细胞工程--课件

第十九章 细胞工程1ppt课件第十九章 细胞工程第一节、细胞工程的研究范围第二节、细胞工程的主要技术第三节、细胞工程技术在医学 生物中的应用2ppt课件第一节 细胞工程的研究范围 概念：细胞工程（cell engineering）是应用细胞生物学和分子生物学技术，按照预定的设计改变或创造细胞遗传物质，使之获得新的遗传性状，通过体外培养，提供细胞产品或培育出新的品种，甚至新的物种。发展：细胞工程随着细胞生物学、分子生物学、细胞遗传学以及细胞融合、细胞培养技术等方面的进步而迅速发展，已成为生物工程（包括遗传工程、细胞工程、微生物工程、蛋白质工程和酶工程等）的主题之一。研究领域：涉及动物、植物、医药、食品、农业等各个方面。研究层次：根据预定的设计，可以从不同层次将细胞加以改造，如：细胞水平、核质水平、染色体水平、基因水平等。因而可将细胞工程分为基因工程、染色体工程、染色体组工程、细胞质工程、细胞融合工程以及新兴的组织工程。3ppt课件第一节 细胞工程的研究范围一、基因工程在医学方面的成就及展望二、染色体工程三、染色体组工程四、细胞质工程五、细胞并合工程六、组织工程的进展及生物医学方面的应用4ppt课件一、基因工程在医学方面的成就及展望 起源：1973年，美国加州大学和斯坦福大学的生物学家Stanley Cohen 和Herbert Boyer 首次在试管内将大肠杆菌的两种不同质粒DNA片段连接在一起，造成DNA的重组，然后将重组的DNA转入大肠杆菌细胞，结果这个重组的DNA分子在大肠杆菌内能自我复制并表达出两亲本质粒的遗传信息。这个分子水平上的人工杂交立即引起轰动，引发了世界范围的基因工程热。概念：又称为重组DNA技术，在分子水平上，人工、提取、重组DNA,引入受体细胞，DNA复制和表达两亲本遗传信息，生产出新产品，并遗传给下一代。发展：基因工程技术在医药领域的应用越来越广泛，它不仅打破了传统医学的概念，拓展了以高技术、新思维的创新模式，而且在实践中越来越显示其优越性和生命力。下面就基因工程技术在医学方面的成就作一简单介绍。5ppt课件（一）医学基础研究 应用基因工程技术，可进行如下几个方面的基础研究：建立人类染色体的基因文库，为进一步寻找基因、分析基因序列奠定基础；分析基因的结构与功能，如对一些重要的细胞因子、生长因子等基因进行克隆与表达，表达产物为研究这些蛋白质的功能及其相互作用关系提供了实验资料；探讨疾病发生、发展及治疗的分子机制，如从基因水平研究肿瘤、心血管、神经系统疾病的发生发展机制，了解各类感染因子的致病机制，探讨细胞生长、分化及死亡的分子机制，为人类疾病的基因治疗提供理论和技术基础。DNA体外重组技术对医学科学渗透，促进了医学科学发展，形成了分子生物学、分子遗传学、分子免疫学、分子药理学、分子病理学、分子流行病学、分子肿瘤学等分支学科。6ppt课件（二）疾病诊断 传统的疾病诊断方法大致有临床诊断、血清学诊断和生化学诊断。这些诊断方法都是以疾病的表型改变为依据，而表型的改变在多数情况下不是特异的，出现的时间也较晚，以致诊断不明和延误病情。近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，人们清楚地认识到，作为生命物质基础的基因的改变会导致各种表型的改变，所以直接检测基因的改变可以作出早期和确切的诊断。基因诊断作为第4代诊断技术是以探测基因的存在、分析基因的类型和缺陷及其表达功能是否正常，从而达到诊断疾病的一种方法。基因诊断可用于对遗传性疾病的诊断、传染性病原体检测、产前诊断以及确定亲缘关7ppt课件系等，如对地中海贫血症、唐氏综合症、血友病等的诊断。此外，单克隆抗体（简称单抗）的问世是医学史上的一个里程碑，它促进了医学基础研究和临床应用的发展，提高了疾病诊断水平，对治疗诸如癌症等疑难病发挥了特殊的作用。单抗是特异性极高的蛋白质，定性或定量检测病人血、尿及分泌物中各种特殊蛋白质或病原体，比传统方法的准确率大大提高，可快速检测到常规方法下不能检测的病原体。目前有不少诊断用单抗试剂盒已商品化，如血型A、B及AB分型的诊断试剂，各种疾病如乙肝、各种性病、肿瘤等的免疫试剂 盒。我 国 现 已 研 制 出 的 单 抗 制 品 有 几 十 种。8ppt课件（三）基因工程药物 1977年，科学家Itakura（板仓）将人生长激素释放抑制因子基因转入大肠杆菌，生产出有活性的生长激素释放抑制因子，标志着生物工程制药工业的开始。