生物化学核酸化学培训课件

本章内容本章内容l概述lDNAlRNAl核酸的性质7/10/20241生物化学核酸化学第一节第一节 核酸的发展历史及研究现状核酸的发展历史及研究现状 7/10/20242生物化学核酸化学核酸化学研究史（核酸化学研究史（1 1）18691869年年 Miescher,Miescher,博士论文工作博士论文工作中测定淋巴细胞蛋白质组成时中测定淋巴细胞蛋白质组成时,发现了不溶于稀酸和盐溶液的沉发现了不溶于稀酸和盐溶液的沉淀物淀物,并在所有细胞的核里都找并在所有细胞的核里都找到了此物质到了此物质,故命名故命名 核质核质(Nuclein)(Nuclein)18791879年年 Kossel Kossel经过经过1010年的努力年的努力,搞清楚核质中有四种不同的组成搞清楚核质中有四种不同的组成部分部分:A,T,C:A,T,C 和和 G G；核酸研究史17/10/20243生物化学核酸化学核酸化学研究史（核酸化学研究史（2 2）18891889年年 Altman Altman建议将建议将“核质核质”改名为改名为“核酸核酸”,”,因为已经认识到因为已经认识到“核质核质”乃乃“核酸核酸”与蛋白质的复合体。与蛋白质的复合体。19091909年年 Levene Levene 发现酵母的核酸含有核糖发现酵母的核酸含有核糖19301930年年 Levene Levene 发现动物细胞的核酸含有发现动物细胞的核酸含有一种特殊的核糖脱氧核糖一种特殊的核糖脱氧核糖,得出了一得出了一个错误概念个错误概念:植物核酸含核糖植物核酸含核糖,动物核酸动物核酸含脱氧核糖。这个错误概念一直延续到含脱氧核糖。这个错误概念一直延续到19381938年，这时方清楚年，这时方清楚RNARNA和和DNADNA的区别。的区别。LeveneLevene还提出了核酸的还提出了核酸的“磷酸核糖磷酸核糖(碱碱基基)磷酸磷酸 的骨架结构的骨架结构,解决了解决了DNADNA分子分子的线性问题的线性问题,还在还在19351935年提出年提出 四核苷酸四核苷酸,认为这四种碱基的含量是一样的。认为这四种碱基的含量是一样的。核酸研究史27/10/20244生物化学核酸化学核酸化学研究史（核酸化学研究史（3 3）19501950年年 Chargaff,E Chargaff,E和和Hotchkiss,R.D.Hotchkiss,R.D.采用纸层析法仔细采用纸层析法仔细分析了分析了DNADNA的组成成分的组成成分,得知得知A=T,G=C,A+G=C+TA=T,G=C,A+G=C+T19531953年年 Watson,Crick Watson,Crick根据根据DNADNA的的X X射射线图谱的研究结果线图谱的研究结果,提出了提出了DNADNA的双的双螺旋模型螺旋模型(Double helix)(Double helix)。几星期。几星期后提出了半保留式复制模型。后提出了半保留式复制模型。19571957年年 Meselsnhe&Stahl Meselsnhe&Stahl用密度梯用密度梯度超离心法度超离心法,证实半保留复制假说。证实半保留复制假说。核酸研究史37/10/20245生物化学核酸化学核酸化学研究史（核酸化学研究史（4 4）19581958年年 Kornberg Kornberg得到高纯度的得到高纯度的 DNA DNA polymerase,polymerase,这种酶需要一个模板这种酶需要一个模板DNADNA。19601960年年 Cairns Cairns索性将复制中的细菌索性将复制中的细菌 DNADNA的电镜照片拍了下来。的电镜照片拍了下来。19701970年年 发现第一个发现第一个DNADNA限制性内切酶。限制性内切酶。19721972年年 DNA DNA重组技术的建立。重组技术的建立。19781978年年 双脱氧双脱氧DNADNA测序法的建立测序法的建立。19901990年年 人类基因组计划实施。人类基因组计划实施。核酸研究史47/10/20246生物化学核酸化学第二节 概述l核酸核酸(nucleic acid)是由碱基（嘌呤和嘧啶）、戊糖和磷酸组成的高分子物质，是生物体的基本组成成分。二、种类及分布二、种类及分布 DNA（脱氧核糖核酸）RNA（核糖核酸）一、概念7/10/20247生物化学核酸化学分布：lDNA：主要在细胞核中，是染色体的主 要成分。此外在线粒体、叶绿体、质粒及细胞膜上.lRNA：细胞核核仁；细胞质核糖体及上清液中。