第二章微生物的纯培养和显微技术课件

第二章微生物的纯培养和显微技术微生物学1微生物的纯培养和显微技术重点：微生物的分离和纯培养技术，常用的菌种保藏方法。细菌、放线菌、霉菌、酵母菌的形态特征。2第一节微生物的分离和纯培养 一、一、无菌技术无菌技术 概述概述（1 1）培培养养物物：微微生生物物学学中中，在在人人为为规规定定的的条条件件下下培培养养、繁殖得到的微生物群体称为培养物。繁殖得到的微生物群体称为培养物。（2）纯纯培培养养物物和和纯纯培培养养的的概概念念：微微生生物物学学中中，将将由由一一个个细细胞胞（或或一一种种微微生生物物）繁繁殖殖所所得得到到的的后后代代称称为为纯纯培培养养物。对微生物这种纯种的培养，称为微生物的纯培养。物。对微生物这种纯种的培养，称为微生物的纯培养。（3）无无菌菌技技术术：在在分分离离、转转接接及及培培养养纯纯培培养养物物时时防防止止其其被其它微生物污染的技术称为无菌技术。被其它微生物污染的技术称为无菌技术。3 一、无菌技术11微生物培养的常用器具及灭菌微生物培养的常用器具及灭菌常用器具：试管、玻璃烧瓶、平皿等常用器具：试管、玻璃烧瓶、平皿等 注：所有器皿使用前都要灭菌！注：所有器皿使用前都要灭菌！培养基：培养微生物营养物质。培养基：培养微生物营养物质。注：配制好后要注：配制好后要及时及时灭菌。灭菌。常用的灭菌方法：高压蒸汽灭菌、常用的灭菌方法：高压蒸汽灭菌、干热灭菌干热灭菌4试管及斜面培养物5培养皿6三角烧瓶烧杯玻璃吸管7高压蒸汽灭菌（高压蒸汽灭菌（P153）8干热灭菌干热灭菌9一、无菌技术12接种操作接种操作接种：在无菌条件下，用接种环或接种接种：在无菌条件下，用接种环或接种针等工具把微生物从一个器皿转接到另针等工具把微生物从一个器皿转接到另一个器皿，叫做接种。是最常用的基本一个器皿，叫做接种。是最常用的基本操作。操作。10无菌箱和超净台无菌操作环境无菌操作环境111接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀常用工具12接种方法：烧环接种方法：烧环冷却冷却开管开管沾菌和塞管沾菌和塞管开另管开另管涂菌涂菌塞管塞管火焰烧环火焰烧环要点：在火焰上方或附近要点：在火焰上方或附近13斜面接种时的无菌操作(1)接种灭菌(2)开启棉塞(3)管口灭菌(4)挑起菌苔(5)接种(6)塞好棉塞14二、用固体培养基分离纯培养 概述概述 菌菌落落：由由单单个个微微生生物物在在适适宜宜的的固固体体培培养养基基表表面面或或内内部部生生长长、繁繁殖殖到到一一定定程程度度后后，形形成成肉肉眼眼可可见见的的、有有一一定定形态结构的子细胞生长群体。形态结构的子细胞生长群体。菌菌落落的的大大小小、形形状状、边边缘缘状状况况、质质地地、光光泽泽、颜颜色色及及透明度等是微生物分类、鉴定的重要依据。透明度等是微生物分类、鉴定的重要依据。菌菌苔苔：固固体体培培养养基基表表面面众众多多菌菌落落连连成成一一片片，呈呈片片状状，这就是菌苔。这就是菌苔。平板：平板：即培养平板，指盛有固体培养基的平皿。即培养平板，指盛有固体培养基的平皿。15161718二、用固体培养基分离纯培养21纯纯种种微微生生物物的的分分离离：在在自自然然界界中中，各各种种各各样样的的微微生生物物总总是是混混杂杂在在一一起起的的，要要研研究究和和利利用用某某一一微微生生物物，就就必必须须把把它它同同其其他他微微生生物物分分开开，才才能能得得到到只只含含有有同同一一种种微微生生物物的的纯纯种种微生物。这种方法叫纯种微生物的分离微生物。这种方法叫纯种微生物的分离22纯种微生物的分离方法纯种微生物的分离方法稀释到平板法稀释到平板法涂布平板法涂布平板法平板划线分离法平板划线分离法稀释摇管法稀释摇管法 191.稀释倒平板法（稀释倒平板法（pour plate method）先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1,000、1:10,000.），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。