在此之前，除了抗生素可用生物发酵大规模生产外，绝大多数生化药物主要从组织或体液中提取，这种制备方法产量低，成本高。例如，要获得1mg生长激素释放抑制因子传统方法：要从10万头羊脑中提取。用基因工程方法只需10L发酵液便可。1982年，美 国 药 品 与 食 品 管 理 局（Food and Drug Administration，简称FDA）批准Elilly（礼来制药）公司的人胰岛素遗传工程产品上市，使基因工程产品正式商品化。至今全世界已有1000多家生物技术公司，其中大多数都在进行基因工程药的开发，现已有近20种基因工程药品投放市场，如治疗糖尿病的人胰岛素，抗肿瘤的人白细胞介素-2，防治肾衰引起贫血的9ppt课件 人促红细胞生成素（EPO），防止化疗引起骨髓抑制的粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等。此外，还有基因工程疫苗，如乙肝疫苗、百日咳疫苗等。这些基因工程药物对疾病的防治有着重要的作用，是传统药物无可比拟的。单抗应用于临床治疗也有不少尝试，从1983年美国首次报道用单抗治愈化疗与放疗无效的淋巴瘤，至今，已取得很大进展。由于免疫反应的特异性，把单抗作为药物可准确地击中目标，也可把单抗与抗肿瘤药物、毒蛋白或放射性物质结合后，作为“生物导弹”摧毁癌细胞而对正常细胞无害。但单抗在临床治疗应用中，诸如免疫排斥等问题还没有很好解决，产品大多处于临床实验阶段，但这种区别于传统观念的“分子导向”药物前景是乐观的。10ppt课件（四）基因工程疫苗 地球上彻底消灭的第1种人类疾病天花，是靠牛痘疫苗来实现的。传统的第1代疫苗是用减毒或杀死的病原体来激活机体免疫系统，从而抵抗疾病侵袭。缺点是安全性较差，大多数不成功，但它在疫苗中的地位仍不可否认。基因工程技术可使我们得到大量的、具有保护功能的蛋白质，这些蛋白质注射入机体后会诱导免疫反应，被称为亚单位疫苗，属于第2代疫苗。第2代疫苗还包括基因工程活疫苗，即将保护性抗原导入安全的细菌或病毒中制成的疫苗，或将致病细菌的毒力有关基因突变或缺失制成的活疫苗。11ppt课件 近来,美国、法国、德国已在研究免疫原性更强的第3代多功能疫苗，即DNA疫苗，它通过直接注射基因重组的抗原基因（DNA）来激活人体免疫系统。就目前研究结果看，DNA疫苗可以诱导许多亚单位疫苗不能诱导的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte简称CTL），安全性好，可长期免疫，不存在返祖和突变，保存条件要求不高，如制成粉剂可在常温下较长时间保存。由于DNA疫苗具备上述优点，故这种方法目前是研究的大热点，预计在10-20年内，其给药途径将会由目前的直接注射、脂质体包埋等得到大的改进，其结果是作用确切、肯定、效果好。DNA疫苗的作用机制也将得到明确的实验例证，得以较好的解释，从而反过来推进这项技术的完善和发展。12ppt课件（五）基因工程抗体 抗体是机体内最复杂的分子，以其特有的基因结构和重组形成了巨大的多样性，可结合任何一种抗原，不仅为机体提供了有效的保护，也成为科学研究、生物技术及临床诊疗的重要工具，在生物试剂产品中，抗体类占了最大份额，因此抗体工程的发展一直是人们关心的热点。从80年代中期，随着DNA重组技术的进展和人们对Ig分子认识的深化，抗体技术由细胞工程抗体(杂交瘤-单克隆抗体)发展到了第三代抗体：基因工程抗体，尤其是噬菌体抗体库技术的出现，将抗体工程推到了一个新的发展阶段。1.鼠单抗作为异源性蛋白在人体内可诱发抗鼠抗体的生成(HAMA)，而用细胞融合-杂交瘤方法制备人单抗未能取得突破性进展，因此尽管单抗在诸多领域得到广泛的应用，但在体内治疗应用却明显滞后。为解决这一难题，鼠单抗人源化成为最早出现的基因工程抗体。13ppt课件 从80年代初期发展到现在，鼠单抗人源化经历了如下历程：恒定区人源化可变区人源化；为保证抗体亲和力而保留某些鼠源残基利用抗体库技术获得完全人源序列。2.小分子抗体因其分子量小、穿透性强、抗原性低、可在原核系统表达以及易于进行基因工程操作等优点而受到人们重视。小分子抗体种类较多，且不断有不同形式的小分子抗体出现，但目前研究较多或实用前景较明确的有以下几种：Fab段、Fv段、单链抗体(ScFv)、二硫键固定的Fv段等。噬菌体抗体库技术是抗体工程领域的最重要进展，在该技术出现以前，基因工程抗体主要是用DNA重组技术对已有单抗进行改造，而抗体库技术发展到了用基因工程技术克隆新的抗体，使抗体工程进入了一个全新的时期。