第三章动物细胞融合与杂交课件

第三章 动物细胞融合与杂交一、细胞融合和杂交概述二、细胞融合方法三、融合子的检出与鉴定四、杂交瘤技术概念：概念：细胞融合，细胞融合，HATHAT培养基，有限稀释法，单抗培养基，有限稀释法，单抗掌握：掌握：1 1、细胞融合的方法和原理、细胞融合的方法和原理 2 2、B B淋巴细胞杂交瘤技术的原理和过程淋巴细胞杂交瘤技术的原理和过程.第一节 细胞融合与杂交概述一.概念和目的细胞融合：自然或人为条件下，两个或两个以上细胞相互接触，发生膜融合、胞质融合和核融合形成融合细胞的现象。细胞杂交：不同类型的细胞之间发生的融合叫做细胞杂交。（种间杂交、种内杂交）目的：获得杂种优势.第二节 细胞融合的方法一、细胞融合的一般过程.细胞融合过程可分为：细胞融合过程可分为：凝集：凝集：细胞凝集与细胞膜的糖蛋白有关细胞凝集与细胞膜的糖蛋白有关蛋白质分子重新分布：蛋白质分子重新分布：是细胞融合的必要前提是细胞融合的必要前提脂质分子重排：脂质分子重排：是实现细胞融合的关键是实现细胞融合的关键胞质合并：胞质合并：后续的稳定步骤。后续的稳定步骤。.二融合方法二融合方法 最早被采用病毒融合剂有最早被采用病毒融合剂有疱疹病毒、疱疹病毒、天花病毒和副粘液病毒天花病毒和副粘液病毒等在内的病毒类等在内的病毒类融合剂。融合剂。灭活仙台病毒灭活仙台病毒介导细胞融合过程可介导细胞融合过程可以大大提高融合频率。它在病毒类融合以大大提高融合频率。它在病毒类融合剂中最为有效，使用最广。剂中最为有效，使用最广。1.1.病毒诱导融合：病毒诱导融合：.灭活的灭活的病毒既保留病毒既保留了诱导细胞了诱导细胞融合的能力，融合的能力，又不会感染又不会感染细胞。细胞。灭活仙台病毒诱导融合的机理灭活仙台病毒诱导融合的机理.使用仙台病毒诱导细胞融合步骤使用仙台病毒诱导细胞融合步骤1.1.先将亲本细胞分别制成悬液、混合离心先将亲本细胞分别制成悬液、混合离心2.2.将沉积细胞悬于将沉积细胞悬于1ml1ml灭活的仙台病毒悬液，灭活的仙台病毒悬液，置冰浴间歇摇动置冰浴间歇摇动2020分钟，细胞凝集分钟，细胞凝集3.3.温度升至温度升至3737 ，间歇摇动间歇摇动3030分钟，使其分钟，使其进行融合进行融合4.4.洗去病毒，即可将融合物悬浮于选择性洗去病毒，即可将融合物悬浮于选择性培养基进行培养。培养基进行培养。.2 2化学诱导融合化学诱导融合 它们主要包括聚乙二醇（它们主要包括聚乙二醇（PEGPEG）、聚）、聚乙烯吡咯烷酮（乙烯吡咯烷酮（PVPPVP）、聚乙烯醇、聚甘）、聚乙烯醇、聚甘油、溶血卵磷酯、磷脂酰丝氨酸、磷脂油、溶血卵磷酯、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、甘油醋酸酯、油酸、油胺和酰胆碱、甘油醋酸酯、油酸、油胺和二价阳离子载体等。其中则二价阳离子载体等。其中则以以PEGPEG的使用的使用最为广泛。最为广泛。.PEGPEG可能的促融合作用机理可能的促融合作用机理 1 1、PEGPEG可能使细胞膜的可能使细胞膜的脂类分子的物理结构发生重脂类分子的物理结构发生重排排，容易被，容易被PEGPEG作用打开细胞膜，使细胞融合。作用打开细胞膜，使细胞融合。2 2、PEGPEG可能会把可能会把细胞膜上的蛋白质分子排开细胞膜上的蛋白质分子排开，使脂，使脂质体扦入与膜结合。质体扦入与膜结合。3 3、PEGPEG可能作用于可能作用于膜磷脂极性基团和细胞膜表面蛋膜磷脂极性基团和细胞膜表面蛋白白。使膜磷脂的表面电位下降，同时使膜糖蛋白的。使膜磷脂的表面电位下降，同时使膜糖蛋白的排阻体积减少，最终使膜出现缺口，进而融合。排阻体积减少，最终使膜出现缺口，进而融合。.PEGPEG诱导细胞融合的效果：诱导细胞融合的效果：PEGPEG分子量大小分子量大小:1000100060006000浓度浓度:30306060。PEGPEG分子量和浓度越大，其融合率越高，但它的分子量和浓度越大，其融合率越高，但它的细胞毒性和粘度也随之增大细胞毒性和粘度也随之增大。一般认为。一般认为PECPEC浓度浓度为为30305050时，以分子量时，以分子量10001000的融合效果最佳。的融合效果最佳。如果浓度增至如果浓度增至5050和和6060时则改变时则改变PEG400PEG400为好。为好。PEGPEG的处理时间。