第二章蛋白质化学资料课件

第二章第二章蛋白质化学蛋白质化学第二章第二章 蛋白质化学蛋白质化学学习要求学习要求氨基酸氨基酸肽肽蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构概述概述蛋白质的结构与功能蛋白质的结构与功能蛋白质的性质及纯化蛋白质的性质及纯化学习要求学习要求1.1.了解蛋白质的分类和生物功能。了解蛋白质的分类和生物功能。2.2.了解氨基酸分类、结构、重要化学反应，重点弄了解氨基酸分类、结构、重要化学反应，重点弄清楚它的两性性质清楚它的两性性质,pI pI。3.3.弄清楚蛋白质的一级结构及其序列分析方法。了弄清楚蛋白质的一级结构及其序列分析方法。了解二、三和四级结构基本概念。解二、三和四级结构基本概念。4.4.了解蛋白质的重要理化性质。了解蛋白质的重要理化性质。5.5.了解蛋白质分离、纯化方法及其理论依据。了解蛋白质分离、纯化方法及其理论依据。6.6.有那些结合蛋白？它们的分布、特性和生物功能。有那些结合蛋白？它们的分布、特性和生物功能。2.1 2.1 概述概述蛋白质组成蛋白质组成n n组成基本单位组成基本单位n主要组成元素为碳、氢、氧、氮主要组成元素为碳、氢、氧、氮n有的还含有硫、磷、碘或金属元素有的还含有硫、磷、碘或金属元素（如铁、铜、锌等）（如铁、铜、锌等）nN的含量：的含量：16%氨基酸2.1 2.1 概述概述蛋白质的常见分类方法蛋白质的常见分类方法n1 1根据蛋白质的化学组成根据蛋白质的化学组成 n2 2根据蛋白质的溶解性和组成根据蛋白质的溶解性和组成n3 3根据蛋白质分子形状根据蛋白质分子形状n4 4根据蛋白质生物功能根据蛋白质生物功能 简单蛋白质和结合蛋白质分类表球状蛋白质和纤维状蛋白质活性蛋白质和非活性蛋白质类别特点及分布举例简单蛋白质清蛋白溶于水，需饱和硫酸铵才能沉淀。广泛分布于一切生物体中血清清蛋白、乳清蛋白球蛋白globulins微溶于水，溶于稀盐溶液，需半饱和硫酸铵沉淀。分布普遍血清球蛋白、肌球蛋白、大豆球蛋白等谷蛋白不溶于水、醇及中性盐溶液，易溶于稀酸或稀碱。各种谷物中米谷蛋白、麦谷蛋白醇溶蛋白不溶于水，溶于7080乙醇中玉米蛋白精蛋白溶于水及稀酸，不溶于氨水，是碱性蛋白，含His.Arg多蛙精蛋白组蛋白溶于水及稀酸，能溶于氨水，碱性蛋白，含His.Lys多小牛胸腺组蛋白硬蛋白不溶于水、盐、稀酸或稀碱溶液。分布于动物体内结缔组织，毛、发、蹄、角等角蛋白、胶原、弹性蛋白、丝心蛋白等结合蛋白质核蛋白辅基是核酸。存在于一切细胞中核糖体、脱氧核糖核蛋白体脂蛋白与脂类结合而成。广泛分布于一切细胞中卵黄蛋白、血清-脂蛋白糖蛋白与糖类结合而成粘蛋白、-球蛋白、膜蛋白等磷蛋白以丝苏残基的-OH与磷酸成酯键结合而成。乳、蛋等生物材料中酪蛋白、卵黄蛋白色蛋白辅基为血红素。存在于一切生物体中血红蛋白、细胞色素等2.1 2.1 概述概述蛋白质蛋白质的重要作用的重要作用n 蛋蛋白白质质作作为为生生命命现现象象的的物物质质基基础础之之一一，构构成成一一切切细细胞胞和和组组织织结结构构的的最最重重要要的的组组成成成成分分，参参与与生生物物体体内内许多方面的许多方面的重要功能重要功能。2.1 2.1 概述概述蛋白质蛋白质的重要作用的重要作用n（一）酶的催化作用（一）酶的催化作用n（二）调节功能：胰岛素（二）调节功能：胰岛素n（三）结构支持作用：胶原蛋白（三）结构支持作用：胶原蛋白n（四）运输功能：血红蛋白（四）运输功能：血红蛋白n（五）免疫功能：抗体（五）免疫功能：抗体n（六）运动功能：肌动蛋白，肌球蛋白（六）运动功能：肌动蛋白，肌球蛋白n（七）储藏功能：脂类与血浆蛋白结合（七）储藏功能：脂类与血浆蛋白结合n（八）生物膜功能（八）生物膜功能2.2 2.2 氨基酸氨基酸n蛋白质的水解蛋白质的水解 产生产生氨基酸的基本手段氨基酸的基本手段n氨基酸的氨基酸的结构与分类结构与分类n氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质2.2.1 2.2.1 蛋白质的水解蛋白质的水解产生产生氨基酸的基本手段氨基酸的基本手段n酸水解酸水解nHCl;H2SO4n碱水解碱水解nNaOH;Ba(OH)2n蛋白酶蛋白酶2.2.2 2.2.2 氨基酸的氨基酸的结构与分类结构与分类n蛋白质是由蛋白质是由2020种基本种基本氨基酸氨基酸组成的。组成的。2.2.2 2.2.2 氨基酸的氨基酸的结构与分结构与分类类n-氨基酸有两种氨基酸有两种构型：构型：D构型和构型和L构型构型n它们是与甘油醛或乳酸相比较而决定的。凡是与它们是与甘油醛或乳酸相比较而决定的。凡是与L甘油醛（或甘油醛（或L乳酸）构型相同的，就定义乳酸）构型相同的，就定义为为L氨基酸，反之为氨基酸，反之为D氨基酸。氨基酸。2.2.2 2.2.2 氨基酸的氨基酸的结构与分结构与分类类2.2.2 2.2.2 氨基酸的氨基酸的结构与分结构与分类类2.2.2 2.2.2 氨基酸的氨基酸的结构与分类结构与分类n根据酸碱性质根据酸碱性质n根据根据R基的化学结构基的化学结构n根据根据R基的极性基的极性2.2.2 2.2.2 氨基酸的氨基酸的结构与分类结构与分类根据酸碱性质n酸性氨基酸酸性氨基酸n碱性氨基酸碱性氨基酸n中性氨基酸中性氨基酸2.2.2 2.2.2 氨基酸的氨基酸的结构与分类结构与分类根据R基的结构n芳香族氨基酸芳香族氨基酸n杂环氨基酸杂环氨基酸n杂环亚氨基酸杂环亚氨基酸n脂肪族氨基酸脂肪族氨基酸2.2.2 2.2.2 氨基酸的氨基酸的结构与分类结构与分类根据R基的极性非极性氨基酸非极性氨基酸不带电荷的极性氨基酸不带电荷的极性氨基酸带正电荷的碱性氨基酸带正电荷的碱性氨基酸带负电荷的酸性氨基酸带负电荷的酸性氨基酸Asp GluLys ArgHisSer Thr TyrAsn Gln CysGlyAla Val IleAla Val IleLeu Pro MetLeu Pro Met Phe Trp Phe Trp 2.2.2 2.2.2 氨基酸的氨基酸的结构与分类结构与分类稀有氨基酸稀有氨基酸(非编码氨基酸非编码氨基酸)n稀有氨基酸稀有氨基酸(非编码氨基酸非编码氨基酸)属于氨基酸的衍生属于氨基酸的衍生物，也称为修饰氨基酸。物，也称为修饰氨基酸。n如：胱氨酸、羟赖氨酸、羟脯氨酸、如：胱氨酸、羟赖氨酸、羟脯氨酸、L-L-甲状腺甲状腺素等。素等。2.2.2 2.2.2 氨基酸的氨基酸的结构与分类结构与分类稀有氨基酸稀有氨基酸羟脯氨酸羟脯氨酸羟赖氨酸羟赖氨酸2.2.2 2.2.2 氨基酸的氨基酸的结构与分类结构与分类稀有氨基酸稀有氨基酸n不是蛋白质的组成成分；不是蛋白质的组成成分；n以游离或结合的形式存在于生物界；以游离或结合的形式存在于生物界；n大都是常见氨基酸的衍生物；大都是常见氨基酸的衍生物；n还有些是还有些是-,-,-,-,-,-,和和D-D-型氨基酸。型氨基酸。