202.涂布平板法涂布平板法其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落由于将含菌材料先加到还较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，而且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。视频21思考：两者的结果有什么不同？思考：两者的结果有什么不同？22平板划线分离法23平板划线分离法1.斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法24划线分离结果254、厌氧微生物的分离、厌氧微生物的分离稀释摇管法稀释摇管法26三、用液体培养基分离纯培养稀释法：适用于原生动物和藻类的分稀释法：适用于原生动物和藻类的分 离和培养。离和培养。特特 点：高度稀释、多做平行对照。点：高度稀释、多做平行对照。思考：有什么缺陷性？思考：有什么缺陷性？有些目的微生物尤其是含量较少的微有些目的微生物尤其是含量较少的微生物往往被稀释掉！生物往往被稀释掉！此时可采用单细胞分离法。此时可采用单细胞分离法。27四、单细胞分离显微分离法显微分离法单细胞单细胞 分离法分离法用毛细管提取单个原生用毛细管提取单个原生 动物个体动物个体用显微操作仪分离单个细菌用显微操作仪分离单个细菌适用于分离混杂微生物中弱势适用于分离混杂微生物中弱势群体。群体。单细胞分离器单细胞分离器28五、选择培养分离选择培养分离：选择培养分离：根据微生物的营养、生理、根据微生物的营养、生理、生长条件等特点，通过选择培养进行微生物生长条件等特点，通过选择培养进行微生物的分离与纯化技术。的分离与纯化技术。29五、选择培养分离t抑制大多数其它微生物的生长；抑制大多数其它微生物的生长；t使待分离的微生物生长更快；使待分离的微生物生长更快；使待分离的微生物在群落中的数量上升，使待分离的微生物在群落中的数量上升，方便用稀释法对其进行纯化。方便用稀释法对其进行纯化。微生物群落中数量占微生物群落中数量占少数少数的微生物的分离纯化：的微生物的分离纯化：（没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一（没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物切生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。）择性的。）t使待分离的微生物生长使待分离的微生物生长“突出突出”；直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养。直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养。30五、选择培养分离五、选择培养分离1.利用选择平板进行直接分离利用选择平板进行直接分离待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制t高温下培养：分离嗜热细菌；高温下培养：分离嗜热细菌；t培养基中不含培养基中不含N：分离固氮菌；分离固氮菌；t培养基加抗生素：分离抗性菌；培养基加抗生素：分离抗性菌；31五、选择培养分离五、选择培养分离1.利用选择平板进行直接分离利用选择平板进行直接分离待分离的微生物的生长特征明显不同于其它微生物待分离的微生物的生长特征明显不同于其它微生物t颜色反应：分离特定的菌株；颜色反应：分离特定的菌株；t牛奶平板：分离蛋白酶产生菌；牛奶平板：分离蛋白酶产生菌；t利用特定细菌的滑动特点进行利用特定细菌的滑动特点进行分离纯化；分离纯化；3251用选择培养基进行直接分离用选择培养基进行直接分离选择培养基选择培养基：在培养基中加入某种化学物质，：在培养基中加入某种化学物质，以抑制非需要菌的生长，促进需要菌的生以抑制非需要菌的生长，促进需要菌的生长，这种培养基叫选择培养基。长，这种培养基叫选择培养基。