细胞工程-7-细胞培养的基本概念及培养细胞的生物学特征课件

细胞培养的基本概念及培养细胞的生物学特征纲要一、细胞培养发展简史二、细胞培养的优点、作用及限制三、细胞培养的基本概念和名词四、体外培养细胞的分型五、体外培养细胞的生长特点六、培养细胞的生长与增殖过程七、体外培养细胞的生物学特点动物的细胞和组织培养是从动物体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术。动物细胞与组织培养是动物细胞工程的重要技术基础，细胞融合、组织工程、胚胎工程、动物克隆等都离不开细胞培养。动物细胞（组织）培养技术起源于动物细胞（组织）培养技术起源于18851885年，德国人年，德国人Roux Roux 用温生理盐水在体外培养鸡胚髓板，并使之存用温生理盐水在体外培养鸡胚髓板，并使之存活了数月之久。活了数月之久。动物细胞（组织）培养的奠基人是美国生物学家动物细胞（组织）培养的奠基人是美国生物学家HarrisonHarrison。在。在19071907年采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴年采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，保持存培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，保持存活了几周时间，并观察到细胞突起的生长过程。活了几周时间，并观察到细胞突起的生长过程。Harrison-isolated pieces of frog embryonic tissue known to give rise to nerve fibres-grew them in frog lymph-observed outgrowth of axons over period of weeks in 1907.一、细胞培养发展简史 法国学者法国学者Carrel功不可没。他功不可没。他1923年设计的卡年设计的卡氏培养瓶，用鸡胚抽提液培养心肌组织取得成功氏培养瓶，用鸡胚抽提液培养心肌组织取得成功并维持并维持34年之久年之久,特别注意到实验中的无菌操作。特别注意到实验中的无菌操作。1957年年Dulbecco 实验室采用胰蛋白酶消化处实验室采用胰蛋白酶消化处理，使成块的组织分散成单个细胞，进行悬浮培理，使成块的组织分散成单个细胞，进行悬浮培养，从而开创了细胞培养技术。养，从而开创了细胞培养技术。一、细胞培养发展简史二、细胞培养的优点、作用及限制1，其培养对象是有生命的。只要培养条件控制得合适，可长时间保持细胞活力，并能长期地观察、监控、检测活细胞的形态结构和生命活动，可用于细胞学、遗传学、免疫学、肿瘤学、病毒学、实验医学的研究。2，研究的条件可人为地控制。培养过程中可根据需要施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行研究、观察；可用于药理学、毒理学等学科的研究工作。3，体外培养的细胞可采用各种技术和方法，如摄影、原子力显微镜、激光共聚焦显微成像技术等来观察、检测和记录，直接观察活细胞的变化，分析细胞的超微结构，检测细胞内物质的合成、代谢的变化等。4，研究的范围广范。培养的细胞来源很多，从低等生物到哺乳动物及人类，从胚胎到成体，从正常组织到肿瘤细胞。5，由于细胞培养有可能在同一时期、相同条件、相似性状的条件下提供大量的实验样本，所以相对耗资较少，因而也就成为生物制品、单克隆抗体和基因工程制品生产的重要手段。6，细胞和组织生长在人工培养环境中，与体内环境相比仍然存在一定的差异，培养的细胞或组织，其形态或功能会发生不同程度的改变。因此再利用培养细胞做实验对象时，不能将其与体内细胞完全一样看待，只能把它们视作一种既保持动物体内原细胞一定的性状、结构和功能又发生某些改变的特定的细胞群体。三、细胞培养的基本概念和名词1)初代培养初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次培养。当细胞持续繁殖一段时间达到一定的细胞密度后，将细胞分离到新的培养器皿并补充新的培养液进行培养。2)传代培养 3）细胞系 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。三、细胞培养的基本概念和名词4)细胞株(cell strain)从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（Substrain）。同一细胞株的细胞一般应具有共同特性或分化标志。三、细胞培养的基本概念和名词5)克隆（Clone）或称细胞克隆，无性繁殖系。系单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体。一个克隆中的细胞在遗传特性上不一定是均质的。三、细胞培养的基本概念和名词6)二倍体细胞 细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75或80以上）的细胞群，称二倍体细胞培养。如仅数目相同，而核型不同的即染色体形态有改变者为假二倍体。二倍体细胞在正常情况下具有限生命期，故属有限细胞系。三、细胞培养的基本概念和名词7）遗传缺陷细胞 从有先天遗传缺陷者取材（主要为成纤维细胞）培养的细胞，或用人工方法诱发突变的细胞，都属遗传缺欠细胞。这类细胞可能具有二倍体核型，也可呈异倍体。三、细胞培养的基本概念和名词8）肿瘤细胞系或株 这是现有细胞系中最多的一类，我国已建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体接种致瘤性。三、细胞培养的基本概念和名词四、体外培养细胞的分型根据离体细胞在体外生长时是否贴壁的性质，将其分为贴壁型贴壁型与悬浮型悬浮型两类正常体内组织细胞类型正常体内组织细胞类型贴壁型贴壁型(anchorage-dependentcell)按照培养细胞的主要形态，按照培养细胞的主要形态，可分为可分为几大类型几大类型1)成纤维细胞型（fibroblast）2)上皮细胞型（epithelium）3)游走细胞型（wandering）4)多形型细胞（polymorphic）四、体外培养细胞的分型1)1)成纤维细胞型：成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。