综上所述，基因工程抗体的进展已使抗体制备技术进入了一个全新时代，尤其噬菌体抗体库的进展，解决了人源抗体的研制，促进了各种性能优良抗体以及具有多种功能的抗体融合蛋白的开发，可以预见基因工程抗体的研制正在进入一个新的高峰。14ppt课件（六）转基因动物 自1980年Gurdon（戈登）首获转基因小鼠，1982年Palmifer首获表型发生改变的“超级小鼠”，至今已逾20年。除供医学研究模型小鼠的建系外，转基因动物生物反应器生产药用蛋白也取得了长足的进步。目前，已有2个蛋白进入期临床，6个药品进入期临床。其中，英国PPL公司和美国DNA公司的-抗胰蛋白酶转基因羊和血红蛋白的转基因猪在泌乳的规模上，已分别达到45L/只和400万/只，相当于1个50L的发酵罐，仅后者产值就达10亿美元的水平。美国Abgeruix公司和Medarex公司开发出“异源鼠”技术，开发了两个全人单抗产品，一是用于治疗牛皮癣，正在临床试验中，另一个用于治疗癌症，正处于临床前期开发阶段。我国的转基因羊也产生因子IX和清蛋白，其药用价值不可估量。15ppt课件 这种利用转基因动物生产高附加值物质已在20世纪展露出新的前景。由于转基因动物在DNA整合、调控规律方面还存在诸多问题。如转基因效率低,定点整合较困难,表达水平不高和难以控制等。这些问题可利用核移植技术的克隆动物加以解决。而克隆羊多莉的问世及克隆鼠、克隆牛的成功,会使基因转移效率大为提高,在技术操作上有望比显微注射法所需动物数减少2.5倍。可用转染的方法先将目的基因导入动物体细胞内,再用克隆技术使带目的基因的转基因动物迅速进行种群扩增。这样,在不久的将来,一些瘦肉基因猪,分泌药用价值的泌药猪将会在技术上得到突破,在实际上变为可行。笔者认为,未来1020年内,一些高产低耗药品会不断产生。把转基因动物作为时空四维考察体系,可研究基因功能、表达调控等基础生命科学问题,也可藉此作为疾病和药物作用的研究模型,将转基因动物创造成器官移植的供体,取代人体器官的直接移植。当然,将动物个体通过转基因技术开发成生物反应器(发酵罐),也会因之而变得更加有效、高产,其花样也会令人眼花缭乱。16ppt课件（七）基因治疗 基因治疗的基本原理来源于人类对自身遗传机制的了解。基因疗法就是制备正常基因代替或校正遗传缺陷基因，或关闭或调控异常基因的表达，而达到治疗疾病的目的。基因作为机体内的遗传单位,不仅可以决定我们的相貌、高矮,而且它的异常变化将会不可避免的导致各种疾病。基因治疗的提出最初是针对单基因缺陷的遗传疾病,目的在于用一个正常的基因来代替缺陷基因或者来补救缺陷基因的致病因素。1990年美国国立卫生研究院用ADA(腺苷酸脱氨酶)基因治愈一位由于ADA基因缺陷导致严重免疫缺损的4岁女孩，致使世界各国都掀起了研究基因治疗的热潮。17ppt课件 至今基因治疗的研究内容也从单基因的遗传病扩大到多基因的肿瘤、艾滋病、心血管病、神经系统疾病、自身免疫病和内分泌疾病等。我国复旦大学遗传研究所与第二军医大学合作于1991年12月对两例血友病患者进行基因治疗并取得初步效果。1997年上海市神经外科研究所分别为35例大脑恶质胶质瘤患者进行基因治疗,获得满意效果,处于国际领先水平。18ppt课件（八）基因的寻找与人类基因组计划 基因（gene）是携带生物体遗传性状的基本单位，它的实质是染色体DNA线性链上的一段特定的核苷酸序列，这段序列蕴含了细胞中某一蛋白质或RNA的完整的遗传密码。据估算，一般认为人体基因的总数在10万个左右。基因组（genome）是指一个细胞所含的全部遗传信息,即染色体DNA(还有线粒体DNA)，它包括了全部的基因以及基因之间的区域。病毒的基因组很小，大肠杆菌的在4.6 Mb(百万碱基对)，人体基因组即指储存在细胞23对染色体上的全部核苷酸序列,其总数大约为30亿碱基对（3109 bp）。人类基因组计划（HGP）的最终目标是完成人类基因组全序列的测定，其内容主要分为遗传图、物理图的构建和DNA序列测定两个方面；基因的定位和分析也将包括在内。同时，还将开展模式生物基因组的研究。19ppt课件 我国的人类基因组研究参与了国际大合作，也取得了一定的成绩和进展。但是,从整体来说，与国际上迅速发展的形势相比还存在着相当的差距。我们要从我国实际国情出发，注意充分发挥自己的优势，完全可以在后基因组时代，即基因组功能研究中作出更大的贡献。我国地大物博，地理环境的差异大，丰富的动植物及微生物资源为我们进一步开发新基因，改造生物体性状、创建新品种，发展生物技术产业，提供了巨大的潜力。