高氏一号培养基加高氏一号培养基加10%酚数滴，抑制其它酚数滴，抑制其它菌的生菌的生 长，分离出放线菌长，分离出放线菌马丁氏培养基加链霉素以抑制其它菌生长，马丁氏培养基加链霉素以抑制其它菌生长，分离出真菌。分离出真菌。33蛋白酶产生菌的分离34具有氨苄青霉素抗性的大肠杆菌35五、选择培养分离52 富集培养：富集培养：不同微生物间的有不同特点，根据这些特点不同微生物间的有不同特点，根据这些特点制定特定的环境条件制定特定的环境条件，使需要的微生物生长旺盛，数量增，使需要的微生物生长旺盛，数量增加，从而更容易分离到该微生物。加，从而更容易分离到该微生物。加富培养基：加富培养基：一般指在培养基内加入额外的营养物质，使一般指在培养基内加入额外的营养物质，使需要的微生物营养更充分，生长的更快，这种培养基叫加需要的微生物营养更充分，生长的更快，这种培养基叫加富培养基。富培养基。土悬液土悬液培养基培养基+硫磺硫磺分离出硫杆菌分离出硫杆菌土悬液土悬液以羟基苯甲酸为唯一碳源的培养基以羟基苯甲酸为唯一碳源的培养基分离出能分离出能降解羟基苯甲酸的微生物。降解羟基苯甲酸的微生物。362.富集培养富集培养从自然界中分离到所需的特定微生物从自然界中分离到所需的特定微生物特定的环境条件特定的环境条件仅适应于该条件的微生物旺盛生长仅适应于该条件的微生物旺盛生长待分离微生物在群落中的数量大大增加待分离微生物在群落中的数量大大增加372.富集培养富集培养富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一。营养和生理富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一。营养和生理条件的几乎无穷尽的组合形式可应用于从自然界选择出特定微条件的几乎无穷尽的组合形式可应用于从自然界选择出特定微生物的需要。生物的需要。根据微生物的特殊要求，从自然界分离出特定已知微生物种类；根据微生物的特殊要求，从自然界分离出特定已知微生物种类；分离培养在特定环境中能生长的微生物；分离培养在特定环境中能生长的微生物；38六、二元培养物纯培养物：纯培养物：只含有一种微生物的培养物叫做纯培养物。只含有一种微生物的培养物叫做纯培养物。混合培养物：混合培养物：含有两种以上微生物的培养物叫做混合培养物。含有两种以上微生物的培养物叫做混合培养物。二元培养物二元培养物:只含有二种微生物的培养物而且是有意识的保持二者之间只含有二种微生物的培养物而且是有意识的保持二者之间的特定关系的培养叫做二元培养物。的特定关系的培养叫做二元培养物。例如：寄生于细菌细胞内的病毒与细菌一起培养例如：寄生于细菌细胞内的病毒与细菌一起培养。39获得微生物纯培养的方法比较获得微生物纯培养的方法比较40 方方 法法 特特 点点 应应 用用固固体体培培养养基基分分离离稀释稀释倒平倒平板板菌落分离较为均匀菌落分离较为均匀,进行微生物计数结进行微生物计数结果相对准确果相对准确.但操作相对麻烦但操作相对麻烦,热敏感菌热敏感菌有时易被烫死有时易被烫死,而严格好氧菌也可能因而严格好氧菌也可能因被固定在培养基中生长受到影响被固定在培养基中生长受到影响这这3种方法可用于所有种方法可用于所有能在固体培养基表面能在固体培养基表面形成菌落的微生物的形成菌落的微生物的纯培养分离纯培养分离.并且并且,通过通过选用适当的选择平板选用适当的选择平板及培养条件及培养条件,可直接分可直接分离各种具有特定生理离各种具有特定生理特征的微生物特征的微生物.和厌氧和厌氧罐或厌氧手套箱技术罐或厌氧手套箱技术结合结合,这这3种方法也可种方法也可用于获得各种厌氧菌用于获得各种厌氧菌的纯培养的纯培养涂布涂布平板平板法法操作相对简单操作相对简单,是较常使用的常规方法是较常使用的常规方法.但有时会因涂布不均匀使某些部位的菌但有时会因涂布不均匀使某些部位的菌落不能分开落不能分开,进行微生物计数时需对稀进行微生物计数时需对稀释和涂布过程的操作特别注意释和涂布过程的操作特别注意,否则不否则不易得到准确的结果易得到准确的结果.