2.2.3 2.2.3 氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质p一般物理性质一般物理性质p氨基酸的酸碱性质氨基酸的酸碱性质p氨基酸的光吸收性氨基酸的光吸收性p氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应2.2.3 2.2.3 氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质一般物理性质一般物理性质n-氨基酸为无色晶体，不同氨基酸其晶氨基酸为无色晶体，不同氨基酸其晶体形状不相同；体形状不相同；n氨基酸熔点一般在氨基酸熔点一般在200300C；n氨基酸的溶解度；氨基酸的溶解度；n各种氨基酸有不同的味感：谷氨酸钠；各种氨基酸有不同的味感：谷氨酸钠；n氨基酸的氨基酸的比旋光度。比旋光度。2.2.3 2.2.3 氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质氨基酸的酸碱性质氨基酸的酸碱性质n氨基酸在水溶液中或在晶体状态时主要是以氨基酸在水溶液中或在晶体状态时主要是以两性离子两性离子的形式存在。的形式存在。2.2.3 2.2.3 氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质氨基酸的酸碱性质氨基酸的酸碱性质n重要概念：氨基酸的重要概念：氨基酸的等电点等电点 pIpIpI=1/2(pK1+pK2)2.2.3 2.2.3 氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质氨基酸的酸碱性质氨基酸的酸碱性质n以谷氨酸为例：以谷氨酸为例：npI=1/2(pK1+pKR)1/2(2.19+4.25)=3.222.2.3 2.2.3 氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质氨基酸的酸碱性质氨基酸的酸碱性质n小结：小结：n在等电点以上的任何在等电点以上的任何pH，氨基酸带净负电氨基酸带净负电荷，在电场中将向正极移动；荷，在电场中将向正极移动；n在低于等电点的任何在低于等电点的任何pH，氨基酸带净正电氨基酸带净正电荷，在电场中将向负极移动荷，在电场中将向负极移动;n在一定在一定pH范围内，氨基酸溶液的范围内，氨基酸溶液的pH离等电离等电点愈远，氨基酸所携带的净电荷愈大。点愈远，氨基酸所携带的净电荷愈大。2.2.3 2.2.3 氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质氨基酸的氨基酸的光吸收性光吸收性n芳香族侧链有紫芳香族侧链有紫外吸收，所以测外吸收，所以测定定280280nmnm处的吸收，处的吸收，是定量蛋白质浓是定量蛋白质浓度最常用的方法。度最常用的方法。芳香族氨基酸在芳香族氨基酸在pH8pH8时紫外吸收光谱时紫外吸收光谱2.2.3 2.2.3 氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质氨基酸的氨基酸的光吸收性光吸收性紫外吸收性受溶液紫外吸收性受溶液pH的影响的影响2.2.3 2.2.3 氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应n-氨基参与氨基参与 n-羧基参与羧基参与n-氨基和氨基和-羧基共同参与羧基共同参与n侧链侧链R R基参与基参与2.2.3 2.2.3 氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应n-氨基参与氨基参与(1)与亚硝酸反应与亚硝酸反应2.2.3 2.2.3 氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应n-氨基参与氨基参与(2)与甲醛反应与甲醛反应2.2.3 2.2.3 氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应n-氨基参与氨基参与(3)与与2,4-二硝基氟苯反应二硝基氟苯反应2.2.3 2.2.3 氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应n-氨基参与氨基参与(4)(4)酰化反应酰化反应2.2.3 2.2.3 氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应n-氨基参与氨基参与(5)成盐反应成盐反应2.2.3 2.2.3 氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应n-氨基参与氨基参与(6)成成Schiffs Base反应反应2.2.3 2.2.3 氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应n-氨基参与氨基参与(7)脱氨基反应脱氨基反应2.2.3 2.2.3 氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应n-羧基参与羧基参与(1)成盐反应成盐反应2.2.3 2.2.3 氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应n-羧基参与羧基参与(2)成酯反应成酯反应2.2.3 2.2.3 氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应n-羧基参与羧基参与(3)酰化反应酰化反应2.2.3 2.2.3 氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应n-羧基参与羧基参与(4)脱羧反应脱羧反应2.2.3 2.2.3 氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应n-羧基参与羧基参与(5)叠氮反应叠氮反应2.2.3 2.2.3 氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应n-氨基和氨基和-羧基共同参与羧基共同参与(1)与茚三酮反应与茚三酮反应:n-氨基酸与水和茚三酮试剂共热，氨基酸与水和茚三酮试剂共热，可发生反应生成蓝紫化合物。可发生反应生成蓝紫化合物。n与脯氨酸和羟脯氨酸反应则生成与脯氨酸和羟脯氨酸反应则生成黄色化合物，反应生成物的颜色黄色化合物，反应生成物的颜色深浅程度以及深浅程度以及CO2生成量，均可生成量，均可作为氨基酸定量分析依据。作为氨基酸定量分析依据。2.2.3 2.2.3 氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应n-氨基和氨基和-羧基共同参与羧基共同参与(2)成肽反应成肽反应2.2.3 2.2.3 氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质氨基酸的化学反应氨基酸的化学反应n侧链侧链R基参与基参与巯基及二硫键巯基及二硫键2.3 2.3 肽肽n肽的基本概念肽的基本概念n肽的命名肽的命名n生物活性肽生物活性肽2.3.1 2.3.1 肽的基本概念肽的基本概念n 一一分分子子氨氨基基酸酸的的-羧羧基基与与另另一一分分子子氨氨基基酸酸-氨氨基基脱脱水水缩缩合合的的化化合合物物叫叫做做肽肽，氨氨基基酸酸之之间间通通过过酰酰胺胺键键（蛋蛋白白质质化化学学中中将将这这类类酰酰胺胺键专称为键专称为肽键肽键）连接而成。）