第四章半薄切片法和超薄切片法课件

植物材料的半薄切片技术植物材料的半薄切片技术 固定液固定液 戊二醛固定液戊二醛固定液 1.固定液的特性固定液的特性 能能和和蛋蛋白白质质分分子子的的氨氨基基和和肽肽键键很很快快交交联联而而起到稳定蛋白质的作用，对组织的渗透力强。起到稳定蛋白质的作用，对组织的渗透力强。对对锇锇酸酸不不能能固固定定的的糖糖原原和和某某些些蛋蛋白白结结构构如如微微管管有有很很好好的的保保存存作作用用，对对核核蛋蛋白白的的固固定定也也比比锇酸好。锇酸好。戊戊二二醛醛对对脂脂类类的的保保存存很很差差，也也不不能能使使细细胞胞产生足够的反差。产生足够的反差。12.2.戊二醛固定液的配制：戊二醛固定液的配制：0.2M磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（ml）（最终浓度为（最终浓度为0.1M0.1M）505050505025%戊二醛（戊二醛（ml）810121620蒸馏水（蒸馏水（ml）4240383430戊二醛最终浓度戊二醛最终浓度（%）22.53.04.05.02.戊二醛固定液的配制：0.2M磷酸缓冲液（ml）505052锇酸固定液锇酸固定液 1.1.锇酸的特性锇酸的特性不不但但能能够够固固定定蛋蛋白白质质，同同时时对对一一些些脂脂类类具具有有很很好好的的固固定定作作用用，因因此此锇锇酸酸能能将将戊戊二二醛未能固定的组织加以固定。醛未能固定的组织加以固定。锇锇是是重重金金属属，用用锇锇酸酸固固定定的的细细胞胞可可以以增增加电子反差。加电子反差。锇锇酸酸不不使使细细胞胞收收缩缩、膨膨胀胀、变变脆脆、变变硬硬等优点，用它固定的材料切割性能好。等优点，用它固定的材料切割性能好。锇酸固定液 3锇酸分子量大，造成渗透缓慢。锇酸分子量大，造成渗透缓慢。对核酸和糖原的保存作用很差。对核酸和糖原的保存作用很差。锇锇酸酸大大都都封封装装在在安安培培瓶瓶中中，为为淡淡黄黄色色晶晶体体，是是一一种种强强氧氧化化剂剂。新新鲜鲜的的锇锇酸酸溶溶液液颜颜色色为为浅浅黄黄，如如果果贮贮存存时时间间太太长长或或容容器器不不干干净净，溶液很快还原成黑色而失效。溶液很快还原成黑色而失效。锇酸分子量大，造成渗透缓慢。42.2.锇酸配制方法锇酸配制方法 锇锇酸酸一一般般包包装装为为0.1g，0.25g，0.5g，1g安安培培瓶瓶，常配成常配成2的锇酸溶液。的锇酸溶液。将将安安培培瓶瓶洗洗净净，最最好好在在洗洗液液中中浸浸泡泡数数小小时时到到两天，然后用清水冲洗数次，再用蒸馏水洗涤。两天，然后用清水冲洗数次，再用蒸馏水洗涤。干干燥燥后后用用砂砂轮轮刻刻一一圈圈痕痕迹迹放放入入棕棕色色磨磨口口玻玻璃璃瓶中，加盖后用力摇动，使安培瓶破碎。瓶中，加盖后用力摇动，使安培瓶破碎。按比例加入蒸馏水或缓冲液。按比例加入蒸馏水或缓冲液。配配好好的的锇锇酸酸溶溶液液密密封封后后存存放放在在24的的冰冰箱箱中中，至少要经过至少要经过24小时的熟化后才能使用。小时的熟化后才能使用。2.锇酸配制方法5材料固定材料固定 采用戊二醛和锇酸双重固定法。采用戊二醛和锇酸双重固定法。1 1、将材料切成将材料切成0.51.0 mm0.51.0 mm3 3的小的小块块。2.2.