平板平板划线划线法法操作简单操作简单,多用于对已有纯培养的确认多用于对已有纯培养的确认和再次分离和再次分离（不能计数）不能计数）稀释稀释摇管摇管法法稀释倒平板法的一种变通形式稀释倒平板法的一种变通形式,但由于但由于菌落形成在琼脂柱的中间菌落形成在琼脂柱的中间,观察和挑取观察和挑取都相对困难都相对困难在缺乏专业的厌氧操在缺乏专业的厌氧操作设备的情况下对严作设备的情况下对严格厌氧菌进行分离和格厌氧菌进行分离和观察观察41 方方 法法 特特 点点 应应 用用液液体体培培养养基基分分离离稀释稀释法法工作量大工作量大,是否获得微生是否获得微生物的纯培养需依靠统计物的纯培养需依靠统计学的推测学的推测不能或不易在固体培养基上生不能或不易在固体培养基上生长的微生物进行纯培养分离或长的微生物进行纯培养分离或数量统计数量统计富集富集培养培养一般不能直接获得微生一般不能直接获得微生物的纯培养物的纯培养,在通过富集在通过富集培养使原本在自然环境培养使原本在自然环境中占少数的微生物的数中占少数的微生物的数量大大提高后量大大提高后,需再通过需再通过平板法进行相应微生物平板法进行相应微生物纯培养的分离和检测纯培养的分离和检测1)根据某种微生物的特殊生长根据某种微生物的特殊生长要求按照意愿从自然界中对这要求按照意愿从自然界中对这种微生物进行有针对性的有效种微生物进行有针对性的有效分离分离;2)分离培养出由科学家设分离培养出由科学家设计的特定环境中能生长的微生计的特定环境中能生长的微生物物,尽管我们并不知道什么微生尽管我们并不知道什么微生物能在这种特定的环境中生长物能在这种特定的环境中生长显显微微操操作作单细单细胞胞(孢孢子子)挑取挑取分离过程直观分离过程直观,可靠可靠,但但对仪器和操作技术要求对仪器和操作技术要求较高较高,多限于高度专业化多限于高度专业化的科学研究的科学研究.而挑取的微而挑取的微生物单细胞或孢子需经生物单细胞或孢子需经固体或液体培养后才能固体或液体培养后才能获得其纯培养物获得其纯培养物从样品中直接分离所需的微生从样品中直接分离所需的微生物细胞或孢子物细胞或孢子,获得其纯培养获得其纯培养42七、微生物的保藏技术菌种保藏目的：给微生物一特定的条件，菌种保藏目的：给微生物一特定的条件，使其不污染、不改变特性而存活下来。使其不污染、不改变特性而存活下来。菌种保藏原理：用人工方法降低微生物的菌种保藏原理：用人工方法降低微生物的代谢强度，限制微生物的生长和繁殖，使代谢强度，限制微生物的生长和繁殖，使其处于休眠状态。其处于休眠状态。43理想的菌种保藏方法应具备的条件理想的菌种保藏方法应具备的条件(1)经长期保藏后菌种存活健在；(2)保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。(3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。七、微生物的保藏技术44在一定时间内使菌种不死、不变、不乱在一定时间内使菌种不死、不变、不乱基本要求：基本方法：生活态休眠态培养基传代培养寄主传代培养冷冻干燥斜面、平板液氮、低温冰箱沙土管、冷冻真空干燥七、微生物的保藏技术45 由于微生物的多样性，不同的微生物往往对由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，因此，在具体不同的保藏方法有不同的适应性，因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。种方法的失败而导致菌种的丧失。七、微生物的保藏技术46国际重要菌种保藏机构国际重要菌种保藏机构中国菌种保藏单位中国菌种保藏单位七、微生物的保藏技术菌种保藏方法：71传代培养保藏隔绝空气，低温保藏，在规定时间内进行移接。49七、微生物的保藏技术7.2冷冻保藏-保护剂+菌种 零下196度速冻保存，或-70度冷冻室保存，-20-30度普通冰箱冷冻室保存。注：适当速冻，快速升温冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。