连接而成。2.3.1 2.3.1 肽的基本概念肽的基本概念肽键的形成肽键的形成n肽键具有双键性质；肽键具有双键性质；n-CO-NH-共平面，共平面，nC-N键长键长=0.132 nm，介于普通，介于普通C-N单键单键(0.149 nm)和和C=N双双键键(0.127 nm)之间之间2.3.1 2.3.1 肽的基本概念肽的基本概念n肽链肽链n氨基酸残基氨基酸残基n氨基末端氨基末端n羧基末端羧基末端n寡肽寡肽1010个以下氨基酸组成，二肽，三肽等个以下氨基酸组成，二肽，三肽等n多肽多肽2.3.1 2.3.1 肽的基本概念肽的基本概念肽与氨基酸的区别肽与氨基酸的区别n肽含有侧链肽含有侧链R基上的可解离基团基上的可解离基团n肽的可离子化程度低肽的可离子化程度低2.3.1 2.3.1 肽的基本概念肽的基本概念多肽多肽链链肽链中的氨基酸不是原来完整的分子，多肽链中的氨基酸不是原来完整的分子，多肽链中的氨基酸单位称为肽链中的氨基酸单位称为氨基酸残基氨基酸残基。肽键肽键链状结构链状结构2.3.2 2.3.2 肽的命名肽的命名n多多肽肽化化合合物物的的名名称称，通通常常按按照照肽肽内内氨氨基基酸酸残残基基的的排排列列顺顺序序，以以残残基基名名称称（如如某某某某氨氨酰酰）从从N N端端依依次次阅阅读读到到C C端端，并并以以C C端端残残基基全全名名结结束束肽肽的的名名称。称。n命名举例：命名举例：丙氨酰谷氨酰亮氨酰缬氨酰组氨酸丙氨酰谷氨酰亮氨酰缬氨酰组氨酸氨基末端羧基末端2.3.2 2.3.2 肽的命名肽的命名n在开链肽的在开链肽的N端端和和C端端可以有游离的可以有游离的氨基和氨基和羧基，而有羧基，而有的开链肽的的开链肽的N端或端或C端的游离的端的游离的氨基或氨基或羧基被别的基团羧基被别的基团结合（如结合（如烷基化烷基化、酰化等酰化等）或）或N端残基自身环化。端残基自身环化。n例如促甲状腺素释放激素的例如促甲状腺素释放激素的N端残基是谷氨酸，此残基易端残基是谷氨酸，此残基易于自身环化成焦谷氨酰基（于自身环化成焦谷氨酰基（氨基与谷氨酸的氨基与谷氨酸的羧基脱水羧基脱水缩和而成）。缩和而成）。2.3.3 2.3.3 生物活性肽生物活性肽谷胱甘肽谷胱甘肽它它的的分分子子中中有有一一个个特特殊殊的的肽肽键键，是是由由谷谷氨氨酸酸的的羧羧基基与与半半胱胱氨氨酸酸的的氨氨基基缩缩合合而而成成。由由于于GSH中中含含有有一一个个活活泼泼的的巯巯基基很很容容易易氧氧化化，二二分分子子GSH脱脱氢氢以以二二硫硫键键相相连连成成氧氧化化型型的的谷谷胱胱甘肽甘肽（GSSG）。）。2.3.3 2.3.3 生物活性肽生物活性肽谷胱甘肽谷胱甘肽n谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽三肽n谷氨酸的谷氨酸的-羧基羧基形成肽键形成肽键nSHSH为活性基团为活性基团n为为酸性肽酸性肽n是体内重要的是体内重要的还原剂还原剂2.3.3 2.3.3 生物活性肽生物活性肽谷胱甘肽的重要生物功能谷胱甘肽的重要生物功能n维护蛋白质活性中心的巯基；维护蛋白质活性中心的巯基；n参与二硫化合物相互转化；参与二硫化合物相互转化；n某些酶的辅酶，在体内氧化还原过程中起重某些酶的辅酶，在体内氧化还原过程中起重要的作用。要的作用。GSH过氧过氧化物酶化物酶H2O2 2GSH 2H2O GSSG GSH还原酶还原酶NADPH+H+NADP+2.3.3 2.3.3 生物活性肽生物活性肽其它其它n神经肽：神经肽：脑啡肽，内啡肽，强啡肽，脑啡肽，内啡肽，强啡肽，P-P-物质物质n抗生素抗生素n激素激素2.3.3 2.3.3 生物活性肽生物活性肽抗生素抗生素2.3.3 2.3.3 生物活性肽生物活性肽激素激素2.3.3 2.3.3 生物活性肽生物活性肽应用发展应用发展n生物的生长、发育、细胞分化、大脑活动、肿生物的生长、发育、细胞分化、大脑活动、肿瘤病变、免疫防御、生殖控制、抗衰老、生物瘤病变、免疫防御、生殖控制、抗衰老、生物钟规律及分子进化等均涉及到钟规律及分子进化等均涉及到活性肽活性肽。生物活。生物活性肽是机体内传递信息、调节代谢和协调器官性肽是机体内传递信息、调节代谢和协调器官活动的重要活动的重要化学信使化学信使。n近年来，多肽的分离纯化、结构分析、化学合近年来，多肽的分离纯化、结构分析、化学合成、生物、放射免疫测定、免疫细胞化学以及成、生物、放射免疫测定、免疫细胞化学以及遗传工程等新技术的应用，新的活性肽不断发遗传工程等新技术的应用，新的活性肽不断发现，对活性肽功能认识不断增长，促使这一领现，对活性肽功能认识不断增长，促使这一领域迅速发展。域迅速发展。蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构n分子结构层次：分子结构层次：n一级结构一级结构(primary structure)(primary structure)n二级结构二级结构(secondary structure)(secondary structure)n三级结构三级结构(tertiary structure)(tertiary structure)n四级结构四级结构(quaternary structure)(quaternary structure)高级结构高级结构2.4 2.4 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构n定义：定义：蛋白质的一级结构指多肽链中氨蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。基酸的排列顺序。n主要化学键：肽键主要化学键：肽键 二硫键二硫键的位置属于一级结构研究范畴。的位置属于一级结构研究范畴。2.4 2.4 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。能的基础。