就医学领域来说，我国民族众多，疾病谱广，而且，众多的人口包含了大量的罕见或常见疾病的个体；另外，待开发地区还保留着一批可供遗传多样性分析的家系聚集的群体。只要进一步加强遗传流行病学调查，加强临床与基础研究的结合，加强新技术新方法的创建，加强不同学科之间的交叉、协作，我们就能为21世纪初人类功能基因组学的研究，为医学科学的发展作出更大的贡献。20ppt课件（九）基因表达调控的基本原则及相关蛋白 基因表达的整个过程主要涉及到DNA经转录(transcription)合 成 信 使 RNA(messenger RNA，mRNA)，再 以 mRNA为 模 板 翻 译(translation)成蛋白质。DNA所含的遗传信息决定物种的遗传和变异，蛋白质表现了遗传性状，而mRNA储存和传递遗传信息，并在遗传信息的表达过程中起重要的作用。基因表达的调节包括以下几个水平：转录水平的控制；转录产物的加工调节；mRNA从细胞核向细胞质运输过程中的调节；mRNA降解的调节；翻译水平的调节。其中以转录的调控最为关键。21ppt课件（十）蛋白质工程 蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，更具有现代科学高新技术的特征。它融合了蛋白质晶体学，计算机辅助设计（CAD）和蛋白质化学等多学科的知识，以人工合成蛋白质为目的的一项新兴技术。蛋白质工程是基因工程的延伸，也可以说是第二代基因工程。包括:1.通过基因工程技术了解蛋白质DNA编码序列,2.蛋白质的分离纯化、蛋白质的序列、结构、功能分析，3.蛋白质结晶和动力学分析 4.计算机辅助设计突变区及对DNA进行突变改造。22ppt课件二、染色体工程 染色体工程是按照预先的设计，添加、消除或替代同种或异种染色体的全部或一部分，从而达到定向改变生物遗传性状或选育新品种的目的。他是从染色体水平改变细胞遗传组成的细胞工程技术。目前主要应用于植物遗传育种领域。23ppt课件三、染色体组工程 染色体组工程是在人为设计的技术路线下添加、消除同种或异种染色体组以达到定向改变生物遗传性状的目的。这种工程也主要用于植物育种和遗传学研究。24ppt课件四、细胞质工程 细胞质工程的主要内容包括细胞质和细胞器的代换和添加。动物细胞的细胞质代换常采用核移植法，即用显微操作技术取出一个细胞的核，再注入另一个已除去核的细胞质中，形成核质杂种。这种方法一般只适用于鱼类和两栖类较大的卵细胞。细胞质工程不仅对遗传、育种等生产实践有重大意义，而且是研究核、质关系，细胞器遗传以及基因转录调节等基础理论的有力手段。25ppt课件五、细胞并合工程 细胞融合又称细胞并合或体细胞杂交，系指用人工方法使2个或2个以上的体细胞合并在一起，不经过有性过程而得到杂种的方法。迄今在种间、属间、科间，甚至动、植物两界间都进行了成功的试验，取得了满意的结果。近20年来，细胞并合工程作为一种重要的研究手段，已对细胞周期的调控，核质相互作用的分析，基因定位与调控以及肿瘤发生，衰老控制等理论研究领域取得许多可取的成绩，并在远缘杂交育种、基因治疗以及医药工业等应用领域也开辟了新的途径。26ppt课件六、组织工程的进展及生物医学方面的应用 组织工程学(tissue engineering)是生物医学工程学中的一个新的分支，是应用生命科学工程学的原理与技术，设计、构造、改良、培育和培养活组织，以修复或重建组织器官的结构，维持或改善组织器官功能的一门新兴的边缘学科。其基本方法是将体外扩增的正常组织细胞，吸附到一种生物相容性良好并可被机体吸收的生物材料上，然后植入机体缺损部位，细胞在生物材料逐渐降解吸收过程中形成新的组织，达到修复缺损，重建功能的目的。如：运用组织工程技术在裸鼠身上再生软骨，国外已有较多的关于软骨组织的组织工程；国内曹谊林教授首次采用组织工程技术在裸鼠体内再生了带血管的骨组织，27ppt课件并用于修复骨缺损，为骨组织缺损的修复提供了一条新的思路和途径。骨组织的再生要求有三个基本的生物学因素参与，即细胞；生长和分化因子；细胞外基质材料，这也是当今组织工程研究中的三大课题。源细胞经过培养可以分化成成骨细胞；生长分化诱导因子可以促进成骨细胞的分化增殖，保持成骨细胞不衰老；生物可降解材料可作为细胞支架，支持细胞的附着、迁移和分化。组织工程，简单地说是在呈多微孔状态的可降解聚合物生物材料中植入活细胞，经体外培育后植入机体，聚合物材料逐渐降解吸收，细胞存活，形成组织并行使相应的功能，实现真正意义上的仿生。