50冷冻保藏种类冷冻保藏种类A 普通冷冻保藏技术(-20)B 超低温冷冻保藏技术(-60一-80)C 液氮冷冻保藏技术 51A 普通冷冻保藏技术(-20)将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试管或指管内，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于温度范围在-5-20的普通冰箱(-20)中。或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以维持若干微生物的活力12年。应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏52B 超低温冷冻保藏技术(-60-80)要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60以下进行保藏。在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：1离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；2用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；3加入等体积的20甘油或10二甲亚砜；4混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70超低温冰箱中保藏。5.如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2min。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响53C 液氮冷冻保藏技术 冷冻保护剂 在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10、二甲亚砜5。所使用的甘油般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。54七、微生物的保藏技术7.3干燥保藏砂土管保存法和冷冻真空干燥保藏法其他：纸片保藏法、薄膜保藏法、寄主保藏法等55第二节显微镜和显微技术一、显微镜的种类及原理 决定显微观察效果的两个重要因素决定显微观察效果的两个重要因素1.分辨率：指能辨别两点之间最小距离的能力分辨率：指能辨别两点之间最小距离的能力2.反差：指样品区别于背景的程度反差：指样品区别于背景的程度56第二节显微镜和显微技术1.11.1普通光学显微镜普通光学显微镜分辨率分辨率(最小分辨距离最小分辨距离)D=0.5/n)D=0.5/n snisniln n为玻片到物镜介质的折射率；为玻片到物镜介质的折射率；l为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距离。作距离。l n n snisni叫作数值孔径。不同介质的折射率：空气叫作数值孔径。不同介质的折射率：空气为为n=1.0 n=1.0；水；水n=1.33n=1.33；香柏油；香柏油n=1.55n=1.55。57分辨率分辨率(最小分辨距离最小分辨距离)D=0.5/n)D=0.5/n snisni58-15005960第二节显微镜和显微技术1.2暗视野显微镜聚光镜中央有挡光片，照明光聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野背景是黑的，物镜，因而视野背景是黑的，物体边缘是亮的。体边缘是亮的。可观察可观察 4200um的微粒子，的微粒子，分辨率比普通显微镜高分辨率比普通显微镜高50倍。倍。61原理：暗视野显微镜是利用丁达尔光学效应的原理，在普通光学显微镜的基础上改造而成。暗视野显微镜聚光器使光源的中央光束被阻挡。不能直接通过标本进入物镜。从而使光路改变，倾斜的照射在标本上，标本遇光发生反射，散射的光线进入物镜，因而标本明亮，视野是黑暗的。62适用范围：常用来观察未染色的透明样品，利用黑暗视野提高样品与背景之间的对比。