细胞实验技术课堂第九讲细胞培养总结课件

细胞实验技术课堂第九讲细胞培养总结（一）细胞培养所用制品的清洗与消毒（一）细胞培养所用制品的清洗与消毒在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感，这些在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感，这些物质若有残留，会影响培养细胞的生长物质若有残留，会影响培养细胞的生长微生物产品附带杂物微生物产品附带杂物上次细胞残留物上次细胞残留物非营养成分的化学非营养成分的化学物质物质需要清洗的培养用品需要清洗的培养用品玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗胶塞的清洗胶塞的清洗塑料制品的清洗塑料制品的清洗2021/1/52（二）细胞培养常用试剂（二）细胞培养常用试剂细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或超纯水需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或超纯水 1：水：水2 2：细胞培养基：细胞培养基市场上可提供干粉培养基和液体培养基市场上可提供干粉培养基和液体培养基常用的培养基种类常用的培养基种类RPMI-1640、高糖、高糖DMEM、低糖、低糖DMEM、F12等等2021/1/53细胞培养基应用选择细胞培养基应用选择选择培养基没有一定的标准，有几点建议可供参考：选择培养基没有一定的标准，有几点建议可供参考：建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐方法，但比较繁琐。2021/1/543：血清：血清热灭活：热灭活：56,30分钟加热已完全解冻的血清分钟加热已完全解冻的血清热灭活目的：灭活血清中的补体成分。热灭活目的：灭活血清中的补体成分。适用于细胞因子和免疫相关实验，否则建议血清不要灭活。因为热处适用于细胞因子和免疫相关实验，否则建议血清不要灭活。因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，还会影响血清的质量。灭活后有时会严重影理会造成血清沉淀物显著增多，还会影响血清的质量。灭活后有时会严重影响细胞生长速度，且细胞贴壁率降低。响细胞生长速度，且细胞贴壁率降低。血清中的沉淀物血清中的沉淀物絮状物：絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm，5分钟去除，也分钟去除，也可不用处理；可不用处理；显微镜下显微镜下“小黑点小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。多。有些沉淀物在显微镜下观察象有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点小黑点”，常误认为血清受污染。，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长。但如果怀疑血清质量，则一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长。但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清。应立即停止使用，更换另一批号的血清。2021/1/554:平衡盐液体平衡盐液体组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节pHpH值、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分值、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分用于洗涤组织、细胞等用于洗涤组织、细胞等KCl0.40gKH2PO40.06gNaCl8.00gNa2CO30.35gNa2HPO40.048gD-Glucose1.00gPhenolRed0.01gD-Hanks平衡盐溶液平衡盐溶液(D-HanksBalancedSaltSolutions,D-HBSS)2021/1/56PBS（Phosphate-BufferedSallines）KCl0.20g KH2PO4 0.20g NaCl8.00g Na2HPO47H2O2.16gDPBS（DulbeccosPhosphate-BufferedSallines）标准型）标准型CaCl2(anhyd.)(无水氯化钙无水氯化钙)0.10 gKCl0.20 gKH2PO40.20 gMgCl26H2O0.10 gNaCl8.00 gNa2HPO47H2O2.16 g2021/1/575：消化液：消化液分离组织和分散细胞分离组织和分散细胞常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液两种溶液单独或混合使用单独或混合使用2021/1/586：pH 调整液调整液NaHCO3溶液溶液常用浓度为常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，分装，分装，4保存保存HEPES（分子量（分子量238.31）溶液）溶液羟乙基哌秦乙硫磺酸，一种弱酸，无细胞毒性羟乙基哌秦乙硫磺酸，一种弱酸，无细胞毒性主要作用：防止培养基主要作用：防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了胞时培养基脱离了5%CO2的环境，的环境，CO2气体迅速逸出，气体迅速逸出，pH迅速升高，迅速升高，若加了若加了HEPES，此时可以维持，此时可以维持pH7.0左右。