胰岛素的一级结构胰岛素的一级结构2.4 2.4 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构测定方法测定方法n(1)(1)氨基酸末端分析氨基酸末端分析，确定多，确定多肽链肽链数目数目n(2)(2)蛋白质中肽链的拆离蛋白质中肽链的拆离n(3)(3)多多肽链的氨基酸组成分析肽链的氨基酸组成分析n(4)(4)肽链的肽链的第一种方法的第一种方法的部分降解，肽片断的部分降解，肽片断的分离及氨基酸顺序测定分离及氨基酸顺序测定n(5)(5)肽链的肽链的第二种方法的第二种方法的部分降解，肽片断的部分降解，肽片断的分离及氨基酸顺序测定分离及氨基酸顺序测定n(6)(6)重建完整多重建完整多肽链肽链的的一级结构一级结构n(7)(7)二硫键与酰胺基的定位二硫键与酰胺基的定位2.4 2.4 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构测定方法测定方法n(1)(1)氨基酸末端分析氨基酸末端分析nN-N-末端分析末端分析nC-C-末端分析末端分析2.4 2.4 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构测定方法测定方法n(1)(1)氨基酸末端分析氨基酸末端分析N-N-末端分析末端分析n二硝基氟苯法（二硝基氟苯法（Sanger法）法）DNP-氨基酸更稳定氨基酸更稳定n异硫氰酸苯酯法（异硫氰酸苯酯法（Edman法）法）PTH-氨基酸更容易切断氨基酸更容易切断n二甲基氨基萘磺酰氯法（二甲基氨基萘磺酰氯法（DNS法）法）与与DNFB法原理相同法原理相同n氨肽酶法氨肽酶法 肽链外切酶肽链外切酶(exopeptidase)2.4 2.4 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构测定方法测定方法n(1)氨基酸末端分析氨基酸末端分析Sanger法法1945年由年由Sanger发明此法发明此法曾用此方法测曾用此方法测定了定了胰岛素胰岛素的的N-末端。末端。2.4 2.4 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构测定方法测定方法n(1)氨基酸末端分析氨基酸末端分析Edman法法2.4 2.4 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构测定方法测定方法n(1)氨基酸末端分析氨基酸末端分析DNS法法19561956年年HartleyHartley等提出等提出n灵敏度高灵敏度高(比比DNFB法提高法提高100倍倍)nDNS-氨基酸稳定氨基酸稳定性较高性较高2.4 2.4 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构测定方法测定方法n(1)(1)氨基酸末端分析氨基酸末端分析C-C-末端分析末端分析n肼解法肼解法n还原法还原法n羧肽酶法羧肽酶法2.4 2.4 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构测定方法测定方法n(1)氨基酸末端分析氨基酸末端分析肼解法肼解法2.4 2.4 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构测定方法测定方法n(1)(1)氨基酸末端分析氨基酸末端分析还原法还原法2.4 2.4 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构测定方法测定方法n(1)(1)氨基酸末端分析氨基酸末端分析羧肽酶法羧肽酶法n根据氨基酸释放的动力学曲线，可确定该肽根据氨基酸释放的动力学曲线，可确定该肽链的链的C端氨基酸顺序。端氨基酸顺序。2.4 2.4 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构测定方法测定方法n(2)(2)蛋白质中肽链的拆离蛋白质中肽链的拆离n肽链间的结合肽链间的结合:非共价键非共价键 血红蛋白（四聚体）血红蛋白（四聚体）烯醇化酶（二聚体）烯醇化酶（二聚体）共价键共价键 胰岛素胰岛素 免疫球蛋白等免疫球蛋白等2.4 2.4 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构测定方法测定方法n(2)(2)蛋白质中肽链的拆离蛋白质中肽链的拆离n非共价键连接的多肽链非共价键连接的多肽链 温和条件下可以解离（酸碱等）温和条件下可以解离（酸碱等）n通过通过二硫键二硫键连接的多肽链连接的多肽链 需要较强的条件将二硫键切断需要较强的条件将二硫键切断 还原法还原法 氧化法氧化法2.4 2.4 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构测定方法测定方法n(2)(2)蛋白质中肽链的拆离蛋白质中肽链的拆离n还原法还原法将将二硫键二硫键还原成还原成巯基巯基2.4 2.4 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构测定方法测定方法n(2)(2)蛋白质中肽链的拆离蛋白质中肽链的拆离n还原法还原法为防止巯基重新氧化，可用为防止巯基重新氧化，可用碘乙酸、碘乙酰胺等使其烷化。碘乙酸、碘乙酰胺等使其烷化。2.4 2.4 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构测定方法测定方法n(2)(2)蛋白质中肽链的拆离蛋白质中肽链的拆离n还原法还原法2.4 2.4 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构测定方法测定方法n(2)(2)蛋白质中肽链的拆离蛋白质中肽链的拆离n氧化法氧化法二硫键用过甲二硫键用过甲酸氧化为磺酸基而拆开酸氧化为磺酸基而拆开2.4 2.4 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构测定方法测定方法n(3)(3)多多肽链的氨基酸组成分析肽链的氨基酸组成分析2.4 2.4 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构测定方法测定方法n(3)(3)多多肽链的氨基酸组成分析肽链的氨基酸组成分析2.4 2.4 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构测定方法测定方法n(4)(4)肽链的部分降解及肽片断的分离肽链的部分降解及肽片断的分离n化学裂解法化学裂解法 溴化氰裂解溴化氰裂解 部分酸水解部分酸水解n酶水解法酶水解法2.4 2.4 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构测定方法测定方法n(4)(4)肽链的部分降解肽链的部分降解及肽片断的分离及肽片断的分离溴化氰法溴化氰法溴化氰对溴化氰对甲硫甲硫氨酸羧基氨酸羧基形成形成的肽键特异的肽键特异2.4 2.4 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构测定方法测定方法n(4)(4)肽链的部分降解及肽片断的分离肽链的部分降解及肽片断的分离n酶水解法酶水解法n常用的酶有：常用的酶有：胰蛋白酶；胰凝乳蛋白酶；胃蛋白酶；嗜胰蛋白酶；胰凝乳蛋白酶；胃蛋白酶；嗜热菌蛋白酶等。热菌蛋白酶等。n优越性：优越性：较高专一性；水解产率较高。较高专一性；水解产率较高。