只能看到物体的存在，运动和表面特征。不能辨别物体的细微结构63使用方法(1)把暗视野聚光器装在显微镜的聚光器支架上。(2)选用强的光源，但又要防止直射光线进入物镜，所以一般用显微镜灯照明。(3)在聚光器和标本片之间要加一滴香柏油，目的是不使照明光线于聚光镜上面进行全反射，达不到被检物体，而得不到暗视野照明。(4)升降集光器，将集光镜的焦点对准被检物体，即以圆锥光束的顶点照射被检物。如果聚光器能水平移动并附有中心调节装置，则应首先进行中心调节，使聚光器的光轴与显微镜的光轴严格位于一直线上。(5)选用与聚光器相应的物镜，调节焦距，找到所需观 察的物像。64暗场显微镜的要求要求载玻片和盖玻片必须无疵痕和灰尘物镜前透镜必须清洁无尘载玻片和盖玻片厚度必须绝对符合要求65人血细胞6667第二节显微镜和显微技术1.31.3相差显微镜相差显微镜 当光线通过标本时，由于直射光和衍射光的光程不同，当光线通过标本时，由于直射光和衍射光的光程不同，就会是光波相位发生改变而产生就会是光波相位发生改变而产生相位差相位差。相差显微镜具有。相差显微镜具有环状光阑和相差板，能将光环状光阑和相差板，能将光相位差转变相位差转变为人的肉眼可以察为人的肉眼可以察觉的觉的振幅差（明暗差），振幅差（明暗差），从而使原来的透明物体表现出明从而使原来的透明物体表现出明显的明暗差异。对比度增强。因此可以在不染色的情况下，显的明暗差异。对比度增强。因此可以在不染色的情况下，观察到细胞的细微结构。观察到细胞的细微结构。68用途：观察未经染色的玻片标本69701.4 微分干涉相差显微镜(DIC)无色透明活体标本的细微结构图象呈浮雕状的立体感观察效果更加逼真711.4.1 1.4.1 原理原理 通过特制的棱镜将偏振光分解相互垂直，强度相等的光束，光束载极近的两点（小于显微镜的分辨率）上通过被检物体，从而在相位上略有差别，使图象呈现出立体三维感觉。1.4.2 1.4.2 特点特点可以使被检物体产生三维立体感觉观察效果更直观无须特殊物镜，与荧光观察配合更好可以调节背景和物体的颜色变化而达到理想的效果。72737475拟南芥根76轮虫77虱性车轮虫78791.51.5荧光显微镜荧光显微镜 荧光显微技术：把标本用不同的荧光素作标记，在荧光显荧光显微技术：把标本用不同的荧光素作标记，在荧光显微镜下，经过紫外线照射，标本会在黑暗背景下表现出有微镜下，经过紫外线照射，标本会在黑暗背景下表现出有光亮的物体。使标本更便于观察。光亮的物体。使标本更便于观察。80特点：光源为短波，被样品特点：光源为短波，被样品吸收后发出可见光。吸收后发出可见光。不同荧光素激发波长不同荧光素激发波长不同可见光的颜色不不同可见光的颜色不同。同。81用于观察能激发出荧光的结构。DNA 呈蓝色，呈蓝色，微管呈绿色微管呈绿色82主要特点：主要特点：分辨率高；分辨率高；图像色彩鲜艳；图像色彩鲜艳；观察方便。观察方便。831.6 透射电子显微镜用电子波代替光源，最短波长的可见光=450nm；而电磁波的波长最短可以达到=0.005nm。所以，电镜的分辨率远高于光学显微镜。8485第二节显微镜和显微技术1.71.7扫描电子显微镜（扫描电子显微镜（SEMSEM）电子枪发出电子束被磁透镜会聚成极细的探针，在电子枪发出电子束被磁透镜会聚成极细的探针，在样品表面进行扫描，电子束探针扫描到的地方可样品表面进行扫描，电子束探针扫描到的地方可以以激发样品表面放出二次电子激发样品表面放出二次电子，二次电子的多少，二次电子的多少与样本表面的立体形状有关。二次电子由探测器与样本表面的立体形状有关。二次电子由探测器收集并被闪烁器变成光信号，再经光电倍增管和收集并被闪烁器变成光信号，再经光电倍增管和放大器再编成电压信号来控制荧光屏上电子束的放大器再编成电压信号来控制荧光屏上电子束的强度。强度。86扫描式电子显微镜下的花粉粒扫描式电子显微镜酵母菌人类精子人类精子871.71.7扫描隧道显微镜（扫描隧道显微镜（STMSTM）88二、显微观察样品的制备2.1光学显微镜的制样2.1.1活体观察：运动能力、摄食特性、及生长过程中的形态变化等动态过程。