转基因实验技术培训ppt课件

转基因基因实验技技术转基因实验技术1一、转基因动物的概念一、转基因动物的概念 所所谓转基因基因动物就是把外源性目的基因物就是把外源性目的基因导入入动物的受物的受精卵或其囊胚精卵或其囊胚细胞中，后改用注入受精卵的任何一个胞中，后改用注入受精卵的任何一个前核，并在前核，并在细胞基因胞基因组中中稳定整合，再将合格的重定整合，再将合格的重组受精卵或囊胚受精卵或囊胚细胞胞筛选出来，采用借腹出来，采用借腹怀孕法寄养在孕法寄养在雌性雌性动物（物（foster mother）的子）的子宫内内,使之使之发育成具表育成具表达目的基因的胚胎达目的基因的胚胎动物物,并能并能传给下一代。下一代。这样，生育，生育的的动物物为转基因基因动物。物。这类动物由于外源性目的基因物由于外源性目的基因的的稳定存在而定存在而赋于子代于子代动物个体。物个体。2转基因实验技术一、转基因动物的概念 所谓转基因动物就是把外源性目的21.1 1.1 转基因转基因技术发展简介技术发展简介转基因基因动物的出物的出现是重是重组DNA技技术和胚胎技和胚胎技术发展的必然展的必然结果。重果。重组DNA技技术的的出出现，使人，使人类首次可以分离并首次可以分离并扩增足增足够数量的数量的遗传物物质DNA。早在早在20世世纪60年代末和年代末和70年代初，就有人向蛙卵和小鼠胚胎注射年代初，就有人向蛙卵和小鼠胚胎注射mRNA，研究，研究 mRNA能不能在能不能在动物卵物卵细胞和早期胚胎中翻胞和早期胚胎中翻译。1974年，年，Jaenisch和和Mintz首次首次报道通道通过向移植之前的小鼠囊胚注射向移植之前的小鼠囊胚注射SV40的的DNA，在在发育成的幼鼠体内育成的幼鼠体内检测到了到了SV40DNA序列的存在。序列的存在。1976年，年，Jaenisch又又报道了通道了通过用反用反转录病毒感染小鼠的胚胎，使病毒病毒感染小鼠的胚胎，使病毒DNA整合整合到小鼠的基因到小鼠的基因组中。中。1980年，年，Gordon等人首先等人首先报道了用道了用显微注射微注射纯化化DNA的方法，的方法，获得了得了转基因小鼠。基因小鼠。但是，在但是，在这些早期的些早期的实验中，使用的基因中，使用的基因结构未曾构未曾认真地真地设计和构建，大多是使和构建，大多是使用容易得到的材料用容易得到的材料进行行试验，实验结果果仅仅表明使用表明使用DNA显微注射的方法可以将微注射的方法可以将外源基因外源基因导入小鼠种系之中。并没有入小鼠种系之中。并没有检测被被导入的基因的生理作用。入的基因的生理作用。3转基因实验技术1.1 转基因技术发展简介转基因动物的出现是重组DNA技术和3转基因超级鼠转基因超级鼠1982年，英国的年，英国的自然自然杂志志发表了一篇文章：有两个美国表了一篇文章：有两个美国实验小小组利用利用转基因技基因技术，将大鼠生，将大鼠生长激素重激素重组基因基因导入到小鼠受精卵中入到小鼠受精卵中,培育出具快速生培育出具快速生长效效应的的“转基因基因超超级鼠鼠”。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快速度快23倍，体倍，体积大一倍。大一倍。4转基因实验技术4转基因实验技术41.2 1.2 转基因的方法转基因的方法5转基因实验技术1.2 转基因的方法5转基因实验技术51)1)显微注射法显微注射法:将将DNADNA注射到胚胎的注射到胚胎的细胞核胞核内，再把注射内，再把注射过DNADNA的胚胎移植到的胚胎移植到动物体内，使之物体内，使之发育成正常的幼仔。育成正常的幼仔。6转基因实验技术1)显微注射法:将DNA注射到胚胎的细胞核内，再把注射过D62)2)逆转录病毒感染法：逆转录病毒感染法：最早用来得到最早用来得到转基因小鼠的方基因小鼠的方法，利用逆法，利用逆转录载体将体将遗传信息以信息以RNARNA分子的形式，在逆分子的形式，在逆转录整合整合酶和逆和逆转录基因基因组末端的特异性核酸序列的作用下，反末端的特异性核酸序列的作用下，反转录并整合到宿主基因并整合到宿主基因组中去，最中去，最终得到得到转基因小鼠。基因小鼠。逆逆转录病毒病毒载体未成体未成为一种主一种主导的的转基因技基因技术因因为自身的缺陷：自身的缺陷：1）反）反转录病毒病毒载体容量太小，可以插入的目体容量太小，可以插入的目标基因最大允基因最大允许长度是度是8kb；2）逆）逆转录病毒的病毒的遗传稳定性很差，定性很差，诸如缺失、碱基如缺失、碱基对替替换、插入、重插入、重组等，会随着复制周期数的增加而增加；等，会随着复制周期数的增加而增加；3）滴度低。