2.4 2.4 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构测定方法测定方法n(5)(5)肽段氨基酸顺序测定肽段氨基酸顺序测定nEdman降解法降解法nDNS-Edman方法方法n酶解法酶解法顺序分析的最主要的方法 使测定灵敏度进一步提高2.4 2.4 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构测定方法测定方法n(6)(6)重建完整多重建完整多肽链肽链的一级结构的一级结构n肽段重叠法肽段重叠法2.4 2.4 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构测定方法测定方法n(7)(7)二硫键的定位二硫键的定位n将含二硫键的肽段进行酶解，分离出含二硫将含二硫键的肽段进行酶解，分离出含二硫键的肽，对该肽进行氧化或还原，切断二硫键的肽，对该肽进行氧化或还原，切断二硫键，生成二个小肽段，将这两个小肽段与原键，生成二个小肽段，将这两个小肽段与原肽链氨基酸顺序进行比较，即可确定二硫键肽链氨基酸顺序进行比较，即可确定二硫键位置。位置。2.5 2.5 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构n1.蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构n2.超二级结构超二级结构n3.蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构n4.结构域结构域n5.蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构n6.维持蛋白质分子构象的化学键维持蛋白质分子构象的化学键2.5 2.5 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构肽平面肽平面n参与组成肽键的参与组成肽键的6 6个原子位于同一平面，又个原子位于同一平面，又叫酰胺平面或肽键平面。它是蛋白质构象的叫酰胺平面或肽键平面。它是蛋白质构象的基本结构单位。基本结构单位。肽肽键键的的键键长长和和键键角角肽平面肽平面2.5 2.5 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构二级结构二级结构多多肽肽链链借借助助氢氢键键排排列列成成沿沿一一个个方方向向的的具具有有周周期期性性结结构构的的构构象象，限限于于肽肽链链主主链链骨骨架架原原子子的的局局部部空间排列，并不涉及空间排列，并不涉及氨基酸残基侧链氨基酸残基侧链的构象。的构象。n n -螺旋螺旋螺旋螺旋 (-helix)-helix)-helix)-helix)n n -折叠折叠折叠折叠 (-pleated sheet)-pleated sheet)-pleated sheet)-pleated sheet)n n -转角转角转角转角 (-turn)-turn)-turn)-turn)n n无规卷曲无规卷曲无规卷曲无规卷曲 (random coil)(random coil)(random coil)(random coil)2.5 2.5 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构二级结构：二级结构：-螺旋螺旋n n结构要点：结构要点：结构要点：结构要点：n多肽链主链围绕中心轴形成多肽链主链围绕中心轴形成右手右手螺旋，侧链螺旋，侧链伸向螺旋外侧。伸向螺旋外侧。n每圈螺旋含每圈螺旋含3.63.6个氨基酸个氨基酸，螺距为，螺距为0.54nm0.54nm，每个氨基酸上升，每个氨基酸上升0.15nm0.15nm，每个氨基酸旋转每个氨基酸旋转100100。n每个肽键的亚氨氢和第四个肽键每个肽键的亚氨氢和第四个肽键的羰基氧形成的氢键保持螺旋稳定。的羰基氧形成的氢键保持螺旋稳定。氢键氢键与螺旋长轴基本平行。与螺旋长轴基本平行。-螺旋螺旋结构的结构的主要特点主要特点俯视图俯视图-螺旋结构的主要特点螺旋结构的主要特点2.5 2.5 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构二级结构：二级结构：-折叠折叠n n结构要点结构要点结构要点结构要点:n多肽链充分伸展多肽链充分伸展n相邻肽单元之间折叠成相邻肽单元之间折叠成锯齿状锯齿状结构结构n相邻肽链间的肽键之间形成氢键，以稳固相邻肽链间的肽键之间形成氢键，以稳固-折叠结构。氢折叠结构。氢键几乎垂直于肽链键几乎垂直于肽链n侧链位于锯齿结构的上下方侧链位于锯齿结构的上下方n两段以上的两段以上的-折叠结构平行排列折叠结构平行排列，可顺向平行，也可反向，可顺向平行，也可反向平行平行-折叠结构的主要特点折叠结构的主要特点平行平行-折叠折叠-折叠结构的主要特点折叠结构的主要特点反平行反平行折叠折叠-折叠结构的主要特点折叠结构的主要特点折叠片示意图折叠片示意图2.5 2.5 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构二级结构：二级结构：-转角转角肽链内形成肽链内形成180180 回折回折。含含4 4个氨基酸残基，个氨基酸残基，第第1 1个氨基酸残基与第个氨基酸残基与第4 4个个形成氢键形成氢键。第二个氨基酸残基常为第二个氨基酸残基常为ProPro。转角结构通常负责各种二级结构单元之间的连转角结构通常负责各种二级结构单元之间的连接作用，它对于确定肽链的走向起着决定性的接作用，它对于确定肽链的走向起着决定性的作用。作用。-转角结构的主要特点转角结构的主要特点各类氨基酸与蛋白质二级结构关系各类氨基酸与蛋白质二级结构关系2.5 2.5 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构二级结构：影响因素二级结构：影响因素p影响影响-螺旋形成的因素：螺旋形成的因素：p氨基酸侧链所带电荷氨基酸侧链所带电荷 、大小及形状、大小及形状p -折叠形成条件：折叠形成条件：p要求氨基酸侧链较小要求氨基酸侧链较小2.5 2.5 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构超二级结构超二级结构n超二级结构是指二级结构的基本结构单位超二级结构是指二级结构的基本结构单位（螺旋、螺旋、折叠等）相互聚集，形成折叠等）相互聚集，形成有有规律规律的二级结构的聚集体。的二级结构的聚集体。n(1 1)n(2 2)n(3 3)迂回迂回n(4 4)折叠桶折叠桶n(5)(5)螺旋螺旋-转角转角-螺旋螺旋三级结构的构件三级结构的构件2.5 2.5 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构超二级结构超二级结构:(:(1)1)复绕复绕螺旋螺旋2.5 2.5 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构超二级结构超二级结构:(:(2 2)单元的手性单元的手性2.5 2.5 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构超二级结构超二级结构:(:(3 3)迂回迂回A.A.