89A.压滴法：将菌悬液加在载玻片上，加盖玻片观察压滴法：将菌悬液加在载玻片上，加盖玻片观察90B 悬滴法：盖玻片上加一滴菌悬液，倒置在凹玻载片上观察。悬滴法：盖玻片上加一滴菌悬液，倒置在凹玻载片上观察。91C.菌丝埋片法：将无菌玻璃纸铺在平板上，涂布放菌丝埋片法：将无菌玻璃纸铺在平板上，涂布放线菌或霉菌孢子，培养后将玻璃纸置于玻片上直线菌或霉菌孢子，培养后将玻璃纸置于玻片上直接观察接观察92菌丝和分生包子93二、显微观察样品的制备2.1.22.1.2染色观察：一般微生物个体小而无色透明，细染色观察：一般微生物个体小而无色透明，细胞结构的折光率与背景相差很小，在光学显微镜胞结构的折光率与背景相差很小，在光学显微镜下，很难看清细胞的微细结构。通过对微生物染下，很难看清细胞的微细结构。通过对微生物染色，借助颜色的反衬作用，提高观察样品不同部色，借助颜色的反衬作用，提高观察样品不同部位的反差，从而提高对细胞微细结构的观察效果。位的反差，从而提高对细胞微细结构的观察效果。94二、显微观察样品的制备染色的一般步骤：染色的一般步骤：涂片涂片干燥干燥固定固定染色染色水洗水洗干燥干燥镜检（油镜）镜检（油镜）95二、显微观察样品的制备固定的目的：固定的目的：一、是杀死细菌一、是杀死细菌二、是使菌体粘附于玻片上二、是使菌体粘附于玻片上常用的固定方法有：常用的固定方法有：一、火焰加热法一、火焰加热法二、化学固定法二、化学固定法96细菌的染色方法97革兰氏染色姬姆萨染色结核菌的抗酸染色细菌的芽孢染色98有荚膜细菌的负染色酵母菌美蓝染色（活菌无色，死菌蓝色）99第三节显微镜下的微生物微生物类型：细胞型和非细胞型两类微生物类型：细胞型和非细胞型两类细胞型微生物：细菌、古生菌、真核微细胞型微生物：细菌、古生菌、真核微生物生物非细胞型微生物：病毒、类病毒、朊病非细胞型微生物：病毒、类病毒、朊病毒毒100第三节显微镜下的微生物一、细菌形态：一、细菌形态：球状球状杆状杆状螺旋状螺旋状101第三节显微镜下的微生物球菌淋病球菌图片102第三节显微镜下的微生物双球菌肺炎双球菌103第三节显微镜下的微生物葡萄球菌104链球菌105球菌球菌(coccus)四联球菌四联球菌(tetrad)106球菌球菌(coccus)八叠球菌八叠球菌(sarcina)107大肠杆菌图片大肠杆菌图片杆菌108有有鞭毛的杆菌鞭毛的杆菌杆菌109绿脓杆菌单鞭毛杆菌110梭状芽孢杆菌梭状芽孢杆菌杆菌结核杆菌结核杆菌蜡样芽孢杆菌杆菌乳酸杆菌乳酸杆菌双歧杆菌双歧杆菌破伤风杆菌破伤风杆菌111球杆菌球杆菌链状杆菌链状杆菌双杆菌双杆菌单杆菌单杆菌112杆菌杆菌(bacillus)不同杆菌的大小、长短、粗细很不一致。不同杆菌的大小、长短、粗细很不一致。炭疽芽胞杆菌炭疽芽胞杆菌 3-10 m3-10 m大中大肠埃希菌大肠埃希菌 2-3 m2-3 m小布鲁菌布鲁菌 0.6-1.5 m0.6-1.5 m113114115柄柄 细细 菌菌116杆菌(bacillus)杆菌的形态多样杆菌的形态多样双歧杆菌双歧杆菌117炭疽杆菌118大肠杆菌裂殖119梭状杆菌（破伤风）120变形杆菌l变形杆菌广泛存在于水、土壤腐败的有机物以及人和动物的肠道中，为条件致病菌，多为继发感染，如慢性中耳炎、创伤感染等，也可引起膀胱炎、婴儿腹泻、食物中毒等。l变形杆菌可引起败血症，病死率较高。l变形杆菌呈明显的多形性，有球形和丝状形，为周鞭毛菌，运动活泼。在固体培养基上呈扩散生长，形成迁徒生长现象。l培养物有特殊臭味，在血琼脂平板上有溶血现象。能迅速分解尿素。121螺旋状（弧菌）螺旋状（弧菌）弧形霍乱菌弧形霍乱菌幽门螺旋杆菌幽门螺旋杆菌122弧菌：弧菌：菌体只有一个弯曲，菌体只有一个弯曲，其程度不足一圈，形似其程度不足一圈，形似 C C 字或逗号，鞭毛偏端生。字或逗号，鞭毛偏端生。螺旋菌：螺旋菌：菌体回转如螺旋，螺菌体回转如螺旋，螺旋数目旋数目2-6环。鞭毛二端生。细环。鞭毛二端生。细胞壁坚韧，菌体较硬。胞壁坚韧，菌体较硬。螺旋体：螺旋体：螺旋数目大于螺旋数目大于6 6环，环，菌体柔软，无鞭毛，大多数是菌体柔软，无鞭毛，大多数是致病菌。