28ppt课件在美国，组织工程研究涉及的组织较为广泛，有软骨、皮肤、胰腺、肝脏、肾脏、膀胱、输尿管、骨髓、神经、骨骼肌、肌腱、心瓣膜、血管、肠、乳房等，其中已有皮肤和软骨产品进入临床应用。据了解，我国自九十年代初即开始了一些有关组织工程的基础研究。1997年中国修复重建外科杂志开辟了“组织工程研究”专栏。同年，在生物材料和外科领域组织的一系列学术会议上有关专家报告了组织工程研究内容。1998年，先后在上海、天津等召开了组织工程专题研讨会。近几年来，在我国医学临床、基础以及生物材料等领域，不少研究人员已经关注组织工程的发展，并相继开展了有关研究。29ppt课件第二节 细胞工程的主要技术一、细胞融合技术 二、细胞拆合技术 三、大规模培养细胞技术 四、干细胞技术五、显微操作技术30ppt课件一、细胞融合技术 细胞融合包括质膜的连接与融合，胞质合并，细胞核、细胞器和酶等互成混合体系。自然界中，细胞融合的范例是生物生殖过程中精卵结合，只限于同种生物或亲缘关系很近的物种之间，产生的遗传变异小。人工细胞融合技术，优点是可以实现体细胞之间的杂交而不受亲缘关系的限制。可实现任意细胞间的融合，拓宽了变异范围。例如，番茄和马铃薯通过人工细胞融合技术生成新物种-“泡马豆”(ponato，由potato 与tomato 组合而来)，其外形倾向于番茄，花、果实倾向于马铃薯。细胞融合技术在不断改进：20 世纪60 年代初病毒诱导细胞融合技术 70 年代化学融合技术 80 年代电融合技术31ppt课件（一）病毒诱导的细胞融合 原理：某些不同属种的动物细胞在特定病毒、病毒外壳或其碎片作用下可产生融合作用。如仙台病毒、流感病毒、新城鸡瘟病毒及疱疹病毒均有诱导作用。过程：当两种不同动物细胞混合物中存在大计量病毒时，细胞周围布满病毒，病毒或其组分在细胞间起粘连作用，使细胞凝集成团，致使不同细胞的膜蛋白及膜脂质分子重新排布而结合成一个整体，从而完成细胞融合过程。缺点：1、制备困难。2、实验的重复性较差，每批病毒的融合效价差别较大。3、有病毒感染的危险，当病毒灭活不完全时。32ppt课件（二）化学因子诱导的细胞融合技术 化学融合剂种类（主要有5种）：1.高级脂肪酸衍生物，如甘油-醋酸酯、油酸、油胺等 2.脂质体，如磷脂酰胆碱、磷脂酰氨酸等 3.钙离子 4.特殊结构的水溶性高分子化合物，如聚乙二醇（PEG）5.水溶性蛋白质的多肽如牛血清蛋白，多聚L-赖氨酸等 其中聚乙二醇（PEG）最为常用。PEG具有强烈吸水性及凝聚和沉淀蛋白质作用，对植物及动物原生质体和动物细胞的融合均有促进作用。当不同种属动物细胞混合液中存在PEG时，即产生细胞凝集作用，当稀释和除去PEG时，即不产生融合现象，但作用机制尚不清楚。33ppt课件 PEG 诱导细胞融合的优点：1、与病毒比较，容易制备和控制。2、活性稳定。3、使用方便。PEG 作为融合剂存在下列缺点和问题：1、PEG诱导融合的有效浓度过高(常为50%),则对细胞 有较大的毒性，尽管近年来有一些降低毒性的措施，但对其毒性仍不能轻视。2、PEG 对细胞融合的诱导率低，约为1 x10-5。3、不能在显微镜下观察细胞的融合过程。34ppt课件（三）电场诱导的细胞融合 概念：在一定条件下，通过电脉冲作用使细胞融合的过程谓之电场诱导融合作用。过程：将两种细胞混合液经10-100V/cm低强度非均匀交变电场作用，则细胞紧密接触形成稳定串珠状偶极了排列，细胞之间通过偶极子作用相互吸引，此时对该状态细胞施加瞬时高强度电脉冲，一般击穿电压为0.5-10KV/cm，作用时间为30-50 微秒，细胞之间形成稳定的膜连接，不同细胞间膜脂质分子重排而合并成一个双核或多核细胞，完成融合过程。35ppt课件 电场诱导的细胞融合优点：1、融合率是PEG 的100 倍，为1 x 10-3 2、操作简便、快 速 3、因为是物理刺激，不具有细胞毒性问题 4、可用显微镜观察融合过程，探讨融合的机制 电场诱导的细胞融合缺点：融合细胞存活率低36ppt课件显微镜下细胞融合过程 亲本A不能合成营养物质b 亲本B不能合成营养物质a融合后的杂种细胞从两亲本中获得了a物质和b物质合成基因，所以可以在无a营养物质和b营养物质选择性培养基上生长。37ppt课件二、细胞拆合技术 真核细胞是由细胞核和细胞质两大部分组成的，细胞的正常生命活动都是在这两部分密切配合下进行的，两部分间有一定的相互关系，为了探明这种相互关系的机制，学者们创建了细胞拆合技术。