的处理时间。悬浮法悬浮法，1 12 2分钟分钟 离心法离心法，5 58 8分钟分钟.若辅以若辅以5 51515的的二甲亚砜二甲亚砜或在融合前或在融合前先用先用植物血凝素植物血凝素处理一下，则效果更好。处理一下，则效果更好。PEGPEG诱导融合的优点：诱导融合的优点：PEGPEG来源广泛，操来源广泛，操作简单，诱导率也相对于病毒诱导要高。作简单，诱导率也相对于病毒诱导要高。使目前最常用的细胞融合诱导方法。使目前最常用的细胞融合诱导方法。.3 3电融合法：电融合法：电融合技术的原理：电融合技术的原理：悬于大小不同的两平行电极间的低导电率溶液悬于大小不同的两平行电极间的低导电率溶液中的细胞，在中的细胞，在1 1100MHz100MHz和和1001001000V/cm 1000V/cm 的交的交流电场中，会向小电极移动，并极化成偶极子，流电场中，会向小电极移动，并极化成偶极子，而而沿电场方向排列成串沿电场方向排列成串，此时再加上适当强度和，此时再加上适当强度和持续时间的高压电脉冲、即可使相邻细胞膜的接持续时间的高压电脉冲、即可使相邻细胞膜的接触区产生触区产生可逆电击穿可逆电击穿，从而触发细胞融合。，从而触发细胞融合。.电融合技术的优点电融合技术的优点 对细胞损伤小。对细胞损伤小。融合效率高。融合效率高。融合方法快速，可重复性强。融合方法快速，可重复性强。融合细胞可在光镜下直接观察、跟踪、融合细胞可在光镜下直接观察、跟踪、鉴定，可控性好。鉴定，可控性好。.最大的不利之处是仪器的购置。最大的不利之处是仪器的购置。在融合大小不同的细胞时存在问题。在融合大小不同的细胞时存在问题。在融合膜成分不同的细胞时存在困难。在融合膜成分不同的细胞时存在困难。电融合技术的不利之处：电融合技术的不利之处：.电融合技术的改进方法电融合技术的改进方法1、物理法、物理法 磁-电融合法 声-电融合法 电-机融合法2、化学法、化学法 利用化学试剂（刀豆蛋白A等）凝集细胞后电融合。3、特异性电融合法、特异性电融合法 利用抗原抗体特异性结合凝集细胞电击。.三、细胞融合的影响因素三、细胞融合的影响因素1.细胞种类和性质（细胞种类、细胞的表面性质、亲本细胞的亲缘关系）2.融合条件（温度、pH值、氧气）3.离子强度和种类（一般是Ca2+，50100mmol/L）.第三节 融合子的检出与鉴定一、融合子的筛选遗传互补筛选法：HAT筛选营养缺陷型互补选择法抗性互补选择法形态特征选择法生长特性选择法.脾细胞脾细胞脾细胞脾细胞(B(B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞)骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞脾细胞脾细胞脾细胞脾细胞/脾细胞脾细胞脾细胞脾细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞/骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞脾细胞脾细胞脾细胞脾细胞筛选出筛选出筛选出筛选出不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活不能长期存活.HATHATHAT培养基筛选培养基筛选培养基筛选培养基筛选培养基筛选培养基筛选H,次黄嘌呤次黄嘌呤;A,氨基喋呤氨基喋呤;T,胸腺嘧啶胸腺嘧啶DNADNA内源性途径内源性途径内源性途径内源性途径(主要途径主要途径主要途径主要途径)谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺 oror单磷酸尿苷酸单磷酸尿苷酸单磷酸尿苷酸单磷酸尿苷酸二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶AHHT T外源性途径外源性途径外源性途径外源性途径(旁路途径旁路途径旁路途径旁路途径)(HHypoxanthine ypoxanthine g guznine uznine p phosphohosphor ribosyl ibosyl t transferase)ransferase)次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (HGPRTHGPRT )胸腺嘧啶激酶胸腺嘧啶激酶胸腺嘧啶激酶胸腺嘧啶激酶 (TK TK)(T Thymidine hymidine k kinase)inase)B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞：HGPRTHGPRT+，TKTK+骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞：HGPRTHGPRT-，TKTK-存活存活存活存活死亡死亡死亡死亡外源性途径外源性途径外源性途径外源性途径(旁路途径旁路途径旁路途径旁路途径).二、融合子的鉴定1.细胞学鉴定：染色体鉴定2.生化分析：同工酶谱分析3.分子生物学鉴定：DNA探针技术.第四节 杂交瘤技术一、基础知识：抗体：免疫球蛋白抗原：可诱导机体产生免疫应答，并可与应答产物结合的外来“异物”。免疫反应：指机体免疫系统对异己物质的识别与清除等一系列复杂过程。抗体分子组成：2 Fab +1 Fc单抗：单克隆抗体是指由一个B细胞分化增殖的子代细胞(浆细胞)产生的针对单一抗原决定簇的抗体。（均一性、特异性）.二.B淋巴细胞杂交瘤技术基本原理：正常的可产生抗体的正常的可产生抗体的B淋巴细胞淋巴细胞与骨髓瘤细胞在融合剂的作用下产生融合，与骨髓瘤细胞在融合剂的作用下产生融合，杂交的细胞在杂交的细胞在HAT选择培养基中进行培养，选择培养基中进行培养，得到的为杂交瘤细胞，该细胞既具有可分得到的为杂交瘤细胞，该细胞既具有可分泌抗体的功能又可在体外大量增殖的能力。泌抗体的功能又可在体外大量增殖的能力。.Kohler and Milstein.脾细胞脾细胞脾细胞脾细胞(B(B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞)骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞长命长命长命长命不分泌抗体不分泌抗体不分泌抗体不分泌抗体分泌抗体分泌抗体分泌抗体分泌抗体短命短命短命短命分泌抗体分泌抗体分泌抗体分泌抗体长命长命长命长命KhlerKhler和和和和Milstein,1975Milstein,19751984年年Nobel医医 学学 奖奖杂交瘤技术路线杂交瘤技术路线杂交瘤技术路线杂交瘤技术路线.B B淋淋淋淋巴巴巴巴细细细细胞胞胞胞本本本本身身身身是是是是一一一一种种种种终终终终末末末末分分分分化化化化细细细细胞胞胞胞，通通通通常常常常不不不不再再再再进进进进行行行行细细细细胞分裂，存活一段时间后便会死亡胞分裂，存活一段时间后便会死亡胞分裂，存活一段时间后便会死亡胞分裂，存活一段时间后便会死亡短命细胞短命细胞短命细胞短命细胞（一）、亲本细胞概述（一）、亲本细胞概述脾脏与脾脏与脾脏与脾脏与B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞(B lymphocytes)(B lymphocytes)：一般来讲，脾脏有三大功能：1.它是“血库”，当人体休息安静时，它贮存血液；当处于运动、失血、缺氧等应激状态时，它又将血液排送到血循环中，以增加血容量。2.脾脏犹如一台“过滤器”，当血液中出现病菌、抗原、异物、原虫时，脾脏中的巨噬细胞、淋巴细胞就会将其吃掉。3.脾脏还可以制造免疫球蛋白、补体等免疫物质，发挥免疫作用。.B淋巴细胞发育过程：淋巴细胞发育过程：祖祖B淋巴细胞淋巴细胞前前B淋巴细胞淋巴细胞 成熟成熟B淋巴细胞淋巴细胞 抗原刺激、递呈细抗原刺激、递呈细 胞和胞和Th细胞作用细胞作用活化活化B淋巴细胞淋巴细胞分化为浆细胞分化为浆细胞.骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 (myeloma cells):(myeloma cells):恶恶恶恶性性性性增增增增殖殖殖殖的的的的转转转转化化化化细细细细胞胞胞胞，只只只只要要要要营营营营养养养养条条条条件件件件适适适适合合合合可可可可永永永永远远远远分分分分裂裂裂裂和和和和存活存活存活存活长命细胞长命细胞长命细胞长命细胞。