病毒滴度大多数情况下是通）滴度低。病毒滴度大多数情况下是通过子代病毒子代病毒颗粒在靶粒在靶细胞上的表达水平胞上的表达水平测定的。定的。7转基因实验技术2)逆转录病毒感染法：最早用来得到转基因小鼠的方法，利用逆转73)3)胚胎干细胞法：胚胎干细胞法：将将转染的胚胎干染的胚胎干细胞注射入受体囊胚胞注射入受体囊胚腔，可参与嵌合体的形成，将来出生的腔，可参与嵌合体的形成，将来出生的动物的生殖系物的生殖系统就有可就有可能整合上外源基因，通能整合上外源基因，通过杂交繁育得到交繁育得到纯合目的基因的个体，合目的基因的个体，即即为转基因基因动物。物。其其优点是：在将胚胎干点是：在将胚胎干细胞植胞植入胚胎前，可以在体外入胚胎前，可以在体外选择一一个特殊的基因型，用外源个特殊的基因型，用外源DNA转染以后，胚胎干染以后，胚胎干细胞可以被胞可以被克隆，克隆，继而可以而可以筛选含有整合含有整合外源外源DNA的的细胞用于胞用于细胞融合，胞融合，由此可以得到很多由此可以得到很多遗传上相同上相同的的转基因基因动物。物。缺点是：缺点是：许多嵌合体多嵌合体转基因基因动物生殖物生殖细胞内不含有胞内不含有转基因。基因。目前，胚胎干目前，胚胎干细胞介胞介导法在小法在小鼠上鼠上应用比用比较成熟。成熟。8转基因实验技术3)胚胎干细胞法：将转染的胚胎干细胞注射入受体囊胚腔，可参与8显微注射胚胎的逆转录病毒感染ES细胞DNA载体任何克隆的DNA，除去载体序列的完好的线性形式重组的或野生型的逆转录病毒克隆的DNA或逆转录病毒DNA导入显微注射到原核除去透明带后的感染电转移或逆转录病毒感染胚胎发育阶段1-细胞期1-细胞期或稍晚全能性ES细胞胚胎移植输卵管子宫囊胚腔，然后子宫首代的基因型通常非嵌合体镶嵌的嵌合体新生鼠筛查斑点印迹，Southern印迹或PCRSouthern印迹或PCR皮色和Southern印迹或PCRDNA整合拷贝数12001随选择的方法和导入的DNA而变首代动物可能含转基因的百分比10-305-40可达100新导入DNA的表达经常差增强子诱捕，基因诱捕整合随机，非同源，多拷贝，单位点用逆转录病毒长末端重复（LTRs）显然为随机随机或定点，取决于DNA导入方法首代动物的生殖系遗传经常经常偶尔成问题优点方法简便，许多不同构件均成功表达用逆转录病毒LTRs为单位点同源重组；体外转化选择；用逆转录病毒有多种插入缺点显微注射导致胚胎物理损伤；多拷贝整合；缺乏同源重组插入表达水平低；难达到高滴度组织培养系统困难9转基因实验技术显微注射胚胎的逆转录病毒感染ES细胞DNA载体任何克隆的DN9 1.3 1.3 转基因动物的应用前景转基因动物的应用前景1 1、研究基因的结构与功能，了解动物生命现、研究基因的结构与功能，了解动物生命现象的内在本质。象的内在本质。2 2、建立多种疾病的动物模型，研究发病机理、建立多种疾病的动物模型，研究发病机理及治疗方法。及治疗方法。3 3、改善动物生产性能，提高动物育种效率。、改善动物生产性能，提高动物育种效率。4 4、作为医用或食用蛋白的生物反应器。可以、作为医用或食用蛋白的生物反应器。可以通过家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉价的人通过家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉价的人体药用蛋白。体药用蛋白。10转基因实验技术 1.3 转基因动物的应用前景10转基因实验技术1011转基因实验技术11转基因实验技术11二、基因敲除动物的概念二、基因敲除动物的概念基因敲除（基因敲除（gene knock outgene knock out）：）：是是8080年代年代初出初出现的一的一项新的基因工程技新的基因工程技术。采用同源重。采用同源重组的的方法方法,用体外合成的无效基因或突用体外合成的无效基因或突变基因取代相基因取代相应正正常基因常基因,再再应用用转基因方法孵育出基因方法孵育出转基因基因动物物,即即为基因敲除基因敲除动物。物。