所谓细胞拆合，就是把核与质分离开来，然后把不同来源的细胞质与细胞核相互配合，形成核质杂交细胞。根据使用方法的不同，细胞拆合可以分为物理和化学两种类型。38ppt课件二、细胞拆合技术 （一）物理法 物理法就是用机械方法或短波光把细胞核去掉。或经紫外线靶细胞核破坏掉，用微吸管吸取其细胞的核，再将此核移入去核的细胞质中，组成新的杂交细胞。这种核移植必须用显微操纵仪进行操作，一些较小的体细胞使用这种移核方法很难奏效。（二）化学法 化学法就是用细胞松弛素B（cytochalasin B）处理细胞，细胞出现排核现象，再结合离心技术，将细胞分拆为核体（karyoplast）和胞质体（cytoplast）两部分。39ppt课件40ppt课件二、细胞拆合技术 分拆后的核体外表包有一层细胞膜和少量胞质，又称为小细胞(minicell)。在PEG或仙台病毒义的介导下，核体可同另一胞质体融合，形成重组细胞(reconstituted cell)。重组细胞亦能合成RNA和进行细胞分裂。为了便于把重组细胞与未去核的细胞区别开来，融合前应先进行标记。将准备制取核体的细胞用3H 嘧啶核酸标记核，用小乳胶粒（直径0.5m）标记细胞质（乳胶粒可被吞噬进入细胞质）；将准备制取胞质体的细胞，用大乳胶粒（直径1m）标记细胞质。真正融合的重组细胞，核为3H 标记，细胞质中含有大乳胶粒。41ppt课件42ppt课件三、大规模培养细胞技术 细胞培养是生物工程中的一项重要技术，各种细胞工程无不与细胞培养有关。为了使细胞产品适应工业化规模生产，必须发展大规模培养细胞技术。这方面近年来有一些较大的进展。（一）培养容器的增大 进行大量细胞培养需要扩大培养器的容量，然而培养器越大越深，培养液的含氧量就不能维持大量细胞生长的需要。改进方法：用氧气代替空气供氧+直接向培养液中充氧 更新缸体：深层全自动气升式培养缸（最大容量达1000L）（二）扩大细胞附着面 以往，采用单层静置培养法或转瓶培养法：附着面有限，细胞产量低。目前，动物细胞微载体培养法：大幅度提高了细胞的生长效率和产量。43ppt课件三、大规模培养细胞技术 动物细胞微载体培养法的成败关键是：选择适宜的微载体。优良的微载体必须具备的特性：1.不含有对细胞有毒的成分2.与细胞有良好的相容性，使细胞易于贴壁生长3.密度在1.03 1.05 之间4.有良好的光学透明性,便于显微镜观察细胞生长情况5.不吸收培养基中的营养成分及目的产物6.收获细胞或目的产物容易7.基质为非刚性材料，避免在培养过程中微载体间的相互碰撞而损伤细胞8.价格低廉，能重复使用。近年来，一些生物技术公司来用海绵状管壁的空心纤维进行大规模培养，这种方法为增加培养细胞的产量提供了小容积、大表面的良好条件。44ppt课件三、大规模培养细胞技术（三）无血清培养问题 目前的培养液中，一般需要加5%15%的动物或人的血清。这不仅价格昂贵、容易混进污染物(包括病毒和病菌)，而且其成分不能完全确定，不同批次的血清之间难以保证实验结果的可重复性。因此，无血清培养日益受到重视，并已取得了较大的进展。无血清培养基由3 部分组成，即基础培养基，生长因子，激素基质。虽然上述无血清培养液中，一般细胞浓度可达106/L-107/L，但并非任何细胞均能获得如此成功，不同的细胞需要不同的适于生长的分子环境，这方面还需要进一步探索。45ppt课件四、干细胞技术 干细胞是一种具有多分化潜能和自我复制功能的早期未分化细胞。在特定条件下，它可以分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官。干细胞技术是指在人体外使用胚胎干细胞培养心脏等内脏器官、骨骼、神经细胞、血液细胞、皮肤细胞、角膜、眼球等，用以置换人体内因疾病或外部损伤而丧失功能的组织器官的技术。按分化阶段的不同，可将干细胞大致分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)和成体干细胞两大类。46ppt课件（一）胚胎干细胞 1.胚胎干细胞的概念：胚胎干细胞是指从受孕3-5天的着床前胚胎的内 细胞团中分离出来，能在体外培养的一种高度未分化细胞。特点：能大量繁殖并保持未分化状态；在一定条件下能向内、中、外三个胚层组织和细胞分化；具有全能性，易于进行基因改造操作；能够形成嵌合体动物，从而成为联系细胞和个体之间的 桥梁。2.胚胎干细胞的建立途径 （1）可通过体细胞核转移技术获得胚胎干细胞。