细胞增殖检测--课件

细胞增殖活性与凋亡的形态学检细胞增殖活性与凋亡的形态学检测方法测方法1ppt课件细胞增殖胞增殖细胞凋亡胞凋亡2ppt课件细胞增殖检测细胞增殖检测Methods for studying cell proliferation and viability in cell populations3ppt课件细胞周期细胞周期 细胞周期（胞周期（cell cycle)是指是指细胞从前一胞从前一次分裂次分裂结束起到下一次分裂束起到下一次分裂结束束为止止的活的活动过程，分程，分为间期与分裂期两个期与分裂期两个阶段。段。4ppt课件（一）（一）间期：分期：分为三期、即三期、即DNA合成前期（合成前期（G1）、）、DNA合成期（合成期（S）与与DNA合成后期（合成后期（G2）。）。（二）分裂期（二）分裂期：细胞的有胞的有丝分裂（分裂（M）需）需经前、中、后，末期，是前、中、后，末期，是一个一个连续变化化过程，由一个母程，由一个母细胞分裂成胞分裂成为两个子两个子细胞。胞。5ppt课件6ppt课件细胞增殖检测方法细胞增殖检测方法 目前主要有两种目前主要有两种检测细胞增殖能力的方法。胞增殖能力的方法。直接方法直接方法:通通过直接直接测定定进行分裂的行分裂的细胞数来胞数来评价价细胞的增殖能力。胞的增殖能力。（DNA synthesis）间接方法接方法:细胞活力胞活力检测方法，通方法，通过检测样品中健康品中健康细胞的数目来胞的数目来评价价细胞的增殖能力。（胞的增殖能力。（metabolic activity）7ppt课件直接方法直接方法:胸腺胸腺嘧啶核苷（核苷（3H-TdR）渗入法）渗入法 Brdu检测法法间接方法：接方法：MTT检测法法 羟基基荧光素二醋酸光素二醋酸盐琥珀琥珀酰亚胺脂（胺脂（CFSE）检测法法8ppt课件(一一)胸腺嘧啶核苷（胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）渗入法）渗入法胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，是DNA合成的必需物质。用同位素3H标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DAN合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DAN的代谢及细胞增殖情况。但是具有放射性。9ppt课件10ppt课件(二二)Brdu检测法检测法为常用的方法。常用的方法。用用BrdU（5-溴脱氧尿溴脱氧尿嘧啶核苷）核苷）预处理的理的细胞胞中，中，BrdU可代替胸腺可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的核苷插入复制的DNA双双链中，而且中，而且这种置种置换可以可以稳定存在，并定存在，并 带到子到子代代细胞中。胞中。细胞胞经过固定和固定和变性性处理后，可用免疫学方法理后，可用免疫学方法检测DNA中中BrdU的含量（如采用鼠抗的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆克隆抗体特异抗体特异识别BrdU,再采用辣根再采用辣根过氧氧 化化酶标记的的山羊抗鼠山羊抗鼠IgG二抗二抗标记，最后用比色法或，最后用比色法或荧光的光的方法方法进行定量行定量测定），从而判断定），从而判断细胞的增殖能力。胞的增殖能力。11ppt课件12ppt课件13ppt课件间接方法间接方法在一些情况下，细胞活力的检测相当于细胞增殖能力的测定。主要采用特殊的试剂MTT MTT及其他四唑盐来测定细胞的代谢活力，通过检测细胞的氧化还原活性来检测细胞增殖能力.14ppt课件(三三)MTT检测法检测法MTT检测法主要反映细胞的能量代谢，是检测细胞增殖活力的一种简便准确的方法。其原理是在活细胞生长和增殖过程中，线粒体内的脱氢酶可将黄色的MTT分解成兰紫色的甲臜（Formazan），生成的甲臜量的多少与细胞的数量和细胞的活力成正比 15ppt课件16ppt课件17ppt课件18ppt课件19ppt课件(四四)羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）检测法）检测法羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧 光素二醋酸盐基团，使CFSE成为一种良好的细胞标记物。CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。当细胞分裂时，CFSE标记荧光可平均分配至两个子 代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测 通道可对其进行分析。20ppt课件细胞凋亡检测方法细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系 列基因的激活、表达以及调控等的作用，它不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。21ppt课件22ppt课件23ppt课件区别点细胞凋亡细胞坏死起因生理或病理性病理性变化或剧烈损伤范围单个散在细胞大片组织或成群细胞细胞膜保持完整，一直到形成凋亡小体破损染色质凝聚在核膜下呈半月状呈絮状细胞器无明显变化肿胀、内质网崩解细胞体积固缩变小肿胀变大凋亡小体有，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬无，细胞自溶，残余碎片被巨噬细胞吞噬基因组DNA有控降解，电泳图谱呈梯状随机降解，电泳图谱呈涂抹状蛋白质合成有无调节过程受基因调控被动进行炎症反应无，不释放细胞内容物有，释放内容物。24ppt课件25ppt课件26ppt课件27ppt课件28ppt课件细胞凋亡的生物学特征细胞凋亡的生物学特征1形态学变化2生物化学变化1）DNA的片段化 2）大分子合成29ppt课件（一）细胞凋亡的形态学检测（一）细胞凋亡的形态学检测 1 光学显微镜和倒置显微镜 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 3 透射电子显微镜观察 4 TUNEL法 30ppt课件31ppt课件32ppt课件33ppt课件 DNA片断化检测片断化检测 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成180200bp整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。34ppt课件35ppt课件 TUNEL法法 细胞凋亡中胞凋亡中,染色体染色体DNA双双链断裂或断裂或单链断裂而断裂而产生大量生大量的粘性的粘性3-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、光素、过氧氧化物化物 酶、碱性磷酸、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物或生物素形成的衍生物标记到到DNA的的3-末端，从而可末端，从而可进行凋亡行凋亡细胞的胞的检测，这类方法称方法称为脱氧核糖核苷酸末端脱氧核糖核苷酸末端转移移酶介介导的缺口末端的缺口末端标记法法（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL（TdT mediated dUTP nick end labeling）。由于正常的或正在增殖的）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有胞几乎没有DNA的断裂，因而没有的断裂，因而没有3-OH形成，很少能形成，很少能够被染色。被染色。36ppt课件TUNEL是分子生物学与形是分子生物学与形态学相学相结合合 的研究方的研究方法，法，对完整的完整的单个凋亡个凋亡细胞核或凋亡小体胞核或凋亡小体进行原行原位染色，能准确地反位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学胞凋亡典型的生物化学和形和形态特征特征可用于石蜡包埋可用于石蜡包埋组织切片、冰切片、冰冻组织切片、培切片、培 养的养的细胞和从胞和从组织中分离的中分离的细胞的胞的细胞形胞形态测定，定，并可并可检测出极少量的凋亡出极少量的凋亡细胞，因而在胞，因而在细胞凋亡胞凋亡的研究中被广的研究中被广 泛采用。泛采用。37ppt课件再见！再见！38ppt课件