前前固固定定 把把材材料料浸浸入入戊戊二二醛醛固固定定液液中中，抽气后固定抽气后固定2424小小时时或在冰箱中或在冰箱中过过夜。夜。3.3.洗洗涤涤 倒倒掉掉固固定定液液，用用0.1M0.1M磷磷酸酸缓缓冲冲液液(pH7.3)(pH7.3)洗涤洗涤3434次，每次次，每次15201520分钟。分钟。材料固定 6 4.4.后后固固定定 将将材材料料投投入入1 1锇锇酸酸固固定定液液中中，在在44冰箱中固定冰箱中固定1414小时。小时。5.5.洗洗涤涤 倒倒掉掉固固定定液液（放放入入专专用用回回收收瓶瓶），用用0.1M磷酸缓冲液洗涤磷酸缓冲液洗涤4次，每次次，每次1520分钟。分钟。脱水脱水 采采用用各各级级酒酒精精或或丙丙酮酮，在在室室温温条条件件下下，按按30305050707085859595100100100100逐逐级级脱脱水水，每每级级需需3030分分钟钟，但但在在纯纯酒酒精精中中每每次次则需停留则需停留1212小时。小时。4.后固定 将材料投入1锇酸固定液中，在4冰箱中7渗透与包埋渗透与包埋 乙乙 二二 醇醇 甲甲 基基 丙丙 烯烯 酸酸 脂脂 包包 埋埋 法法(glycolmethacrylate以下简称以下简称GMA)。GMA的性质的性质 水水溶溶性性塑塑料料包包埋埋剂剂，凝凝固固后后可可以以很很容容易易被被切成切成12 m的薄片。的薄片。可可以以保保存存组组织织、细细胞胞中中很很多多化化合合物物(蛋蛋白白质质、核酸核酸)很少变性。很少变性。可可以以保保持持细细胞胞的的酶酶活活性性，所所以以由由GMA制制成成的的切切片片也也适适合合做做组组织织化化学学、酶酶活活性性和和荧荧光光显显微微观观察。察。染色时无需把塑料去掉，便可以直接染色。染色时无需把塑料去掉，便可以直接染色。渗透与包埋 8GMAGMA混合包埋剂的配方混合包埋剂的配方 GMA 93g GMA 93g 聚乙二醇聚乙二醇400(400(增塑剂增塑剂)7g)7g 过氧化苯酰过氧化苯酰 （加速剂）（加速剂）0.6g 0.6g GMA混合包埋剂的配方 9渗透与包埋渗透与包埋 浸透浸透 1 1、GMAGMA混混合合液液和和无无水水酒酒精精或或丙丙酮酮（1 1：1 1），10121012小时。小时。2 2、纯、纯GMAGMA包埋剂替换包埋剂替换3 3次，每次次，每次2424小时。小时。3 3、以上步骤均在、以上步骤均在0404冰箱中进行。冰箱中进行。包包埋埋 先先在在多多孔孔橡橡胶胶模模板板中中注注入入少少量量的的包包埋埋剂剂，后后用用牙牙签签将将材材料料挑挑起起放放进进模模板板中中，然然后后注注满包埋剂，放上标签。满包埋剂，放上标签。聚聚合合 将将模模板板放放入入温温箱箱中中，按按40 1天天，50 1天，天，60 1天的顺序升温聚合。天的顺序升温聚合。渗透与包埋 10橡胶包埋板橡胶包埋板橡胶包埋板11切片切片制刀制刀 超超薄薄切切片片和和半半薄薄切切片片都都需需用用玻玻璃璃刀刀切切片片，玻玻璃刀可用制刀机制作，也可手工制作。璃刀可用制刀机制作，也可手工制作。组织块的修整和切片组织块的修整和切片 1.1.将将包包埋埋块块夹夹在在样样品品夹夹上上，有有材材料料的的一一端端向向上，在解剖镜下修整上，在解剖镜下修整.2.2.