具体步骤为：将卵细胞脱核；将体细胞的细胞核转移到去核卵细胞；对经核转移处理的卵细胞进行体外培养；待囊胚形成后取内细胞团，经体外细胞培养制备成胚 胎干细胞；特殊条件下定向分化为神经、肌肉、造血等组织器官；移植到病人体内。47ppt课件 （2）利用其他哺乳动物的卵细胞作为核受体进行体细胞核转移 研究，如：采用母牛的卵细胞进行人类体细胞实验（尚未完全成功）。（3）利用来源于胚胎组织的胚胎干细胞的细胞架与成人体细胞核进行杂交，使该体细胞的细胞核与胚胎干细胞的胞质融合，通过胚胎干细胞的胞质作用对体细胞核的核内遗传信号进行重新编程，而实现体细胞的多能或全能化。3.胚胎干细胞的应用前景 在适宜的条件控制下，胚胎干细胞可在体外培养体系中形成各种人体组织，甚至人体器官。如该目标实现，将使临床上器官移植所面临的器官来源紧缺及免疫排斥等棘手问题得到彻底解决。现已证实通过体外诱导，胚胎干细胞可形成肌肉、骨、软骨、韧带、肌腱、脂肪等组织。科学家正设想用体内已有的器官作为“支架”，让从胚胎干细胞衍生而来的细胞替代原有的细胞从而制备肺、肾等人体器官。胚胎干细胞有望与基因治疗技术结合起来为人类健康服务，治疗某些目前无法治愈的遗传性疾病。48ppt课件（二）成体干细胞 1.成体干细胞的特点 概念：成体干细胞也称多能干细胞，是指到了个体发育的一定阶段，甚至成体，仍有一部分细胞分化，负责组织的更新和修复。如：如造血干细胞，神经组织干细胞、表皮干细胞等。特点：1）成体干细胞向特定组织分化。如造血干细胞分化为血细胞 2）成体干细胞可横向分化为其他组织。如肌肉细胞分化为有增殖能力的骨髓细胞 总 之：多 能 干 细 胞 可 根 据 生 理 需 要 而 产 生 分 化 细 胞，以 维 持 机体的稳定平衡。49ppt课件 2.成体干细胞的应用前景 随着细胞生物学的发展，人们发现，成体干细胞横向分化具有相当的普遍性，分化机制一旦被研究清楚，就有望利用病人自身健康组织的干细胞诱导分化成病损组织的功能细胞来治疗疾病。这样，既克服了免疫排斥，又避免了胚胎细胞来源不足以及其他社会伦理问题，为临床治疗奠定基础。目前干细胞技术治疗疾病还存在三方面的问题：如何把胚胎干细胞转化成特定的功能细胞（定向诱导）；如何把一种组织的成体干细胞转化成另一种组织的功能细胞（横向分化）；如何把成体干细胞在体外进行非分化扩增。另外，怎样从根本上克服免疫排斥，怎样利用干细胞构建器官等，都是限制干细胞技术在临床应用的问题。如果把人的胚胎干细胞植入到发育早期的动物胚胎内，这种“转干细胞动物”体内就可能生长出某种由人的胚胎干细胞分化形成的组织或器官，这种“动物体内生长的人的器官”就有可能用来做病人的替代器官。当然，目前这还只是一种假想，最终解决需要各方面专家的加入。50ppt课件五、显微操作技术 显微操作技术是在显微镜下，用显微操作装置对细胞进行解剖手术和微量注射的一种技术。目前显微操作装置的设计愈来愈精密，利用这种微动装置可进行细胞解剖，取出细胞核和其他细胞器，也可进行微量注射，将水溶性或非水溶性的液体直接注入细胞质或细胞核中，观察这些物质对细胞活动的影响；或者向细胞内注入微量指示剂，根据其颜色的变化来测定细胞内的酸碱度；还可用于细胞核移植、基因导入、胚胎切割等手术。因此，显微操作技术在研究核质相互关系、基因表达、细胞内微区的作用等方面是一种很有用的技术。51ppt课件第三节 细胞工程技术在医学生物学中的应用一、在医药工业方面的应用 二、在临床诊断与治疗方面的应用 三、在细胞生物学研究方面的应用 四、在遗传学研究方面的应用五、在病毒学研究方面的应用 六、在肿瘤学研究方面的应用 七、其他方面的应用 52ppt课件一、在医药工业方面的应用 细胞工程在医药工业方面的应用十分广泛，经济效益显著。其中最重要的成就有：应用B淋巴细胞杂交瘤技术生产单克隆抗体；应用T淋巴细胞杂交瘤技术生产淋巴因子。各种特异性很强的单克隆抗体可以作为有力的研究工具和免疫诊断试剂，还可以作为载体，运载抗癌药物、放射性核素或毒素，形成“生物导弹”治疗肿瘤。此外，采用细胞培养技术大量培养动植物细胞，从中提取重要药物或其他物质。所以，采用大规模培养细胞技术对这些次生产物进行工业化生产，将根本解决原料供应问题，既节约成本，少占耕地，又能充分供应，满足需要。至于用生物工程生产的胰岛素、生长激素等、市场上早已有商品出售。53ppt课件 利用转基因植物生产药用蛋白，由于植物本身的特点，使之在如下两方面具有得天独厚的优势。一是不需投入大量资金，只需利用土壤即可大规模推广应用，所需成本极低；二是由于不使用微生物，可避免表达产物的积聚流失现象。