聚丙烯酰胺凝胶电泳课件

电泳技术电泳技术（electrophoresis）电泳技术（electrophoresis）1 1本章主要内容本章主要内容基本原理基本原理醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳(CAME)聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）SDS-PAGE电泳电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳等电聚焦电泳等电聚焦电泳双向电泳双向电泳本章主要内容基本原理2 2概概 念念带电粒子在直流电场中的作用下，在一定带电粒子在直流电场中的作用下，在一定介质（溶剂）中发生的向异性电极定向移介质（溶剂）中发生的向异性电极定向移动的现象称为动的现象称为“电泳电泳”利用电泳现象对混合物进行分离分析的技利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术称为术称为“电泳技术电泳技术”概 念带电粒子在直流电场中的作用下，在一定介质（溶3 3分分 类类按有无支持物分为：自由电泳，区带电泳按有无支持物分为：自由电泳，区带电泳（其中根据支持物的不同而有不同的名称（其中根据支持物的不同而有不同的名称如纸电泳，琼脂糖电泳等）如纸电泳，琼脂糖电泳等）按电压分：低压电泳，高压电泳按电压分：低压电泳，高压电泳按用途分：分析电泳，制备电泳，定量免按用途分：分析电泳，制备电泳，定量免疫电泳疫电泳按支持物形状分：薄层电泳，平板电泳，按支持物形状分：薄层电泳，平板电泳，圆盘电泳，毛细管电泳圆盘电泳，毛细管电泳按区带形式分：盘状电泳，火箭电泳按区带形式分：盘状电泳，火箭电泳分 类按有无支持物分为：自由电泳，区带电泳（其中4 4特特 点点凡是带电物质均可应用某一电泳技术分离，凡是带电物质均可应用某一电泳技术分离，并可进行定性定量分析并可进行定性定量分析样品用量少样品用量少设备简单设备简单可在常温进行可在常温进行操作简便省时操作简便省时分辨率高分辨率高特 点凡是带电物质均可应用某一电泳技术分离，并可进5 5蛋白质电荷的来源蛋白质电荷的来源蛋白质电荷的来源6 6电泳的基本原理电泳的基本原理带电粒子在电场中所受的力带电粒子在电场中所受的力F=QE所受阻力所受阻力F=6rv电泳平衡时电泳平衡时F=F，则，则QE=6rv迁移率迁移率(电泳淌度电泳淌度)Q/6r,表示粒子在单表示粒子在单位电场强度下的泳动速度位电场强度下的泳动速度不同物质能否利用电泳进行分离，决定于不同物质能否利用电泳进行分离，决定于两者迁移率的差别，有差别才能分离。电两者迁移率的差别，有差别才能分离。电泳后分开的距离与迁移率、电压、时间等泳后分开的距离与迁移率、电压、时间等相关相关电泳的基本原理带电粒子在电场中所受的力F=QE7 7影响电泳的因素影响电泳的因素样品的性质样品的性质电场强度电场强度缓冲液：缓冲液：(1)pH值值 (2)成分成分 (3)离子强度离子强度支持介质：吸附、电渗，分子筛支持介质：吸附、电渗，分子筛温度温度影响电泳的因素样品的性质8 8电电 渗渗（electro-osmosiselectro-osmosis）在电场作用下液体相对于固体表面的移在电场作用下液体相对于固体表面的移动称动称“电渗电渗”电 渗（electro-osmosis）在电场作用9 9醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳（cellulose acetate membrane electrophoresis,CAMEcellulose acetate membrane electrophoresis,CAME）醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化形成的醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯纤维素醋酸酯对蛋白质样本吸附少，分离速度快，时间对蛋白质样本吸附少，分离速度快，时间短短，电渗作用虽然高但很均一，不影响分，电渗作用虽然高但很均一，不影响分离效果，经透明化处理后有利于光吸收扫离效果，经透明化处理后有利于光吸收扫描测定和膜的长期保存描测定和膜的长期保存影响因素：膜的性质，缓冲液，电流和电影响因素：膜的性质，缓冲液，电流和电压，电泳时间和温度，电泳槽的密封性能压，电泳时间和温度，电泳槽的密封性能醋酸纤维薄膜电泳（cellulose