7/10/20248生物化学核酸化学三、核酸的组成三、核酸的组成 核酸是一种线形多聚核苷酸(polynucleotide),其基本结构单位是核苷酸(nucleotide)。戊糖 碱基磷酸 核苷核苷酸核酸 7/10/20249生物化学核酸化学核苷酸的基本结构7/10/202410生物化学核酸化学腺苷酸腺苷酸7/10/202411生物化学核酸化学（一）核酸中的戊糖（一）核酸中的戊糖lD-核糖核糖（D-ribose）lD-脱氧核糖脱氧核糖 （D-deoxyribose）l核酸据此分类：核酸据此分类：脱氧核糖脱氧核糖DNA；核糖核糖RNA；l核酸中的戊糖均为核酸中的戊糖均为 -D-型型一、核苷酸一、核苷酸一、核苷酸一、核苷酸7/10/202412生物化学核酸化学（二）碱基尿嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶胞嘧啶胞嘧啶l核酸中的碱基分两类：核酸中的碱基分两类：1、嘧啶碱、嘧啶碱(pyrimidine)：是嘧啶的衍生物。是嘧啶的衍生物。7/10/202413生物化学核酸化学一、核苷酸一、核苷酸一、核苷酸一、核苷酸2、嘌呤碱(purine)：由嘌呤衍生而来。7/10/202414生物化学核酸化学腺嘌呤腺嘌呤鸟嘌呤鸟嘌呤尿嘧啶尿嘧啶胞嘧啶胞嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶7/10/202415生物化学核酸化学在生理pH下，在生物体内，碱基多以亚氨基、酮式存在。7/10/202416生物化学核酸化学3、稀有碱基：一些修饰碱基，因含量甚少而称之。大多为甲基化碱基，多在tRNA中。一、核苷酸一、核苷酸一、核苷酸一、核苷酸7/10/202417生物化学核酸化学（三）核苷：(nucleoside)核苷：核苷：戊糖与碱基缩合而成，并以糖苷键相连接。糖苷键糖苷键：二者的连接是C-N键，称N-糖苷键。一、核苷酸一、核苷酸一、核苷酸一、核苷酸7/10/202418生物化学核酸化学核苷的表示：核苷：A、G、C、U脱氧核苷：dA,dG,dC,dT修饰核苷：如5-甲基 胞嘧啶：m5dC。7/10/202419生物化学核酸化学（四）核苷酸(nucleotide，nt)1、种类：、种类：1）按酯化位点：）按酯化位点：可可在核糖的在核糖的2-,3-,5-；2）按核糖类型：）按核糖类型：核苷酸、核苷酸、脱氧核苷酸脱氧核苷酸一、核苷酸一、核苷酸一、核苷酸一、核苷酸核苷中戊糖的羟基被磷酸酯化，即为核苷酸。7/10/202420生物化学核酸化学2、结构：7/10/202421生物化学核酸化学3、表示：l与一个磷酸结合MP：(d)AMP、(d)GMP、(d)CMP、(d)TMP、UMPl与二个磷酸结合DP：如：ADPl与三个磷酸结合TP：如：ATP 一、核苷酸一、核苷酸一、核苷酸一、核苷酸7/10/202422生物化学核酸化学4、特殊核苷酸：1）环核苷酸：核糖3-,5-成环。cAMP、cGMP 功能：第二信使，激素、一些药物、神经递质通过其发挥生理作用。一、核苷酸一、核苷酸一、核苷酸一、核苷酸7/10/202423生物化学核酸化学2）核苷多磷酸和寡核苷多磷酸：如：pppAppp（枯草杆菌）A 5 ppppA 5（哺乳动物）对代谢起调控作用。7/10/202424生物化学核酸化学一、核苷酸的连接方式一、核苷酸的连接方式1、3-,5磷酸二酯键磷酸二酯键将核将核苷酸连接成核酸大分子。苷酸连接成核酸大分子。一、核苷酸一、核苷酸一、核苷酸一、核苷酸第三节第三节 核酸的结构核酸的结构7/10/202425生物化学核酸化学3-,5磷酸二酯键磷酸二酯键7/10/202426生物化学核酸化学二、核酸的一级结构：二、核酸的一级结构：多核苷酸链多核苷酸链中各核苷酸中各核苷酸残基的排列残基的排列顺序称顺序称。7/10/202427生物化学核酸化学1）一级结构表示方法如下：）一级结构表示方法如下：A、磷酸（、磷酸（P）的位置）的位置 在左在左：表示与：表示与5-OH结合；结合；在右在右：与：与3-OH结合结合 如：如：pApCpTpGB、箭头表示核酸酶的水解部位：、箭头表示核酸酶的水解部位：pApCpTpG，即，即C的的3-OH游离。游离。C、一般将碱基缩写用连字符连起表示，、一般将碱基缩写用连字符连起表示，如：如：A-C-G-U一、核苷酸一、核苷酸一、核苷酸一、核苷酸7/10/202428生物化学核酸化学2）读向：碱基序列碱基序列从左到右表示从左到右表示5 3，由，由3-,5磷酸二酯键连接。