把把初初步步修修整整好好的的组组织织块块装装在在切切片片机机夹夹物物部部上，再进一步修整使材料略露出。上，再进一步修整使材料略露出。3.3.在在玻玻璃璃刀刀上上进进行行半半薄薄切切片片，每每切切一一片片后后直直接接用用细细毛毛笔笔尖尖从从刀刀口口上上取取下下放放在在有有水水滴滴的的载载玻玻片上展片。片上展片。切片12超薄切片机超薄切片机超薄切片机13展片与粘片展片与粘片 展展片片时时，放放在在70的的温温台台上上展展片片(包包埋埋剂剂不不必必除除去去，它它本本身身与与玻玻璃璃还还有有一一定定的的粘粘着着力力，一一般般也也不不必使用粘着剂必使用粘着剂)。染色染色 染染石石蜡蜡切切片片的的染染料料都都可可以以用用来来染染GMAGMA薄薄切切片片。以以甲苯胺甲苯胺蓝蓝-O-O为为例来例来说说明染色程序。明染色程序。1.1.将将甲甲苯苯胺胺蓝蓝染染液液滴滴在在载载玻玻片片的的材材料料上上染染色色1212分分钟钟。2.2.蒸蒸馏馏水清洗。水清洗。3.3.室温下干燥。室温下干燥。4.4.树树胶封片。胶封片。展片与粘片 14小麦叶片的显微结构（半薄切片）小麦叶片的显微结构（半薄切片）小麦叶片的显微结构（半薄切片）15小麦叶片的显微结构（石蜡切片）小麦叶片的显微结构（石蜡切片）小麦叶片的显微结构（石蜡切片）16植物材料的超薄切片技术植物材料的超薄切片技术 取材取材 材材料料大大小小：1mm3大大小小的的小小块块。太太大大固固定定液液不不易易透透入入，造造成成材材料料的的内内外外固固定定不不均均一一；太太小则材料受损伤的比例增高。小则材料受损伤的比例增高。在取材时要注意两个方面在取材时要注意两个方面：1.1.切切取取后后的的组组织织应应立立即即放放入入固固定定液液中中进进行行固定。固定。2.2.要使试验和对照的取材严格一致。要使试验和对照的取材严格一致。植物材料的超薄切片技术 17固定固定 采用戊二醛和锇酸双重固定法。采用戊二醛和锇酸双重固定法。(1)(1)将将材材料料投投入入2.52.5戊戊二二醛醛固固定定液液中中，室室温下固定温下固定2 2小时。小时。(2)(2)倒倒去去戊戊二二醛醛固固定定液液，材材料料用用0.1M0.1M磷磷酸酸缓缓冲液冲洗三次，每次放置冲液冲洗三次，每次放置3030分钟。分钟。(3)(3)用用2 2锇酸在锇酸在44冰箱中固定冰箱中固定2424小时。小时。(4)用磷酸缓冲液冲洗用磷酸缓冲液冲洗同同(2)。固定18脱水脱水 (1)30(1)30丙酮丙酮 15 15分钟分钟(2)50(2)50丙酮丙酮 15 15分钟分钟(3)70(3)70丙酮丙酮 15 15分钟分钟(4)80(4)80丙酮丙酮 15 15分钟分钟(5)90(5)90丙酮丙酮 15 15分钟分钟(6)100(6)100丙酮丙酮 30 30分钟分钟(7)100(7)100丙酮丙酮 30 30分钟分钟脱水19渗透、包埋与聚合渗透、包埋与聚合 包埋包埋剂剂Epon8l2Epon8l2混合物可按下列配方去配制：混合物可按下列配方去配制：春、秋季春、秋季 夏季夏季 冬季冬季 (mlml)()(mlml)()(mlml）Epon812 13 13 13 Epon812 13 13 13 DDSA(DDSA(软软化化剂剂)8 7 10)8 7 10 MNA(MNA(固定固定剂剂)7 10 1-8)7 10 1-8 DMP-30(DMP-30(加速加速剂剂)15)15滴滴 15 15滴滴 15 15滴滴 前前三三种种药药物物按按顺顺序序混混合合后后搅搅拌拌均均匀匀，然然后后边边搅搅动动边边一一滴滴滴滴加加入入DMP-30，每每加加一一滴滴充充分分搅搅拌拌后后，再加下一滴，一般要搅拌半小时以上。