致病菌。螺旋菌形态123 菌体只有一个弯曲，其程度不足一圈，形似菌体只有一个弯曲，其程度不足一圈，形似“C C”字或逗号，鞭毛偏端生。字或逗号，鞭毛偏端生。霍乱弧菌霍乱弧菌124螺旋菌：螺旋菌：菌体回转如螺菌体回转如螺旋，螺旋数目旋，螺旋数目和螺距大小因和螺距大小因种而异。鞭毛种而异。鞭毛二端生。细胞二端生。细胞壁坚韧，菌体壁坚韧，菌体较硬。较硬。125螺旋菌126影响细菌形态的因素培养时间、培养时间、培养温度、培养温度、培养基成分、培养基成分、浓度、浓度、pH值值127头发和手指上的细菌128放线菌129130第三节显微镜下的微生物12古生菌的形态古生菌的形态古生菌与细菌有类似的形态，它们大多都生活在古生菌与细菌有类似的形态，它们大多都生活在生存条件十分恶劣的极端环境里。生存条件十分恶劣的极端环境里。如隐蔽热网菌是最耐热生物之一，它的最适生长如隐蔽热网菌是最耐热生物之一，它的最适生长温度为温度为105度。度。131真核微生物132酵母菌133出芽生殖中的啤酒酵母134黑曲霉135黑曲霉136真菌（脚气病）137青霉的帚状结构138大型真菌黄裙竹荪虫草猴头菇银耳灵芝双孢菇139病毒SARS病毒病毒艾滋病毒（左：病毒体，右：结构图）艾滋病毒（左：病毒体，右：结构图）噬菌体噬菌体禽流感病毒电镜图禽流感病毒电镜图140禽流感病毒攻击人体健康细胞照片禽流感病毒攻击人体健康细胞照片一串蓝色小球正在攻击健康的人类粉色细胞。这些高清晰照片是科技摄影师伦纳特尼尔松利用高倍电子扫描显微镜摄制而成。这是H5N1型禽流感病毒首次在媒体亮相。141朊病毒朊病毒142作业作业1、解释名词、解释名词无菌技术：在分离、转接及培养纯培养物时防止其无菌技术：在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其它微生物污染的技术称为无菌技术。被其它微生物污染的技术称为无菌技术。纯纯培养物和纯培养的概念：微生物学中，将由一个培养物和纯培养的概念：微生物学中，将由一个细胞（或一种微生物）繁殖所得到的后代称为纯细胞（或一种微生物）繁殖所得到的后代称为纯培养物。对微生物这种纯种的培养，称为微生物培养物。对微生物这种纯种的培养，称为微生物的纯培养的纯培养接种：在无菌条件下，用接种环把微生物从一个器接种：在无菌条件下，用接种环把微生物从一个器皿转接到另一个器皿，叫做接种皿转接到另一个器皿，叫做接种143第二章作业第二章作业菌菌落落的的概概念念：由由单单个个微微生生物物在在适适宜宜的的固固体体培培养养基基表表面面或或内内部部生生长长、繁繁殖殖到到一一定定程程度度后后，形形成成肉肉眼眼可可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体叫菌落。见的、有一定形态结构的子细胞生长群体叫菌落。菌菌苔苔：固固体体培培养养基基表表面面众众多多菌菌落落连连成成一一片片，呈呈片片状，这就是菌苔。状，这就是菌苔。平板：即培养平板，指盛有固体培养基的平皿平板：即培养平板，指盛有固体培养基的平皿144第二章作业第二章作业纯培养物：只含有一种微生物的培养物叫做纯培养物。纯培养物：只含有一种微生物的培养物叫做纯培养物。混合培养物：含有两种以上微生物的培养物叫做混合培养混合培养物：含有两种以上微生物的培养物叫做混合培养物。物。二元培养物二元培养物:只含有二种微生物的培养物叫做二元培养物。只含有二种微生物的培养物叫做二元培养物。145条件致病菌：是在一定条件下，正常菌群中的细菌也能使人患病：由于机体的防卫功能减弱,引起自身感染。例如皮肤粘膜受伤（特别是大面积烧伤）、身体受凉、过度疲劳、长期消耗性疾病等，可导致正常菌群的自身感染；由于正常菌群寄居部位的改变，发生了定位转移，也可引起疾病。例如大肠杆菌进入腹腔或泌尿道，可引起腹膜炎、泌尿道感染。因此，这些细菌称为条件致病菌。返回返回146迁徙生长现象：变形杆菌在固体培养基上呈扩散性生长,形成以菌接种部位为中心的厚薄交替,同心圆型的层层波状菌苔,这种现象称为迁徙生长现象.返回返回147148