12转基因实验技术二、基因敲除动物的概念基因敲除（gene knock out122.1 2.1 基因敲除的方法基因敲除的方法13转基因实验技术2.1 基因敲除的方法13转基因实验技术131)1)利用基因同源重组进行基因敲除利用基因同源重组进行基因敲除1.基因基因载体的构建体的构建2.ES 细胞的胞的获得得3.外源外源DNA导入入4.选择筛选已已击中的中的细胞胞5.ES细胞的囊胚注射胞的囊胚注射6.表型研究表型研究7.得到得到纯合体合体14转基因实验技术1)利用基因同源重组进行基因敲除基因载体的构建14转基因实验141.1 1.1 打靶载体的构建打靶载体的构建基因打靶基因打靶载体包括体包括载体骨架、靶基因同源序列和突体骨架、靶基因同源序列和突变序列及序列及选择性性标记基因等非同源序列，其中同源序列是同源重基因等非同源序列，其中同源序列是同源重组效率的关效率的关键因素。因素。基因打靶基因打靶载体有基因插入型体有基因插入型载体体(Gene-insertion vector)和基因置和基因置换型型载体体(Genereplacement vector)。把目的基因和与把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重分子都重组到到带有有标记基因基因(如如neo 基因，基因，TK 基因等基因等)的的载体上，成体上，成为重重组载体。基因敲除是体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替替换型型载体。体。15转基因实验技术1.1 打靶载体的构建基因打靶载体包括载体骨架、靶基因同源序15现在基因敲除一般采用是胚胎干在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用胞，最常用的是鼠，而兔，猪，的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干等的胚胎干细胞也有使胞也有使用。常用的鼠的种系是及其用。常用的鼠的种系是及其杂合体，因合体，因为这类小鼠具有自小鼠具有自发突突变形成畸胎瘤和畸胎肉形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的瘤的倾向，是基因敲除的理想向，是基因敲除的理想实验动物。而其物。而其他他遗传背景的胚胎干背景的胚胎干细胞系也逐胞系也逐渐被被发展展应用。用。1.2 ES1.2 ES细胞获得细胞获得16转基因实验技术现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡161.3 1.3 外源外源DNADNA导入导入外源外源DNA导入的方式主要有入的方式主要有显微注射法、微注射法、电穿孔法、精穿孔法、精子子载体法和逆体法和逆转录病毒法等。目前病毒法等。目前应用最广的是用最广的是显微注微注射法。射法。Capecchi报道，用道，用显微注射法微注射法导入可得到很高的入可得到很高的转染效染效率，占接受外源率，占接受外源DNA细胞的胞的1020，但，但显微注射每次微注射每次只能注射一个只能注射一个细胞，而胞，而电穿孔法可同穿孔法可同时使使许多多细胞得到胞得到转染。染。Mansour等研究等研究发现电穿孔可使穿孔可使1的的ES细胞胞稳定定转染。染。逆逆转录病毒病毒载体法利用某些病毒与体法利用某些病毒与组织细胞有特异的胞有特异的亲合力，可用于合力，可用于时空特异性基因打靶。空特异性基因打靶。17转基因实验技术1.3 外源DNA导入外源DNA导入的方式主要有显微注射法、17转基因实验技术培训ppt课件181.5 ES1.5 ES细胞的囊胚注射细胞的囊胚注射19转基因实验技术1.5 ES细胞的囊胚注射19转基因实验技术19将囊胚移植到假孕母鼠子宫内将囊胚移植到假孕母鼠子宫内20转基因实验技术将囊胚移植到假孕母鼠子宫内20转基因实验技术20通通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的察嵌和体小鼠的生物学形状的变化化进而了解目的而了解目的基因基因变化前后化前后对小鼠的生物学形状的改小鼠的生物学形状的改变，达到研究目，达到研究目的基因的目的。的基因的目的。由于同源重由于同源重组常常常常发生在一生在一对染色体上中一条染色体中染色体上中一条染色体中,所以如果要得到所以如果要得到稳定定遗传的的纯合体基因敲除模型，需要合体基因敲除模型，需要进行至少两代行至少两代遗传。