迂回迂回 B.B.希腊钥匙希腊钥匙 C.C.双希腊钥匙双希腊钥匙2.5 2.5 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构超二级结构超二级结构:(:(4 4)折叠桶折叠桶 反平行反平行折叠桶折叠桶折叠桶的各种形式折叠桶的各种形式2.5 2.5 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构超二超二级结构级结构:(:(5 5)螺旋螺旋-转角转角-螺旋螺旋A.A.噬菌体噬菌体 B.B.噬菌体噬菌体P P2222螺旋螺旋-转角转角-螺旋与螺旋与DNADNA的结合的结合2.5 2.5 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构三级结构三级结构n蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构指一条多肽链在二指一条多肽链在二级结构的基础上进级结构的基础上进一步卷曲折叠，构一步卷曲折叠，构成一个成一个不规则不规则的特的特定构象。包括全部定构象。包括全部主链和侧链在内的主链和侧链在内的所有原子的空间排所有原子的空间排布布，但不包括肽链但不包括肽链的相互关系的相互关系。2.5 2.5 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构三级结构：三级结构：稳定因素稳定因素疏水作用离子键氢键范德华力二硫键2.5 2.5 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构三级结构：三级结构：肌红蛋白肌红蛋白N 端端 C端端2.5 2.5 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构三级结构：三级结构：结构域结构域n大分子蛋白质大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行其功能，状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行其功能，称为结构域，是多肽链的独立折叠单位。称为结构域，是多肽链的独立折叠单位。n结构域的大小结构域的大小变化很大，常见的范围在变化很大，常见的范围在100-200100-200个个残基之间。残基之间。纤连蛋白分子的结构域纤连蛋白分子的结构域 2.5 2.5 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构三级结构：三级结构：结构域结构域木瓜蛋白酶内的木瓜蛋白酶内的2 2个结构域个结构域彼此很不相同彼此很不相同2.5 2.5 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构三级结构：三级结构：结构域结构域弹性蛋白酶的二个结构域弹性蛋白酶的二个结构域彼此非常相似彼此非常相似2.5 2.5 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构四级结构四级结构定义：由两条或两条以上各自独立具有定义：由两条或两条以上各自独立具有三级结构的多肽链通过三级结构的多肽链通过非共价键聚合非共价键聚合而而成的特定结构。成的特定结构。每条具有完整三级结构的多肽链，称为每条具有完整三级结构的多肽链，称为亚基亚基 (subunit)(subunit)。亚基之间的结合力主要是亚基之间的结合力主要是氢键和离子键氢键和离子键。2.5 2.5 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构四级结构四级结构血红蛋白血红蛋白(Hb)(Hb)的四级的四级结构结构2.5 2.5 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构四级结构四级结构n血红蛋白的结构：从一级到四级血红蛋白的结构：从一级到四级2.5 2.5 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构nYang,H.,M.Yang,Y.Ding,Y.Liu,Z.Lou,Z.Zhou,L.Sun,L.Mo,S.Ye,H.Pang,G.F.Gao,K.Anand,M.Bartlam,R.Hilgenfeld,and Z.Rao*.2003.The crystal structures of severe acute respiratory syndrome virus main protease and its complex with an inhibitor.Proc Natl Acad Sci U S A 100:13190.SARS-CoV main protease2.5 2.5 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构nDesign of wide-spectrum inhibitors targeting the SARS Mpro(left)Conservation in the substrate binding pocket among 5 CoV Mpro.(right)Surface representation of SARS-CoV Mpro in complex with the inhibitor N3.2.5 2.5 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构nDesign of wide-spectrum inhibitors targeting the SARS Mpro2.5 2.5 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构稳定因素稳定因素疏水作用疏水作用离子键离子键氢键氢键范德华力范德华力二硫键二硫键2.5 2.5 蛋白质的高级结构蛋白质的高级结构蛋白质构象的研究方法蛋白质构象的研究方法n测定蛋白质在溶液中的整体或部分构象：测定蛋白质在溶液中的整体或部分构象：n荧光光谱荧光光谱n紫外差吸收光谱紫外差吸收光谱n近紫外圆二色性光谱分析近紫外圆二色性光谱分析n蛋白质分子全部空间结构的测定：蛋白质分子全部空间结构的测定：nX X射线晶体衍射射线晶体衍射n多维核磁共振方法多维核磁共振方法(NMR)NMR)2.6 2.6 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系一级结构与功能的关系一级结构与功能的关系n一级结构是空间构象的基础一级结构是空间构象的基础牛核糖核酸酶牛核糖核酸酶的一级结构的一级结构二二硫硫键键2.6 2.6 