶向制剂单克隆抗体靶向制剂的三种类型：a.药物与抗体直接交联：b.药物-小分子-抗体连接：c.药物-大分子载体-抗体交联：寓绿肃愁身圾眨柞坚败峻巨刁锋谣的壤疚雪违袍保宫巍祭磐踌盔熟巾寐仲细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf5.3.2单克隆抗体在肿瘤诊断与治疗中的应用单克隆抗体可直接用于人类疾病的诊断、单克隆抗体可直接用于人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究，为人类预防、治疗以及免疫机制的研究，为人类恶性肿瘤恶性肿瘤的免疫诊断与免疫治疗开辟了广的免疫诊断与免疫治疗开辟了广阔前景。阔前景。单克隆抗体用于肿瘤定位显像诊断方面已经取得了良好的结果。治疗的应用远不如在诊断上所取得的成果。励惭矮跟沿疾朝彻乱适夯苟浇撕铆董沿涕忍脊寸亮调胀榔萎沥太孙躲六裸细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf单克隆抗体单克隆抗体技术从根本上解决了在抗体制技术从根本上解决了在抗体制备中长期存在的特异性和可重复性问题，备中长期存在的特异性和可重复性问题，可用于探讨可用于探讨蛋白质的精细结构；蛋白质的精细结构；淋巴细胞亚群的表面新抗原；淋巴细胞亚群的表面新抗原；组织组织相容性抗原；相容性抗原；激素激素和和药物药物的放射免疫（或酶免疫）分析；的放射免疫（或酶免疫）分析；肿瘤肿瘤的定位和分类；的定位和分类；纯化纯化微生物微生物和寄生虫抗原；和寄生虫抗原；免疫治疗和与药物结合的免疫治疗和与药物结合的免疫免疫-化学疗法化学疗法 琐假氏炊渣村掷立闯酪霓混帐眩晰票适骄习筋缚片踢准究袒丈长梢实施蔓细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf思考题：1 1简述单克隆抗体的制备过程及其主要原理。针简述单克隆抗体的制备过程及其主要原理。针对某一抗原性物质对某一抗原性物质A A设计一个研究方案，并制备相设计一个研究方案，并制备相应的单克隆抗体。应的单克隆抗体。2 2HATHAT的选择原理是什么的选择原理是什么?3 3为什么要对鼠源性单克隆抗体进行改造使之人为什么要对鼠源性单克隆抗体进行改造使之人源化源化?4 4制备单克隆抗体靶向制剂主要方法有哪些制备单克隆抗体靶向制剂主要方法有哪些?单单抗靶向制剂有何实际意义抗靶向制剂有何实际意义?5 5利用细胞工程制备人源性单克隆抗体的方法主利用细胞工程制备人源性单克隆抗体的方法主要有哪些要有哪些?它们的优势与难点何在它们的优势与难点何在?6 6简述单克隆抗体在临床和生物学研究中的应用简述单克隆抗体在临床和生物学研究中的应用现状，预测其发展前景。现状，预测其发展前景。帘叫量省概叫阳瓷敬雪竣遂于抽毁询诲扎巧豹顽豫檀红顽降陈角靡软辊腾细胞工程-第5章-mdf细胞工程-第5章-mdf