转基因动物将有一天成为“动物药厂”，他们可以持续地把人们所希望的蛋白质分泌于乳汁之内。其收获方法也很简单，只需利用标准的层析技术从乳液中提纯即可。利用这个技术生产的具有药理活性的蛋白质已经有凝血因子、白细胞介素-2、组织纤溶酶原激活物和尿激酶等。54ppt课件二、在临床诊断与治疗方面的应用 基因诊断和基因治疗是现代医学中的重要组成部分，它的出现是以分子生物学的理论和技术的不断进步为基础的，也体现了人类对自身的生命和健康的认识有了长足的进步。基因诊断和基因治疗的问世说明人类不但对疾病的理解进入了分子水平，而且设计出针对基因进行增量或添加、阻断或抑制基因过量表达，对突变基因进行修饰或封闭等基因治疗方案。各种先天性代谢病的发生，在受精卵卵裂初期便已决定。因此采取妊娠早期的羊水细胞经过短期培养后，进行酶的分析，就可以判断胎儿是否患有代谢性疾病，以此来进行出生前诊断，从而保证优生。55ppt课件 基因治疗的结果就像给基因做了一次手术，所以有人又形容其为“分子外科”。我们可以将基因治疗分为性细胞基因治疗和体细胞基因治疗两种类型。性细胞基因治疗，是在患者的性细胞中进行操作，使其后代从此再也不会得这种遗传疾病。体细胞基因治疗，是当前基因治疗研究的主流。采用什么样的手段将精心挑选的功能基因送到体内，穿过细胞膜，进入细胞核与染色体整合，这是基因治疗成败的关键。值得提出的是，无论哪一种基因治疗目前都处于初期的临床试验阶段，均没有稳定的疗效和完全的安全性。这是目前基因治疗现状。正如基因治疗的奠基者们当初所欲言的那样，基因治疗这一新技术的出现将推动医学的革命性变化。56ppt课件三、在细胞生物学研究方面的应用 细胞工程技术在细胞生物学研究中的应用更为广泛，有力的促进这些研究向分子水平发展。1.用于分析细胞周期的调控：将处于细胞周期中不同时相的细胞进行融合，发现其细胞核的时相逐渐发生同步化。查清这些物质的分子结构及其作用机制，将有助于阐明细胞周期的调控问题。2.用于分析细胞各种组分的代谢调节、相互作用及其在细胞生长和分化中的作用。3.用于研究细胞重要组成物质的形成和调控条件。57ppt课件四、在遗传学研究方面的应用 遗传学是分子生物学发展以来受影响最大的学科。越来越多的遗传学原理正在被分子水平的实验所证实或摒弃，许多经典遗传学无法解决的问题和无法破译的奥妙，也相继被攻克。分子遗传学已成为人类了解、阐明和改造自然界的重要武器。基因工程技术可用于分析表型表达的机制、基因定位、基因互补以及绘制人类基因图等。应用细胞融合进行基因互补分析可测定某些疾病存在哪些酶或蛋白质缺陷，从而为这些疾病的治疗提供理论依据。58ppt课件五、在病毒学研究方面的应用 病毒致病的广泛性与严重性早在19世纪就已被描述。分子病毒学研究将为进一步阐明病毒致病的机制和规律，从而克服病毒这一人类的顽敌做出贡献。应用细胞融合技术可检测病毒和分析细胞对病毒敏感的因素。病毒在不适的环境中，由于不能完成正常繁殖周期，因而不能产生完整而有感染力的成熟病毒，若将其与病毒适宜的细胞融合，则能使潜在的病毒重现，从而检出一些未知病因疾病的致病病毒。细胞融合技术还可用来分析细胞内抑制病毒复制或改变病毒基因表达的机制以及确定病毒基因在宿主细胞DNA上整合的位点。如上所述，病毒的再现需要病毒适宜细胞提供某种细胞质因子。深入分析病毒适宜与不适宜细胞的分子基础，有助于了解抑制病毒复制或改变病毒基因表达的机制。59ppt课件六、在肿瘤学研究方面的应用 细胞融合技术可使潜在的致癌病毒再现，检测出未知的致癌病毒，确定致癌病毒在宿主细胞DNA上整合的位点。细胞融合还可以用来进行肿瘤细胞恶性分析，探讨癌变的过程和机制。对肿瘤的特异性治疗一直是医学工作者的梦想，应用细胞融合技术有可能使肿瘤特异性抗原分子发生变构，从而提高肿瘤细胞的抗原性；或者由于其杂交细胞恶性度下降而得到该肿瘤细胞的减毒株，用这些细胞免疫机制，有可能使机体产生强的免疫反应而排斥肿瘤。60ppt课件七、其他方面的应用 细胞工程技术已有效的用于动、植物品种的改良，前面介绍的超级小鼠就是育成动物新品种的著名实验。此外，细胞工程技术在微生物的育种中也得到广泛应用。生物工程技术在中医药现代化方面已取得重要成就。生物工程技术在未来对人类预防疾病、对付各种不治之症、养生健身、延缓衰老等一系列生命科学重大问题上，将发挥其巨大作用。同时它将在实现中医现代化，挖掘祖国医学宝库，创建走向世界的新医学方面，开创一个新时代。61ppt课件谢 谢62ppt课件