能在体外连续生长，倍增期短于能在体外连续生长，倍增期短于24小时；小时；缺乏缺乏HGPRT酶；酶；克隆效应高；克隆效应高；在动物中有致肿瘤性；在动物中有致肿瘤性；与小鼠淋巴细胞融合率相当高；与小鼠淋巴细胞融合率相当高；本身不合成本身不合成Ig，且不抑制杂交瘤细胞中的，且不抑制杂交瘤细胞中的Ig合成基因。合成基因。骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞 的选择原则的选择原则的选择原则的选择原则.（二）、杂交瘤技术的操作流程（二）、杂交瘤技术的操作流程1.动物免疫：动物免疫：目的：目的：目的：目的：在在在在细细细细胞胞胞胞融融融融合合合合后后后后获获获获得得得得尽尽尽尽可可可可能能能能多多多多的的的的分分分分泌泌泌泌针针针针对对对对于于于于该该该该目目目目标标标标抗抗抗抗原原原原的的的的特特特特异异异异性性性性抗抗抗抗体的杂交瘤细胞体的杂交瘤细胞体的杂交瘤细胞体的杂交瘤细胞.特定特定特定特定目标抗原目标抗原目标抗原目标抗原动物动物动物动物免疫免疫免疫免疫脾脏中脾脏中脾脏中脾脏中B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞大量增殖大量增殖大量增殖大量增殖刺激刺激刺激刺激能分泌针对于该抗能分泌针对于该抗能分泌针对于该抗能分泌针对于该抗原的原的原的原的特异性抗体特异性抗体特异性抗体特异性抗体.免疫动物的选择免疫动物的选择 选择免疫动物，即供脾动物，通常选选择免疫动物，即供脾动物，通常选用小鼠。正常供体和骨髓瘤细胞种系发用小鼠。正常供体和骨髓瘤细胞种系发生越近缘，产生的杂交瘤就越稳定生越近缘，产生的杂交瘤就越稳定(反之反之亦然亦然)。因为作为融合用的大多数小鼠骨。因为作为融合用的大多数小鼠骨髓瘤细胞是从髓瘤细胞是从BALB/CBALB/C纯系小白鼠取得，纯系小白鼠取得，所以用所以用BALB/CBALB/C作脾细胞供体最为合适。作脾细胞供体最为合适。.常规免疫法常规免疫法常规免疫法常规免疫法脾内一次性免疫法脾内一次性免疫法脾内一次性免疫法脾内一次性免疫法短程免疫法短程免疫法短程免疫法短程免疫法体外免疫法体外免疫法体外免疫法体外免疫法 常用免疫方法：常用免疫方法：常用免疫方法：常用免疫方法：“稳妥；优势克隆稳妥；优势克隆稳妥；优势克隆稳妥；优势克隆”皮下注射皮下注射皮下注射皮下注射腹腔注射腹腔注射腹腔注射腹腔注射静脉注射静脉注射静脉注射静脉注射免疫途径：免疫途径：免疫途径：免疫途径：“省时；省抗原省时；省抗原省时；省抗原省时；省抗原”“省时省时省时省时”“操作繁琐操作繁琐操作繁琐操作繁琐”.免疫方案免疫方案 a.a.颗粒性抗原颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以很好的免疫效果。下面以细胞性抗原细胞性抗原为例的免疫方为例的免疫方案案:初次免疫初次免疫1101100.5ml ip(0.5ml ip(腹腔内注射腹腔内注射)2 23 3周后周后第二次免疫第二次免疫1101100.5ml ip0.5ml ip3 3周后周后加强免疫加强免疫(融合前三天融合前三天)1101100.5ml ip0.5ml ip或或iv(iv(静脉内注射静脉内注射)取脾融合取脾融合.b.可溶性抗原可溶性抗原免疫原性弱，一般要加免疫原性弱，一般要加佐剂佐剂;初次免疫 Ag150g加福氏完全佐剂福氏完全佐剂皮下多点注射(一般0.81ml0.2ml点)3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip(ip剂量不宜超过0.5ml)3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip(57天后采血测其效价，检测免疫效果)23周后加强免疫，剂量50500g为宜，ip或iv3天后取脾融合.（2）、细胞融合及）、细胞融合及HAT筛选筛选1 1、细胞融合方法：、细胞融合方法：1)1)脾细胞悬液的制备：脾细胞悬液的制备：脾细胞悬液的制备：脾细胞悬液的制备：最后一次加强免疫后第最后一次加强免疫后第最后一次加强免疫后第最后一次加强免疫后第3 3天制备天制备天制备天制备（机械分离法），培养基（机械分离法），培养基（机械分离法），培养基（机械分离法），培养基RPMI1640RPMI1640。