acetate m1010聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacryamide gel electrophoresis,PAGEpolyacryamide gel electrophoresis,PAGE）聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（acrylamide,Acr）和交联剂甲叉双丙烯）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（酰胺（methylene-bisacrylamide,Bis）在加速剂（在加速剂（TEMED）和催化剂（硫酸铵）和催化剂（硫酸铵）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacryamide gel e1111聚丙烯酰胺凝胶的聚合反应聚丙烯酰胺凝胶的聚合反应聚丙烯酰胺凝胶的聚合反应1212聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶特点：特点：(1)在一定浓度时，凝胶透明、有弹在一定浓度时，凝胶透明、有弹性、机械性能好性、机械性能好 (2)化学性能稳定，与被分化学性能稳定，与被分离物不起化学反应离物不起化学反应 (3)对对pH和温度变化较和温度变化较稳定稳定 (4)几乎无电渗作用几乎无电渗作用,只要只要Acr纯度高，纯度高，操作条件一致，则重复性好操作条件一致，则重复性好(5)样品不易扩样品不易扩散且用量少散且用量少 (6)凝胶孔径可调节凝胶孔径可调节 (7)分辨率分辨率高高聚丙烯酰胺凝胶特点：(1)在一定浓度时，凝胶透明、有弹性、机1313凝胶聚合的影响因素凝胶聚合的影响因素空气中氧能淬灭自由基，使聚合反应终止，空气中氧能淬灭自由基，使聚合反应终止，故聚合过程中反应液应与空气隔绝故聚合过程中反应液应与空气隔绝某些材料如有机玻璃等能抑制聚合反应某些材料如有机玻璃等能抑制聚合反应某些化学药物如赤血盐等可减慢反应速度某些化学药物如赤血盐等可减慢反应速度温度升高聚合加快，温度降低聚合减慢温度升高聚合加快，温度降低聚合减慢凝胶聚合的影响因素空气中氧能淬灭自由基，使聚合反应终止，故聚1414聚丙烯酰胺凝胶的性质聚丙烯酰胺凝胶的性质总浓度总浓度T%：100ml凝胶中含有凝胶中含有Acr和和Bis的总克数的总克数T越大，平均孔径越小越大，平均孔径越小，凝胶机械强度增加。但，凝胶机械强度增加。但达达15时胶脆性增大，易断裂；时胶脆性增大，易断裂；T过小则凝胶过小则凝胶稀软不易操作稀软不易操作交联度交联度C%：交联剂：交联剂Bis占单体占单体Acr与与Bis总量的百总量的百分数分数T%值固定时，值固定时，C5时孔径最小，高于或低时孔径最小，高于或低于于5时孔径相应变大。时孔径相应变大。C%过大胶不透明，缺乏过大胶不透明，缺乏弹性；过小则凝胶呈糊状弹性；过小则凝胶呈糊状聚丙烯酰胺凝胶的性质总浓度T%：100ml凝胶中含有Acr和1515分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围与凝胶浓度的关系1616PAGE的分类的分类根据具体操作分为：圆柱型，平板型（水根据具体操作分为：圆柱型，平板型（水平方向、垂直方向）平方向、垂直方向）根据凝胶系统的均匀性分为：连续系统，根据凝胶系统的均匀性分为：连续系统，不连续系统不连续系统PAGE的分类根据具体操作分为：圆柱型，平板型（水平方向、垂1717PAGE圆盘电泳示意图圆盘电泳示意图PAGE圆盘电泳示意图1818不连续圆盘电泳示意图不连续圆盘电泳示意图不连续圆盘电泳示意图1919不连续电泳的物理效应不连续电泳的物理效应样品浓缩效应：凝胶孔径不连续样品浓缩效应：凝胶孔径不连续 缓冲液离子成分不连续缓冲液离子成分不连续 pH的不连续性的不连续性分子筛效应分子筛效应电荷效应电荷效应 