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系一级结构与功能的关系一级结构与功能的关系天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性加入尿素、加入尿素、-巯基乙巯基乙醇醇去除尿素、去除尿素、-巯基乙巯基乙醇醇非折叠状态，非折叠状态，无无催化催化活性活性牛核糖核酸酶牛核糖核酸酶2.6 2.6 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系一级结构与功能的关系一级结构与功能的关系镰刀形红细胞贫血镰刀形红细胞贫血N-Val His Leu Thr Pro Glu Glu C(146)HbS 肽链肽链HbA 肽肽 链链N-Val His Leu Thr Pro Val Glu C(146)2.6 2.6 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系一级结构与功能的关系一级结构与功能的关系n由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病分子病”。2.6 2.6 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系一级结构与功能的关系一级结构与功能的关系n镰刀型红细胞贫血的分子基础镰刀型红细胞贫血的分子基础n结果：结果：荷负电的荷负电的GluGlu变为疏水性的变为疏水性的ValVal，使使HbSHbS分子分子表面的负电荷减少，亲水基团变为疏水基团，使表面的负电荷减少，亲水基团变为疏水基团，使HbSHbS分子聚合，溶解度降低，红细胞变形，呈镰刀分子聚合，溶解度降低，红细胞变形，呈镰刀状，并易于破裂溶血。状，并易于破裂溶血。n治疗：治疗：体外，体外，KCNOKCNO共价修饰共价修饰链链N N端端ValVal残基，使残基，使亲水性增加，可防止亲水性增加，可防止HbSHbS分子间的缔和。分子间的缔和。HbA:Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-LysHbS:Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys链链 1 2 3 4 5 6 7 82.6 2.6 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系空间结构与功能的关系空间结构与功能的关系肌红蛋白与血红蛋白肌红蛋白与血红蛋白N 端端 C端端2.6 2.6 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系空间结构与功能的关系空间结构与功能的关系n血红蛋白血红蛋白(Hb)(Hb)的构象变化与结合氧的构象变化与结合氧nHbHb与与MbMb一样能可逆地与一样能可逆地与O O2 2结合，结合，HbHb与与O O2 2结合后称为氧结合后称为氧合合HbHb。氧合。氧合HbHb占总占总HbHb的百分数（称百分饱和度）随的百分数（称百分饱和度）随O O2 2浓度变化而改变。浓度变化而改变。2.6 2.6 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系空间结构与功能的关系空间结构与功能的关系血红素血红素2.6 2.6 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系空间结构与功能的关系空间结构与功能的关系n协同效应协同效应(cooperativity)(cooperativity)n一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。的现象，称为协同效应。n促进作用称为正协同效应促进作用称为正协同效应 (positive(positive cooperativity)cooperativity)n抑制作用称为负协同效应抑制作用称为负协同效应(negative(negative cooperativity)cooperativity)2.6 2.6 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系空间结构与功能的关系空间结构与功能的关系n变构效应变构效应(allosteric effect)(allosteric effect)n凡蛋白质（或亚基）因与某小分子物质相互作凡蛋白质（或亚基）因与某小分子物质相互作用而发生构象变化，导致蛋白质（或亚基）功用而发生构象变化，导致蛋白质（或亚基）功能的变化，称为蛋白质的变构效应。能的变化，称为蛋白质的变构效应。2.6 2.6 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系空间结构与功能的关系空间结构与功能的关系n蛋白质构象改变与疾病蛋白质构象改变与疾病n蛋白质构象病：蛋白质构象病：若蛋白质的折叠发生错若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。时可导致疾病发生。2.6 2.6 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系空间结构与功能的关系空间结构与功能的关系n蛋白质构象病的机理：蛋白质构象病的机理：n有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。维沉淀的病理改变。n这类疾病包括：这类疾病包括：n人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等停顿舞蹈病、疯牛病等2.6 2.6 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系空间结构与功能的关系空间结构与功能的关系n疯牛病疯牛病n疯牛病是由朊病毒蛋白疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein,PrP)(prion protein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。引起的一组人和动物神经退行性病变。n正常的正常的PrPPrP富含富含-螺旋，称为螺旋，称为PrPcPrPc。PrPcPrPc在某在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠折叠的的PrPscPrPsc，从而致病。，从而致病。PrPc-螺旋螺旋PrPsc-折叠折叠正常正常疯牛病疯牛病2.7 2.7 蛋白质的性质及纯化蛋白质的性质及纯化n(1)(1)蛋白质的分子量蛋白质的分子量n1 1万万几百万几百万n(2)(2)蛋白质的两性电离蛋白质的两性电离n蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液基侧链中某些基团，在一定的溶液pHpH条件下都可解离条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。