2)2)骨髓瘤细胞悬液的制备：骨髓瘤细胞悬液的制备：骨髓瘤细胞悬液的制备：骨髓瘤细胞悬液的制备：于对数生长期挑选形态较好的细胞，于对数生长期挑选形态较好的细胞，于对数生长期挑选形态较好的细胞，于对数生长期挑选形态较好的细胞，台盼兰染色后计数，挑选台盼兰染色后计数，挑选台盼兰染色后计数，挑选台盼兰染色后计数，挑选8080以上存活率的细胞离心后重新悬浮。以上存活率的细胞离心后重新悬浮。以上存活率的细胞离心后重新悬浮。以上存活率的细胞离心后重新悬浮。2)50%PEG2)50%PEG配制：配制：配制：配制：称取称取称取称取2gPEG2gPEG（10001000或或或或40004000）于青霉素瓶）于青霉素瓶）于青霉素瓶）于青霉素瓶加塞，加塞，加塞，加塞，8 8磅（磅（磅（磅（0.06MPa0.06MPa）15min15min，待冷至，待冷至，待冷至，待冷至5050加等量预热的不加等量预热的不加等量预热的不加等量预热的不含血清的培养基。含血清的培养基。含血清的培养基。含血清的培养基。.1 1）10108 8小鼠脾细胞与小鼠脾细胞与10107 7骨髓瘤细胞混合，离心（骨髓瘤细胞混合，离心（1000rpm1000rpm，10min10min），弃上清。），弃上清。2 2）轻扣管底，混匀细胞，）轻扣管底，混匀细胞，3737水浴水浴3 3）60s60s内滴加内滴加0.6ml 500.6ml 50PEGPEG，边滴边摇动试管，边滴边摇动试管，30s30s内内将细胞悬液吸入吸管静置将细胞悬液吸入吸管静置30s30s，再在，再在30s30s内缓慢转入离心内缓慢转入离心管；管；5min5min内后加入内后加入10mlDMEM10mlDMEM终止终止PEGPEG作用。作用。3 3）离心，弃上清，加）离心，弃上清，加15mL HAT15mL HAT培养基，混匀，转入培养基，混匀，转入9696孔孔板（预先有板（预先有HATHAT培养基培养的饲养细胞），每孔培养基培养的饲养细胞），每孔100 ul100 ul。4 4）3737孵箱孵育，孵箱孵育，2-32-3天换天换 HATHAT一次，持续一次，持续2 2周周3)3)细胞融合：细胞融合：细胞融合：细胞融合：.细胞融合注意事项：细胞融合注意事项：细胞融合注意事项：细胞融合注意事项：1 1、细胞比例细胞比例：脾细胞：脾细胞/瘤细胞约瘤细胞约5-10/15-10/1。2 2、反应时间反应时间：慢、转、柔。：慢、转、柔。3 3、反应温度反应温度：3737，所有用液均需提前预热。，所有用液均需提前预热。4 4、PEGPEG选择选择：分子量、浓度（：分子量、浓度（3050%3050%间）。间）。5 5、不要使用含有血清的培养基不要使用含有血清的培养基（PEGPEG能引起蛋白质沉淀）能引起蛋白质沉淀）。.2 2、HATHAT培养基的筛选培养基的筛选培养基的筛选培养基的筛选融合后细胞混合液融合后细胞混合液融合后细胞混合液融合后细胞混合液HATHAT培养基培养基培养基培养基2 weeks later2 weeks laterHTHT培养基培养基培养基培养基正常培养基正常培养基正常培养基正常培养基1 week later1 week later.HATHATHAT培养基筛选培养基筛选培养基筛选培养基筛选培养基筛选培养基筛选H,次黄嘌呤次黄嘌呤;A,氨基喋呤氨基喋呤;T,胸腺嘧啶胸腺嘧啶DNADNA内源性途径内源性途径内源性途径内源性途径(主要途径主要途径主要途径主要途径)谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺谷氨酰胺 oror单磷酸尿苷酸单磷酸尿苷酸单磷酸尿苷酸单磷酸尿苷酸二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶AHHT T外源性途径外源性途径外源性途径外源性途径(旁路途径旁路途径旁路途径旁路途径)(HHypoxanthine ypoxanthine g guznine uznine p phosphohosphor ribosyl ibosyl t transferase)ransferase)次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (HGPRTHGPRT )胸腺嘧啶激酶胸腺嘧啶激酶胸腺嘧啶激酶胸腺嘧啶激酶 (TK TK)(T Thymidine hymidine k kinase)inase)B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞：HGPRTHGPRT+，TKTK+骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞：HGPRTHGPRT-，TKTK-存活存活存活存活死亡死亡死亡死亡外源性途径外源性途径外源性途径外源性途径(旁路途径旁路途径旁路途径旁路途径).