左右。HEPES配制配制使用终浓度一般为使用终浓度一般为10-50mmol/L常配成常配成1M储存液：用储存液：用20ml双蒸水溶解双蒸水溶解4.76克克HEPES，过滤除菌或，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，高压灭菌，分装小瓶，4保存。保存。使用时可向使用时可向100ml培养液中加入培养液中加入2mlHEPES储存液，终浓度为储存液，终浓度为20mmol/L2021/1/597：谷氨酰胺补充液：谷氨酰胺补充液谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4下放置下放置7天即可分解约天即可分解约50%，所以都是在使用前添加所以都是在使用前添加配制好的培养液（含谷氨酰胺）在配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4放置放置2周以上时，要重新加入原来周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，临用前加入培养液中；量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，临用前加入培养液中；使用终浓度为使用终浓度为14mmol/L配制方法配制方法：一般配制为一般配制为100倍储存液，浓度倍储存液，浓度200mmol/L（29.22g/L）谷氨酰胺谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至溶于三蒸水加至100ml即配成即配成200mmol/L的溶液，充分的溶液，充分搅拌溶解后（应加温搅拌溶解后（应加温30），过滤除菌，分装，），过滤除菌，分装，-20保存；保存；使用时向使用时向100ml培养液中加入培养液中加入0.52ml储存液，终浓度为储存液，终浓度为14mmol/L2021/1/5108：酚红：酚红大多数培养液中使用酚红作为大多数培养液中使用酚红作为pH指示指示橙红色表示中性橙红色表示中性pH，黄色代表酸性，黄色代表酸性pH，紫，紫红色表示碱性红色表示碱性pH在一些特殊培养液中不含酚红在一些特殊培养液中不含酚红因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用醇激素（尤其是雌激素）样作用2021/1/5119：抗生素溶液：抗生素溶液抗生素使用种类与浓度抗生素使用种类与浓度：工作浓度工作浓度储存温度储存温度杀灭细菌杀灭细菌penicillin(青霉素青霉素)100U/ml-20G(+)streptomycin(链霉素链霉素)100ug/ml-20G(+),G(-)gentamicin(庆大霉素庆大霉素)50ug/ml-20G(+),G(-),支原体支原体amphotericinB(两性霉素两性霉素B)2.5ug/ml-20真菌真菌nystatin(制霉菌素制霉菌素)50ug/ml-20真菌真菌2021/1/512（三）、器材和液体的准备（三）、器材和液体的准备细胞培养用的玻璃器材细胞培养用的玻璃器材培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，中，160160，2 2小时干烤灭菌后备用小时干烤灭菌后备用手术器材、瓶塞、配制好的手术器材、瓶塞、配制好的PBSPBS液液1515磅，磅，121121，2020分钟蒸气灭菌分钟蒸气灭菌培养液、小牛血清、消化液培养液、小牛血清、消化液抽滤后备用抽滤后备用2021/1/513冷冻保存细胞的解冻与复苏要点快速解冻快速解冻冻存细胞从液氮中取出后，立即放入冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37水浴中，轻轻摇动水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在冷冻管，使其在1分钟内全部融化（不要超过分钟内全部融化（不要超过3分钟）；分钟）；用用80g离心离心23分钟，弃上清液；分钟，弃上清液；用用510ml新鲜完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细新鲜完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞；胞；接种细胞到培养瓶中，起始密度为接种细胞到培养瓶中，起始密度为3105/ml；24小时后去除未贴壁的细胞，常规培养。小时后去除未贴壁的细胞，常规培养。2021/1/514二、细胞的原代和传代培养2021/1/515原代培养原代培养1.植块法培养植块法培养2021/1/516原代培养原代培养2.酶解组织酶解组织消化、接种培养消化、接种培养2021/1/517原代细胞植块培养原代细胞植块培养细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长如接种的细胞密度适宜，如接种的细胞密度适宜，5 5天到一周即可形成单层天到一周即可形成单层2021/1/518贴壁生长细胞传代方法贴壁生长细胞传代方法2021/1/519传代细胞培养结果传代细胞培养传代细胞培养2021/1/520二、细胞增殖检测2021/1/521（一）、细胞计数及活力测定（一）、细胞计数及活力测定。计数四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，分别数出四角的四个大铬（每个大格含有16个中铬）中死细胞和活细胞数。