成带负电荷或正电荷的基团。2.7 2.7 蛋白质的性质及纯化蛋白质的性质及纯化n(2)蛋白质的两性电离蛋白质的两性电离n蛋白质的等电点蛋白质的等电点(isoelectric point,pI)n蛋白质溶液处于某一蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的为零，此时溶液的pH称为称为蛋白质的等电点蛋白质的等电点。n利利用用蛋蛋白白质质两两性性电电离离的的性性质质，可可通通过过电电泳泳、离离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。2.7 2.7 蛋白质的性质及纯化蛋白质的性质及纯化n(3)蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质n蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万万至至100万之巨，其分子的直径可达万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。为胶粒范围之内。n蛋白质胶体稳定的因素蛋白质胶体稳定的因素n颗粒表面电荷颗粒表面电荷n水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉2.7 2.7 蛋白质的性质及纯化蛋白质的性质及纯化n(3)蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质n1、透析、透析 2、盐析、盐析 3、凝胶过滤、凝胶过滤2.7 2.7 蛋白质的性质及纯化蛋白质的性质及纯化n透析透析(dialysis)：利用透利用透析袋把大分子蛋白质析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开与小分子化合物分开的方法。的方法。n超滤法：超滤法：应用正压或应用正压或离心力使蛋白质溶液离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。缩蛋白质溶液的目的。2.7 2.7 蛋白质的性质及纯化蛋白质的性质及纯化n(4)蛋白质的变性、沉淀和凝固蛋白质的变性、沉淀和凝固n蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturation)n在某些物理和化学因素作用下，蛋白质分子的在某些物理和化学因素作用下，蛋白质分子的特定空间构象被破坏，从而导致其理化性质特定空间构象被破坏，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。改变和生物活性的丧失。n变性的本质：变性的本质：破坏非共价键和二硫键，不改变破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。蛋白质的一级结构。n造成变性的因素：造成变性的因素：如加热、乙醇等有机溶剂、如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。2.7 2.7 蛋白质的性质及纯化蛋白质的性质及纯化n(4)蛋白质的变性、沉淀和凝固蛋白质的变性、沉淀和凝固n蛋白质变性后的性质改变蛋白质变性后的性质改变n溶解度降低、粘度增加、结晶能力消失、生物活性丧溶解度降低、粘度增加、结晶能力消失、生物活性丧失及易受蛋白酶水解。失及易受蛋白酶水解。n应用举例应用举例n临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。n防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。等）的必要条件。n复性复性(renaturation)n若蛋白质变性若蛋白质变性程度较轻程度较轻，去除变性因素后，蛋白质，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能。仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能。2.7 2.7 蛋白质的性质及纯化蛋白质的性质及纯化天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性加入尿素、加入尿素、-巯基乙巯基乙醇醇去除尿素、去除尿素、-巯基乙巯基乙醇醇非折叠状态，非折叠状态，无无催化催化活性活性牛核糖核酸酶牛核糖核酸酶2.7 2.7 蛋白质的性质及纯化蛋白质的性质及纯化n(4)蛋白质的变性、沉淀和凝固蛋白质的变性、沉淀和凝固n蛋白质沉淀蛋白质沉淀n在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链会相在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。n变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。并不变性。n蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用(protein coagulation)n蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。此凝块不易再溶于强酸和强碱中。2.7 2.7 蛋白质的性质及纯化蛋白质的性质及纯化n(5)蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收n由于蛋白质分子中含由于蛋白质分子中含有共轭双键的有共轭双键的酪氨酸酪氨酸和和色氨酸色氨酸，因此在，因此在280nm波长处有特征波长处有特征性吸收峰。蛋白质的性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正与其浓度呈正比关系，因此可作蛋比关系，因此可作蛋白质定量测定。白质定量测定。2.7 2.7 蛋白质的性质及纯化蛋白质的性质及纯化n(6)蛋白质的呈色反应蛋白质的呈色反应n茚三酮反应茚三酮反应(ninhydrin reaction)n蛋白质经水解后产生的蛋白质经水解后产生的氨基酸氨基酸也可发生茚也可发生茚三酮反应。三酮反应。n双缩脲反应双缩脲反应(biuret reaction)n蛋白质和多肽分子中蛋白质和多肽分子中肽键肽键在稀碱溶液中与在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为为双缩脲反应双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。白质水解程度。2.