（3）、）、杂交瘤细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选（抗体的检测）抗体的检测）一般在杂交瘤细胞布满孔底110面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。.酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法(ELISA)(ELISA)抗原抗原抗原抗原第第第第1 1抗体抗体抗体抗体酶酶酶酶第第第第2 2抗体抗体抗体抗体待检杂交瘤培养上清液待检杂交瘤培养上清液待检杂交瘤培养上清液待检杂交瘤培养上清液底物底物底物底物有色产物有色产物有色产物有色产物酶标仪检测酶标仪检测酶标仪检测酶标仪检测技术原理：技术原理：技术原理：技术原理：.（4）、杂交瘤细胞的克隆培养）、杂交瘤细胞的克隆培养 克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆。克隆化的原则克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。.杂交瘤细胞的克隆培养杂交瘤细胞的克隆培养常用克隆化方法：常用克隆化方法：常用克隆化方法：常用克隆化方法：常用克隆化方法：常用克隆化方法：有限稀释法有限稀释法有限稀释法有限稀释法软琼脂平板法软琼脂平板法软琼脂平板法软琼脂平板法uu8080个细胞个细胞个细胞个细胞/96/96孔孔孔孔uu饲养细胞饲养细胞饲养细胞饲养细胞(feeder cells)(feeder cells)ELISAELISA法法法法检检检检测测测测单单单单克克克克隆隆隆隆杂杂杂杂交交交交瘤瘤瘤瘤细细细细胞胞胞胞的的的的培培培培养养养养上上上上清清清清，选选选选出出出出分分分分泌泌泌泌特特特特异异异异性性性性抗抗抗抗体体体体的的的的阳阳阳阳性性性性孔孔孔孔，所所所所分分分分泌泌泌泌抗抗抗抗体体体体即即即即为为为为单克隆抗体。单克隆抗体。单克隆抗体。单克隆抗体。.1 1）、有限稀释法）、有限稀释法 有限稀释法有限稀释法原理原理是从理论上将细胞稀释是从理论上将细胞稀释到到1010个个/ml/ml，然后装成每小孔，然后装成每小孔(96(96孔板孔板)0.1ml0.1ml，使每孔理论上含有单个细胞使每孔理论上含有单个细胞，经过培养后即可获得单个细胞形成集落。经过培养后即可获得单个细胞形成集落。有时为了加快克隆细胞生长速度，常采有时为了加快克隆细胞生长速度，常采用腹腔巨噬细胞做饲养层细胞。用腹腔巨噬细胞做饲养层细胞。.1.1.取取1.0 ml 5101.0 ml 5104 4mlml细胞细胞+4ml+4ml培养基稀释，培养基稀释，得得1101104 4/ml./ml.2.2.取取0.5ml 1100.5ml 1104 4mlml细胞液细胞液+9.5ml+9.5ml培养基稀培养基稀释，释，得得1101103 3/ml./ml.3.3.取取1.0ml 1101.0ml 1103 3mlml细胞液细胞液+9.0ml+9.0ml培养基稀培养基稀释，释，得得1101102 2/ml./ml.有限稀释法举例：有限稀释法举例：.2 2）软琼脂培养法：）软琼脂培养法：本法对于某些抗原，可以把克隆化培养本法对于某些抗原，可以把克隆化培养与特异性筛选测定结合起来进行，所以与特异性筛选测定结合起来进行，所以它的特点是效率较高，速度较快。但缺它的特点是效率较高，速度较快。但缺点是克隆率不高。点是克隆率不高。.利用单个细胞在软琼脂培养基上的局限化利用单个细胞在软琼脂培养基上的局限化生长，待细胞集落长到肉眼可见后，用巴生长，待细胞集落长到肉眼可见后，用巴氏吸管从琼脂上挑出来氏吸管从琼脂上挑出来(一般一般810810天后天后)，再移到液体培养基中，进行生长繁殖，再移到液体培养基中，进行生长繁殖，并检测培养上清液的活性。