计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度 细胞悬液的细胞数细胞悬液的细胞数/ml/ml（四个大格子细胞数（四个大格子细胞数/4/4）稀稀释倍数释倍数10104 4公式中说明：除以4表示4个大格的细胞数平均；乘以104因为计数板中每个大格体积：长1.0mm宽1.0mm高0.1mm0.1mm3；（1ml103 mm3）2021/1/5222021/1/523细胞台盼蓝染色计数和活力测定的实验结果细胞台盼蓝染色计数和活力测定的实验结果2021/1/524（二）、（二）、CCK8 实验结果实验结果2021/1/5251123456789101112A0.182 0.066 0.049 0.0490.050.050.050.051 0.052 0.051 0.052 0.051 450B0.051 2.526 2.623 2.631 2.681 2.709 2.653 2.608 2.841 0.051 0.0510.05 450C0.052.4982.62.545 2.565 2.521 2.598 2.466 2.449 0.051 0.051 0.049 450D0.051 2.632 2.681 2.681 2.611 2.484 2.438 2.545 2.502 0.061 0.052 0.057 450E0.051 2.652 2.661 2.617 2.448 2.579 2.641 2.6652.620.050.051 0.049 450F0.052.6252.642.566 2.597 2.618 2.732 2.821 2.4740.050.050.05 450G0.051 2.736 2.6312.632.7242.812.818 2.8682.830.049 0.051 0.051 450H0.050.051 0.054 0.052 0.0550.050.050.055 0.052 0.049 0.049 0.049 4501-11-11-21-24-14-14-24-22-12-12-22-23-13-13-23-22.344 2.441 2.449 2.499 2.527 2.471 2.426 2.6592.316 2.418 2.363 2.383 2.339 2.416 2.284 2.2672.45 2.499 2.499 2.429 2.302 2.256 2.3632.322.47 2.479 2.435 2.266 2.397 2.459 2.483 2.4382.443 2.458 2.384 2.415 2.4362.55 2.639 2.2922.554 2.449 2.448 2.542 2.628 2.636 2.686 2.6482021/1/52621234567101112A0.2150.0420.053 0.043 0.042 0.042 0.041 0.042 0.043 0.042 450B0.0421.9792.153 2.264 2.337 2.407 2.336 2.509 2.454 0.042 450C0.0422.0852.165 2.281 2.389 2.257 2.534 2.359 2.4510.04 450D0.0452.0961.845 2.498 2.445 2.423 2.455 2.527 2.429 0.042 450E0.072.261.528 2.383 2.405 1.851 2.146 2.393 2.387 0.044 450F0.0412.221.6672.462.31.469 2.277 2.374 2.413 0.043 450G0.0452.3231.872.538 2.304 1.703 2.381 2.425 2.212 0.053 450H0.0420.0440.044 0.0460.040.043 0.042 0.041 0.044 0.043 4506-16-16-26-27-17-17-27-28-18-18-28-25-15-15-25-21.764 1.938 2.049 2.122 2.192 2.121 2.294 2.2391.871.95 2.066 2.174 2.042 2.319 2.144 2.2361.8811.63 2.2832.23 2.2082.24 2.312 2.2142.045 1.313 2.1682.19 1.636 1.931 2.178 2.1722.005 1.452 2.245 2.085 1.254 2.062 2.159 2.1982.108 1.655 2.323 2.089 1.488 2.1662.21 1.9972021/1/527（三）、流式细胞仪测定细胞周期（三）、流式细胞仪测定细胞周期2021/1/528（四）、细胞分裂指数测定（四）、细胞分裂指数测定2021/1/529（五）、（五）、EDU或或BRDU标记实验标记实验2021/1/530二、细胞运动检测2021/1/531（一）、细胞划痕实验（一）、细胞划痕实验2021/1/532（二）、（二）、TRANS-WELL实验实验12021/1/533（二）、（二）、TRANS-WELL实验实验22021/1/534二、细胞凋亡检测2021/1/535流式细胞仪检测细胞凋亡流式细胞仪检测细胞凋亡2021/1/536三、真核细胞转染2021/1/537Transfectionofeukaryoticcells2021/1/538TransfectionWhat is Transfection?Transfection is a method of transporting DNA,RNA and/or various macromolecules into an eukaryotic cell by