四、体外培养细胞的分型名称：名称：凡在凡在培养中形态与成纤维细胞类似培养中形态与成纤维细胞类似的的来源：来源：由由中胚层间充质组织起源中胚层间充质组织起源的组织如：的组织如：真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细 胞胞,血管内皮血管内皮形态：形态：似体内成纤维细胞似体内成纤维细胞的形态，的形态，胞体梭形胞体梭形或不规或不规 则三角形，胞质向外伸出则三角形，胞质向外伸出2 23 3个个长短不等的长短不等的 突起突起，中有卵圆形核中有卵圆形核生长特点：生长特点：排列成放射状，漩涡状排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成并不紧靠连成 片片，细胞，细胞细胞接触易断开而细胞接触易断开而单独行动单独行动，游，游 离的离的单独的单独的成纤维样细胞，常有几个成纤维样细胞，常有几个伸长的伸长的 细胞突起细胞突起成纤维细胞成纤维细胞2)2)上皮型细胞：上皮型细胞：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。四、体外培养细胞的分型名称：名称：仅形态上似体内仅形态上似体内，实际上不完全相同，实际上不完全相同来源：来源：来源于外胚层来源于外胚层、内胚层细胞、内胚层细胞,如如:皮肤皮肤 及其衍生物，及其衍生物，消化道，乳腺，肺泡，消化道，乳腺，肺泡，上皮性肿瘤上皮性肿瘤形态：形态：类似类似体内的体内的上皮细胞上皮细胞，扁平扁平，不规则不规则 多角形多角形，中有圆形核，中有圆形核 生长特点：生长特点：易相连易相连成片成片，相靠，相靠紧密相连紧密相连成成 薄层薄层铺石状生长铺石状生长-呈呈膜状膜状移动，移动，很少很少 脱离细胞群而脱离细胞群而单个活动单个活动上皮型细胞上皮型细胞3 3）游走细胞型：）游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。稳定，有时难以和其他细胞相区别。4 4）多型细胞型：）多型细胞型：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。定的形态，可统归于此类。能够影响细胞形态学特征的主要因素包括：能够影响细胞形态学特征的主要因素包括：血清成分、培养基成分及添加成分、培养血清成分、培养基成分及添加成分、培养基的酸碱度、气相环境、温度基的酸碱度、气相环境、温度等。例如，等。例如，一些已分化的细胞在有无血清的培养液中一些已分化的细胞在有无血清的培养液中生长，形态特征就会有所差异。生长，形态特征就会有所差异。形态会因条件而改变（来源、生长条件和形态会因条件而改变（来源、生长条件和功能状态不同）。功能状态不同）。影响细胞形态的因素影响细胞形态的因素悬浮型（suspendcell）见于少数特殊的细胞，如血液中的淋巴细胞、白细胞、某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。四、体外培养细胞的分型概念：概念：培养时培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源：来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞,癌癌 肿细胞肿细胞特点：特点：在在悬浮中生长良好悬浮中生长良好,细胞细胞圆形圆形，单个或，单个或 小细胞团小细胞团优点：优点：生存空间大，生存空间大，提供数量大，传代方便提供数量大，传代方便 (不需消化不需消化)，易于收获，易于收获，可获得稳定状态，可获得稳定状态，密密 度一般都较高，培养的效率也高、操作也容易。度一般都较高，培养的效率也高、操作也容易。这种方法有多方面的优越性，易于大规模生这种方法有多方面的优越性，易于大规模生 产，便于过程的控制。产，便于过程的控制。缺点：缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长观察不方便，很多细胞不能悬浮生长 (尤以正常细胞尤以正常细胞)细胞系名称细胞类型来源3T3成纤维细胞小鼠HeLa宫颈癌上皮细胞HenriettaLacksBHK21成纤维细胞叙利亚仓鼠PtKl上皮细胞袋鼠L6成肌细胞大鼠PCI2嗜铬细胞大鼠SP2浆细胞小鼠SP20骨髓瘤浆细胞小鼠CHO卵巢细胞中国地鼠表三、实验室中常用的几种细胞系HenriettaLacks,Americanblack,diedofcancerofuterinecervixin1951五、体外培养细胞的生长特点（一）贴附（二）接触抑制（三）密度抑制粘附粘附:是大多数有机体是大多数有机体细胞细胞在体内在体内生存生存和和生生长长 发育发育的的基本存在方式。基本存在方式。结果结果:基于粘附特性，使细胞与细胞之间相基于粘附特性，使细胞与细胞之间相 互结合形成组织，有机体的绝大多数互结合形成组织，有机体的绝大多数 细胞必须细胞必须附附于一于一固相表面固相表面才能才能生存生存和和 生长生长。（一）贴附五、体外培养细胞的生长特点培养时培养时：这些细胞被放到体外环境中以后：这些细胞被放到体外环境中以后,同同样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，因而因而属于粘附型细胞。属于粘附型细胞。粘附粘附(锚定或锚着锚定或锚着)依赖型依赖型(性性)细胞：唯有粘细胞：唯有粘附于固相表面才能生存的细胞。附于固相表面才能生存的细胞。五、体外培养细胞的生长特点（一）贴附 细胞在体内、外细胞在体内、外的的粘附粘附方式方式存在差异。存在差异。体内：体内：粘附粘附是是全方位全方位,外形外形具有具有复杂的立复杂的立 体特征体特征 体外：体外：多数情况，细胞只有多数情况，细胞只有一个附着平面一个附着平面,外形外形一般一般与体内时明显不同与体内时明显不同（一）贴附五、体外培养细胞的生长特点影响贴附和伸展的因素离子的作用机械及物理因素生物因素五、体外培养细胞的生长特点（一）贴附（二)接触抑制（contactinhibition）Contact inhibitionWhen cells contact each other,they cease their growth.Cells arrest in G0 phase of the cell cycle.Transformed cells will continue to proliferate and pile up each other.五、体外培养细胞的生长特点（三）密度抑制（densityinhibition）细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，但只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂,数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢物增多时，细胞因营养枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制，导致细胞分裂停止。五、体外培养细胞的生长特点