再加下一滴，一般要搅拌半小时以上。渗透、包埋与聚合20渗透：渗透：(1)(1)材料入丙酮：包埋剂材料入丙酮：包埋剂=3=3：1 1的混合物中的混合物中2 2小时。小时。(2)(2)丙酮：包埋剂丙酮：包埋剂=2=2：2 2的混合物中的混合物中2 2小时。小时。(3)(3)丙酮：包埋剂丙酮：包埋剂=1=1：3 3的混合物中的混合物中2 2小时。小时。(4)(4)转入纯包埋剂中过夜。转入纯包埋剂中过夜。包包埋埋：将将材材料料转转入入包包埋埋板板中中，放放好好标标鉴鉴，注注满满纯纯包包埋剂，放入埋剂，放入3737温箱中过夜。温箱中过夜。聚合：聚合：将包埋板放入将包埋板放入6060温箱中聚合温箱中聚合24482448小时。小时。切片和染色切片和染色 采用采用醋酸铀和柠檬酸铅醋酸铀和柠檬酸铅的双染法。的双染法。渗透：21铜网和支持膜铜网和支持膜 1、铜网：超薄切片要放在铜网上才能进、铜网：超薄切片要放在铜网上才能进行染色，并最终放入电镜中观察。行染色，并最终放入电镜中观察。2、支持膜：铜网的网孔很小，但相对于、支持膜：铜网的网孔很小，但相对于样品还较大，因此，要在铜网上覆盖一层透样品还较大，因此，要在铜网上覆盖一层透明的薄膜，这层膜，叫支持膜。明的薄膜，这层膜，叫支持膜。铜网和支持膜22铜网铜网铜网23支持膜（支持膜（Formvar 膜）的制备膜）的制备支持膜（Formvar 膜）的制备24超薄切片制作过程示意图超薄切片制作过程示意图超薄切片制作过程示意图25小麦叶片的超微结构（超薄切片）小麦叶片的超微结构（超薄切片）小麦叶片的超微结构（超薄切片）26叶绿体的超微结构叶绿体的超微结构叶绿体的超微结构27正在解体的叶绿体正在解体的叶绿体正在解体的叶绿体28小麦叶片的超微结构（超薄切片）小麦叶片的超微结构（超薄切片）小麦叶片的超微结构（超薄切片）29扫描电子显微镜样品的制备扫描电子显微镜样品的制备1、取样、取样2、固定：戊二醛、锇酸双固定法。、固定：戊二醛、锇酸双固定法。3、冲洗：缓冲液冲洗。、冲洗：缓冲液冲洗。4、脱水与置换、脱水与置换 酒精梯度脱水，乙酸异戊酯置换纯乙醇，酒精梯度脱水，乙酸异戊酯置换纯乙醇，因为乙酸异戊酯与液体二氧化碳能更好的互因为乙酸异戊酯与液体二氧化碳能更好的互溶，便于进行液体二氧化碳临界干燥。溶，便于进行液体二氧化碳临界干燥。扫描电子显微镜样品的制备305、临界法干燥、临界法干燥6、粘样：将干燥好的样品用双面透明胶粘、粘样：将干燥好的样品用双面透明胶粘在样品台上。在样品台上。7、喷涂：在样品上喷涂、喷涂：在样品上喷涂1020nm厚的金厚的金或铝，使样品具有良好的导电性。或铝，使样品具有良好的导电性。5、临界法干燥31第四章半薄切片法和超薄切片法课件32第四章半薄切片法和超薄切片法课件33