using chemical,lipid or physical based methods.Methods:(just a few examples)Method Application CaPO4,DEAE DNA Transfection Liposome Based DNA Transfection Polyamine Based DNA Transfection2021/1/539Purpose/uses of TransfectionStudy gene functionStudy protein expressionTransfer DNA into embryonic stem cells2021/1/540How it worksUtilize Chemical,lipid or physical methods(direct microinjection,electroporation,biolistic particle delivery)for transportation of genetic materials or macromolecules.2021/1/541How it works Chemical and lipid methodsNeutralize negative charges on DNAChemical method:Calcium phosphate;creates precipitates that settle on cells and are taken in.Lipid or Polymer methods:interact with DNA,promotes binding to cells and uptake via endocytosis.2021/1/5422021/1/543How it works Physical methodsElectroporation:use of high voltage to deliver nucleic acids;pores are formed on cell membrane.Direct Microinjection:Use of a fine needle.Has been used for transfer of DNA into embryonic stem cells.Biolistic Particle delivery:Uses high-velocity for delivery of nucleic acids and penetration of cell wall.2021/1/5442021/1/545Experimental method/process(chemical methods)HBS=HEPES-Buffered Saline2021/1/546Advantages/Disadvantages Advantages:Provides the ability to transfer in negatively charged molecules into cells with a negatively charged membrane.Liposome-mediated transport of DNA has high efficiency.Good for long-term studies requiring incorporation of genetic material into the chromosome.Disadvantages:Chemical Reagents:not useful for long-term studies.Transfection efficiency is dependent on cell health,DNA quality,DNA quantity,confluency(40-80%)Direct Microinjection and Biolistic Particle delivery is an expensive and at times a difficult method.2021/1/547脂质体转染绿色荧光蛋白质粒结果Invitrogen阳离子脂质体转染指南2021/1/548脂质体转染绿色荧光蛋白融合的目标基因表达定位在胞质2021/1/549四、流式细胞术2021/1/550Injector TipFluorescenceFluorescencesignalssignalsFocused laserFocused laserbeambeamSheath fluidFlowcytometry流式细胞术（流式细胞术（Flow Cytometry,简称简称FCM）2021/1/551FluorescenceFALS SensorFluorescence detector(PMT3,PMT4 etc.)2021/1/552 Data Data ProcessingProcessingFL2FL1SSCFSCFL4FL32021/1/553基因转染细胞的分选基因转染细胞的分选绿色萤光蛋白分析（GFP）：左图显示Hela细胞转染了减毒Mengo病毒vM16，其中含转染后8小时与病毒L肽链融合的GFP。直方图显示59细胞表达该肽链，并显示不同的表达水平。重叠的红线表示阴性对照。