并检测培养上清液的活性。基本原理基本原理.饲养细胞饲养细胞 在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，需要加入饲养细胞。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞。.饲养层细胞的作用饲养层细胞的作用提高培养细胞的密度，使待克隆细胞容易提高培养细胞的密度，使待克隆细胞容易生存与繁殖。生存与繁殖。腹腔细胞能清除培养中的死亡细胞，从而腹腔细胞能清除培养中的死亡细胞，从而促进单个细胞克隆的生长。促进单个细胞克隆的生长。饲养细胞能释放诸如细胞生长因子类物质，饲养细胞能释放诸如细胞生长因子类物质，起到促进细胞分裂、增殖的作用。起到促进细胞分裂、增殖的作用。.目的：目的：保种。方法：方法：离心收集杂交瘤细胞悬液，用含10DMSO和10FBS的培养基调整细胞密度，若短期保存，可置-80度冰盒中；若长期保存，则从冰盒转入液氮中。复苏：复苏：如果冻存的细胞是来自96孔板的一孔，复苏后也应接种到96孔板的一个孔中（5）杂交瘤细胞的冻存与复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏.大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为1060gml，如果大量生产，费用较高。体内接种杂交瘤细胞，制备腹水。（6）单克隆抗体的大量生产）单克隆抗体的大量生产.腹水的制备腹水的制备 常规是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液体石腊于BaLbc鼠，12周后腹腔注射1106个杂交瘤细胞，接种细胞710天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获110ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml，这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。.回顾：回顾：1）免疫脾细胞的制备 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选 3）细胞融合（关键）4）HAT培养基筛选杂交瘤细胞 5）阳性克隆的筛选（尽早、反复原则）6）克隆化（先行巨噬细胞饲养层的制备）7）细胞的冻存与复苏 8）大规模单克隆抗体的制备（腹水法）.（三）单抗制备过程中常见问题（三）单抗制备过程中常见问题单抗制备实验周期长、步骤多，稍有不慎单抗制备实验周期长、步骤多，稍有不慎就会出现这样那样的问题。就会出现这样那样的问题。一、融合后杂交瘤细胞不生长 若排除融合技术问题，主要原因可能是：1、胎牛血清质量太差。2、细胞培养时有支原体或细菌污染。3、HAT的问题：A含量过高或者HT含量不足。4、PEG的问题：毒性太大或作用时间过长。.二、融合后有杂交瘤细胞生长，但无抗体产生1、免疫原的抗原性弱，或免疫效果不好。2、HAT中A失效，或骨髓瘤细胞突变。3、非抗体分泌性细胞克隆竞争性生长。.三、杂交瘤细胞难以克隆化1、血清质量。2、杂交瘤细胞的活性状态。3、有支原体污染。4、培养基类型，如早期用HT慢慢过渡到常规培养基。5、饲养层细胞制备的问题。.四、污染细菌性霉菌性支原体 对策：操作的无菌血清环境的维护.补充知识：人源化单克隆抗体什么是人源化单抗？用小鼠制备的普通单抗药物叫鼠源单抗，由于其100%鼠的成分，免疫原性非常强，常引起人体的免疫反应，毒副作用明显。抗体人源化技术是把鼠源性单抗的大部分转换为人的成分，使之接近于人体自身的抗体，从而消除人体免疫系统对外源性单抗的排异反应。.人源化单抗制作策略取得抗体效价高的小鼠B细胞，细胞融合杂交后筛出阳性克隆，培养后提取mRNA，反转录装入载体测序，基因操作剪切替换，然后载体在合适体系中表达，然后纯化抗体。.图示图示 人鼠嵌合抗体的制备（共转染模式和单载体转染模式）人鼠嵌合抗体的制备（共转染模式和单载体转染模式）.