各种蛋白质因所带的净电荷、分子量大小各种蛋白质因所带的净电荷、分子量大小和形状不同而得以分离和形状不同而得以分离不连续电泳的物理效应样品浓缩效应：凝胶孔径不连续2020PAGE常见问题常见问题凝胶不聚合或聚合时间过长：最常见原因凝胶不聚合或聚合时间过长：最常见原因是硫酸铵失效，需新鲜配制；室温较低时是硫酸铵失效，需新鲜配制；室温较低时聚合变慢，可调整硫酸铵和聚合变慢，可调整硫酸铵和TEMED用量用量指示剂向相反方向移动指示剂向相反方向移动:电源连接错误，缓电源连接错误，缓冲液选择错误冲液选择错误指示剂前沿呈指示剂前沿呈“曲线曲线”：“微笑微笑”现象由现象由凝胶冷却不均匀造成；凝胶冷却不均匀造成；“皱眉皱眉”现象多由现象多由电泳装置不合适、底部气泡或靠近玻片的电泳装置不合适、底部气泡或靠近玻片的凝胶聚合不完全引起凝胶聚合不完全引起PAGE常见问题凝胶不聚合或聚合时间过长：最常见原因是硫酸铵2121聚丙烯酰胺凝胶电泳课件2222SDS-PAGESDS：十二烷基硫酸钠（：十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate），阴离子去垢剂），阴离子去垢剂SDS带有大量负电荷，大大超过天然蛋白带有大量负电荷，大大超过天然蛋白质原有的电荷量，从而消除或掩盖了不同质原有的电荷量，从而消除或掩盖了不同种类蛋白质间的电荷差异种类蛋白质间的电荷差异SDS作为变性剂和助溶剂，能断裂分子内作为变性剂和助溶剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构白质分子的二级和三级结构SDS-蛋白质的迁移率取决于分子量的大小蛋白质的迁移率取决于分子量的大小SDS-PAGESDS：十二烷基硫酸钠（sodium dod2323SDS-蛋白质复合物的形状蛋白质复合物的形状SDS-蛋白质复合物的形状2424琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是从琼脂中提取出来的链状多糖琼脂糖是从琼脂中提取出来的链状多糖优点优点：(1)含液体量大，达含液体量大，达9899，近，近似自由电泳，但样品扩散速度小，对蛋白似自由电泳，但样品扩散速度小，对蛋白质吸附极少质吸附极少 (2)分辨率高分辨率高,重复性好重复性好(3)电泳电泳速度快速度快(4)透明透明,不吸收紫外线，可直接用紫不吸收紫外线，可直接用紫外检测仪测定外检测仪测定(5)区带可染色，样品易回收区带可染色，样品易回收缺点：含有较多硫酸根，电渗作用大缺点：含有较多硫酸根，电渗作用大用途：用于核酸的分离、鉴定用途：用于核酸的分离、鉴定琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是从琼脂中提取出来的链状多糖2525等电聚焦电泳等电聚焦电泳（isoelectric focusing electrophoresis,IEFEisoelectric focusing electrophoresis,IEFE）利用具有线性利用具有线性pH梯度的电泳介质来分离等梯度的电泳介质来分离等电点不同的蛋白质电点不同的蛋白质当蛋白质迁移至其当蛋白质迁移至其pI相同的相同的pH处，则不再处，则不再泳动，而浓缩成狭窄的区带泳动，而浓缩成狭窄的区带蛋白质因其等电点的不同而得以分离蛋白质因其等电点的不同而得以分离等电聚焦电泳（isoelectric focusing e2626pH梯度的形成梯度的形成pH梯度的形成2727IEFE的聚焦效应的聚焦效应IEFE的聚焦效应2828常规常规PAGE与与SDS-PAGE的区别的区别常规PAGE与SDS-PAGE的区别2929IEFE优缺点优缺点优点优点:(1)分辨率高分辨率高,可将可将pI相差相差0.010.02pH单位的蛋白质分开单位的蛋白质分开(2)区带狭窄区带狭窄(3)样品不样品不管加到什么部位都可聚焦到其等电点管加到什么部位都可聚焦到其等电点缺点缺点:(1)需用无盐溶液，而无盐溶液中蛋白需用无盐溶液，而无盐溶液中蛋白质易沉淀质易沉淀 (2)不适于在不适于在pI点不溶解或发生变点不溶解或发生变性的蛋白质性的蛋白质IEFE优缺点优点:(1)分辨率高,可将pI相差0.0103030双向电泳双向电泳又称二维凝胶电泳又称二维凝胶电泳第一相为第一相为IEFE，根据蛋白质电荷差异进行，根据蛋白质电荷差异进行分离分离第二相为第二相为SDS-PAGE，根据蛋白质分子量，根据蛋白质分子量差异进行分离差异进行分离分辨率极高，是蛋白质组研究的关键开门分辨率极高，是蛋白质组研究的关键开门技术技术双向电泳又称二维凝胶电泳3131聚丙烯酰胺凝胶电泳课件3232转移电泳转移电泳转移电泳3333其它电泳技术其它电泳技术脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳毛细管电泳毛细管电泳等等等等其它电泳技术脉冲场凝胶电泳3434完！聚丙烯酰胺凝胶电泳课件3535