2021/1/554What can Flow Cytometer tell us about a cell?Cell Lineage/Subset PhenotypeCytokine/ChemokineProduction RepertoireCytokine/ChemokineReceptor RepertoireMigration/Homing PhenotypreCell cycle status2021/1/555细胞结构细胞结构=细胞大小细胞大小=细胞粒度细胞粒度=细胞表面面积细胞表面面积=核浆比例核浆比例=DNA含量与细胞周期含量与细胞周期=RNA含量含量=蛋白质含量蛋白质含量=染色体分析染色体分析 细胞功能细胞功能=细胞表面细胞表面/胞浆胞浆/核的特核的特异性抗原异性抗原=细胞活性细胞活性=细胞内细胞因子细胞内细胞因子=酶活性酶活性=激素结合位点激素结合位点=细胞受体细胞受体=细胞凋亡细胞凋亡在上述信号基础上的细胞分选在上述信号基础上的细胞分选流式细胞术的细胞学应用流式细胞术的细胞学应用2021/1/556直接染色Fluorescent probe attached to antibodySpecific signal:weakNonspecific binding:low2021/1/557间接染色Fluorescent probe attached to a 2nd antibodySpecific signal:strong,5-6 2nd Ab/each 1st Ab;Nonspecific binding:high2021/1/558Avidin-Biotin method Ibiotinylated primary Abbiotinavidinbiotinylated dye2021/1/559Propidium IodideDNAExcitationEmisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nmFluorescein(FITC)500 nmWavelengthProtein300 nm 400 nm 500 nm 600 nmExcitationEmissonPhycoerytherin(PE)ExcitationEmisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nmProteinAllophycocyanin(APC)ProteinExcitation Emisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm632.5 nm(HeNe)2021/1/560Cells Cycles细胞内DNA含量增殖相关基因的表达BrdU的结合示踪染料2021/1/561G2MGG0 0GG1 1s0 200 400 600 8001000GG0 0GG1 1sG2MDNA AnalysisDNA AnalysisDNA contentCount2N2N4N4NNormal Cell Cycle 2021/1/562A typical DNA HistogramG0-G1SG2-MFluorescence Intensity#of Events2021/1/563红色为正常二倍体细胞；黄色为异倍体细胞2021/1/564 增殖相关基因增殖相关基因PCNA(Proliferating cell nuclear antigen)一种蛋白质，在DNA复制和核苷酸的切除修复中起到作用Ki-67-proliferation related antigenKi-S1-proliferation related antigenPhospho-histoneCyclin D1,E,A,B1 2021/1/565 BrdUrd IncorporationBromodeoxyuridine(BrdU)是一个胸腺核苷的类似物 能够在细胞增殖和细胞周期状态分析中起作用BrdU能与正在复制周期内的细胞相结合使用BrdU抗体能够检测到BrdU2021/1/566 BrdUrd Incorporation2021/1/567Tracing Dye(CFSE)CFSE是一种示踪染料，能够均等地在两个子代细胞中分布，其结果可以区分出8-10代的子细胞。细胞分裂2021/1/568 Apoptotic Cell Death-a genetically encoded cell death program,which is morphologically,biochemically and molecularly distinct from necrosis2021/1/569Flow cytometry of apoptotic cell death荧光吸收细胞的胞膜对于DNA染料的通透性和细胞的活性、死亡和凋亡相关，像PI、EB、Hoechst-33342等，可以用来区分活细胞、死细胞和凋亡细胞2021/1/570Flow cytometry of apoptotic cell deathFCM of Caspases通过抗体和活化的caspase-3片断相结合来检测 使用特异性的caspase-3荧光底物新的抗原决定基CK182021/1/571Flow cytometry of apoptotic cell death Phospholipid redistribution Phospholipid redistribution2021/1/5722021/1/573Flow cytometry of apoptotic cell death细胞DNA含量 在凋亡细胞中，用PI染色，通过流式检测DNA含量，可以发现一种亚群的细胞，其染色荧光强度下降。这是由于随着调亡的进行，核酸内切酶活化，随后一部分DNA泄漏出去，造成细胞内DNA含量下降造成的。2021/1/574Flow Cytometry of Apoptotic CellsPI-Fluorescence#EventsApoptotic cellsNormal G0/G1 cells2021/1/5752021/1/576谢谢大家！