1.6 1.6 嵌合体动物表型研究嵌合体动物表型研究1.7 1.7 得到纯合体基因敲除动物得到纯合体基因敲除动物21转基因实验技术通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后212)2)条件性基因敲除法条件性基因敲除法条件性基因敲除法可定条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定限制于小鼠某些特定类型的型的细胞或胞或发育的某一特定育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。它段的一种特殊的基因敲除方法。它实际上是在常上是在常规的的基因敲除的基基因敲除的基础上，利用重上，利用重组酶Cre介介导的位点特异性重的位点特异性重组技技术，在，在对小鼠小鼠基因修基因修饰的的时空范空范围上上设置一个可置一个可调控的控的“按按钮”，从而使，从而使对小鼠基因小鼠基因组的修的修饰的范的范围和和时间处于一种可控状于一种可控状态。外显子外显子目标外显子PGKneoloxPloxP外显子Mating with CRE mice：CRE外显子外显子loxP外显子FloxP22转基因实验技术2)条件性基因敲除法条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰2223转基因实验技术23转基因实验技术23诱导性基因敲除也是以性基因敲除也是以Cre/loxp 系系统为基基础，但却是利用控制，但却是利用控制Cre 表达的表达的启启动子的活性或所表达的子的活性或所表达的Cre 酶活性具有可活性具有可诱导的特点，通的特点，通过对诱导剂给予予时间的控制或利用的控制或利用Cre 基因定位表达系基因定位表达系统中中载体的宿主体的宿主细胞特异性和将胞特异性和将该表达系表达系统转移到移到动物体内的物体内的过程在程在时间上的可控性，从而在上的可控性，从而在1oxP 动物物的一定的一定发育育阶段和一定段和一定组织细胞中胞中实现对特定基因特定基因进行行遗传修修饰之目的之目的的基因敲除技的基因敲除技术。人。人们可以通可以通过对诱导剂给予予时间的的预先先设计的方式来的方式来对动物基因突物基因突变的的时空特异性空特异性进行人行人为控制、以避免出控制、以避免出现死胎或死胎或动物出物出生后不久即死亡的生后不久即死亡的现象。常象。常见的几种的几种诱导性性类型如下：四型如下：四环素素诱导型型(图)；干；干扰素素诱导型；激素型；激素诱导型；腺病毒介型；腺病毒介导型。型。3)3)可诱导的条件性基因敲除法可诱导的条件性基因敲除法诱导性基因敲除性基因敲除优点：点：诱导基因突基因突变的的时间可人可人为控制；控制；可避免因基因突可避免因基因突变而致死胎的而致死胎的问题 在在2 个个loxP 位点之位点之间的重的重组率率较高；高；如用病毒或配体如用病毒或配体DNA 复合物等基因复合物等基因转移系移系统来介来介导Cre 的表达，的表达，则可省去建立携可省去建立携带Cre 的的转基因基因动物的物的过程。程。24转基因实验技术诱导性基因敲除也是以Cre/loxp 系统为基础，但却是利用24四四环素素诱导的基因敲除的基因敲除过程示例程示例图25转基因实验技术四环素诱导的基因敲除过程示例图25转基因实验技术25四四环素素诱导的条件性基因敲除的条件性基因敲除过程示例程示例图26转基因实验技术四环素诱导的条件性基因敲除过程示例图26转基因实验技术26利用随机插入突变进行基因敲除利用随机插入突变进行基因敲除原理：此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，原理：此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因菌或其他基因载体，体，在目在目标细胞基因胞基因组中中进行随机插入突行随机插入突变，建立一个携，建立一个携带随机插入突随机插入突变的的细胞胞库，然后通，然后通过相相应的的标记进行行筛选获得相得相应的基因敲除的基因敲除细胞。根据胞。根据细胞胞的不同，插入的不同，插入载体的体的选择也有所不同。逆也有所不同。逆转率病毒可用于率病毒可用于动植物植物细胞的插胞的插入；入；对于植物于植物细胞而言胞而言农杆菌介杆菌介导的的T-DNA转化和化和转座子比座子比较常用；噬菌常用；噬菌体可用于体可用于细菌基因敲除。菌基因敲除。27转基因实验技术利用随机插入突变进行基因敲除原理：此法利用某些能随机插入基因274)4)基因捕获法基因捕获法基因捕基因捕获法是最近法是最近发展起来的利用随机插入突展起来的利用随机插入突变进行基因敲除的新型方法，行基因敲除的新型方法，其原理可其原理可见下下图。通常基因捕。通常基因捕获载体包括一个无启体包括一个无启动子的子的报道基因，通常是道基因，通常是neo 基因，基因，neo 基因插入到基因插入到ES 细胞染色体胞染色体组中，并利用捕中，并利用捕获基因的基因的转录调控元控元件件实现表达的表达的ES 克隆可以很容易地在含克隆可以很容易地在含G418 的的选择培养基中培养基中筛选出来，从理出来，从理论上上讲，在，在选择培养基中存活的克隆培养基中存活的克隆应该100地含有中靶基因。中靶基因的地含有中靶基因。中靶基因的信息可以通信息可以通过筛选标记基因基因侧翼翼cDNA或染色体或染色体组序列分析来序列分析来获得得此方法的此方法的优点：点：用常用常规方法方法进行基因敲除研究需耗行基因敲除研究需耗费大量的大量的时间和人力，通常一个基因剔除和人力，通常一个基因剔除纯合子合子小鼠的小鼠的获得需要一年或更得需要一年或更长的的时间。而利用基因捕。而利用基因捕获可以建立一个携可以建立一个携带随机插入突随机插入突变的的ES 细胞胞库，节省大量省大量筛选染色体染色体组文文库以及构建特异打靶以及构建特异打靶载体的工作及体的工作及费用，用，更有效和更迅速地更有效和更迅速地进行小鼠染色体行小鼠染色体组的功能分析。的功能分析。此方法的缺点：此方法的缺点：1）只能剔除在）只能剔除在ES细胞中表达的基因胞中表达的基因单种的种的细胞胞类型中表达的基因数目型中表达的基因数目约为I04，现在的基因捕在的基因捕获载体从理体从理论上来上来讲应能剔除所有在能剔除所有在ES细胞表达的基因，因此，在胞表达的基因，因此，在ES 细胞中胞中进行基因捕行基因捕获还是大有可是大有可为的。的。2）用基因捕）用基因捕获法法进行基因剔除的另一个缺点是无法行基因剔除的另一个缺点是无法对基因基因进行精行精细的的遗传修修饰。28转基因实验技术4)基因捕获法基因捕获法是最近发展起来的利用随机插入突变进行28基因捕基因捕获法的基本原理示意法的基本原理示意图.插入了靶目插入了靶目标的基因的基因转录翻翻译出无活性的目出无活性的目标蛋白随机插入内含子中蛋白随机插入内含子中,需要敲除的靶基因需要敲除的靶基因转录翻翻译出活性蛋白出活性蛋白29转基因实验技术基因捕获法的基本原理示意图.29转基因实验技术29基因敲除技术的应用基因敲除技术的应用1 1、建立生物模型，研究基因、建立生物模型，研究基因调控和基因功能；控和基因功能；2 2、疾病的分子机理研究和疾病的基因治、疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗；3 3、提供廉价的异种移植器官；、提供廉价的异种移植器官；4 4、改造生物、培育新的生物品种。、改造生物、培育新的生物品种。30转基因实验技术基因敲除技术的应用30转基因实验技术30基因敲除技术的缺陷基因敲除技术的缺陷随着基因敲除技随着基因敲除技术的的发展，早期技展，早期技术中的中的许多不足和缺陷多不足和缺陷都已都已经解决，但基因敲除技解决，但基因敲除技术始始终存在着一个存在着一个难以克服的以克服的缺点，即敲掉一个基因并不一定就能缺点，即敲掉一个基因并不一定就能获知知该基因的功能，基因的功能，其原因包括：其原因包括：1）许多基因在功能上是冗余的，多基因在功能上是冗余的，敲掉一个在功能上冗余敲掉一个在功能上冗余的基因，并不能造成容易的基因，并不能造成容易识别的表型，因的表型，因为基因家族的其基因家族的其他成他成员可以提供同可以提供同样的功能；的功能；2）对于某些必需基因，敲除后会造成于某些必需基因，敲除后会造成细胞的致死性，也就胞的致死性，也就无法无法对这些必需基因些必需基因进行相行相应的研究了。的研究了。31转基因实验技术基因敲除技术的缺陷随着基因敲除技术的发展，早期技术中的许多不31谢谢 谢！谢！32转基因实验技术谢 谢！32转基因实验技术3233转基因实验技术33转基因实验技术33