磷酸二酯键连接。若两链反向平行，则需注明每条若两链反向平行，则需注明每条链的走向。如：链的走向。如：5A-T-G-C-C-T-G-A 3 3 T-A-C-G-G-A-C-T 5一、核苷酸一、核苷酸一、核苷酸一、核苷酸7/10/202429生物化学核酸化学 由数量庞大的4种脱氧核苷酸通过3-,5磷酸二酯键连接成的直线形或环形多聚体。7/10/202430生物化学核酸化学三、DNA的双螺旋二级结构1、双螺旋结构模型建立的依据：1）根据DNA碱基组成的定量分析提出chargaff碱基配对原则：A=T，G=C2）根据对DNA纤维和晶体的x-衍射分析。3）电位滴定证明。二、二、二、二、DNADNADNADNA7/10/202431生物化学核酸化学Watson-Crick的的DNA双螺旋双螺旋2.0 nm2.0 nm结结结结构构构构特特特特征征征征7/10/202432生物化学核酸化学7/10/202433生物化学核酸化学DNADNA中的四种碱基及它们间的氢键中的四种碱基及它们间的氢键胞嘧啶胞嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶鸟嘌啉鸟嘌啉腺嘌啉腺嘌啉TCAG7/10/202434生物化学核酸化学双螺旋中的碱基对（base pair,bp)base pair,bp)7/10/202435生物化学核酸化学2,双螺旋结构的特点:(WatsonWatson-CrickCrick模型）1）形成：两条链反向平行；右手螺旋。二、二、二、二、DNADNADNADNA7/10/202436生物化学核酸化学2）结构：A、核糖-磷酸以3-,5磷酸二酯键连接成骨架；碱基在内；B、大沟、小沟。二、二、二、二、DNADNADNADNA7/10/202437生物化学核酸化学3）尺寸：二、二、二、二、DNADNADNADNAA、直径：2nm；B、碱基距离：0.34nm；C、螺距：3.4nm；D、一周10个核苷酸。7/10/202438生物化学核酸化学4）双螺旋的稳定性：A、依靠碱基堆积力B、氢键C、离子键D、范德华力7/10/202439生物化学核酸化学3、二级结构的构象类型：二、二、二、二、DNADNADNADNAB-DNAA-DNAZ-DNA7/10/202440生物化学核酸化学DNA二级结构多态性 A-DNA B-DNA Z-DNA类 型 螺旋方向 螺旋直径 螺 距(nm)每转碱基 碱基对间 碱基对与 (nm)对数目 直距离(n）水平面倾角 右 右 左 7/10/202441生物化学核酸化学B-DNA与A-DNA7/10/202442生物化学核酸化学几种DNA钠盐的特点：B-DNA：生理状态下多为此种；92%相对湿度A-DNA：右手螺旋；75%相对湿度；生理状态 下多见dsRNA、DNA-RNAZ-DNA：人工合成、左手螺旋；嘧啶、嘌呤交 替；有m5dC；与基因表达调控有关；此外，还发现有C、D、E等型。7/10/202443生物化学核酸化学H-DNA:三条链局部螺旋三条链局部螺旋7/10/202444生物化学核酸化学四、DNA的三级结构DNA双螺旋进一步扭曲即成双螺旋进一步扭曲即成三级结构。三级结构。天然天然DNA有有双链双链DNA（dsDNA），），有的病毒为有的病毒为单链单链DNA（ssDNA）在在dsDNA中：中：线形分子线形分子（大多数）（大多数）环状分子环状分子（dcDNA）：质粒、）：质粒、线粒体、叶绿体、病毒、线粒体、叶绿体、病毒、细菌细菌二、二、二、二、DNADNADNADNA7/10/202445生物化学核酸化学1、超螺旋结构特点特点：l可将长链压缩可将长链压缩在一较小体内；在一较小体内；l密度大；密度大；l凝胶电泳中移凝胶电泳中移动速度快。动速度快。二、二、二、二、DNADNADNADNA7/10/202446生物化学核酸化学7/10/202447生物化学核酸化学正螺旋和负螺旋正螺旋和负螺旋DNADNA双螺旋为右旋螺双螺旋为右旋螺旋。细胞中的环状旋。细胞中的环状DNADNA一般呈负超螺旋，一般呈负超螺旋，即右旋螺旋不足导致即右旋螺旋不足导致部分碱基不形成配对，部分碱基不形成配对，分子通过整体拓扑学分子通过整体拓扑学上的右旋来补足右旋上的右旋来补足右旋螺旋的不足，在数学螺旋的不足，在数学上呈上呈1 1：1 1，即分子整，即分子整体右旋一圈来补双螺体右旋一圈来补双螺旋上的一圈不足。旋上的一圈不足。正超螺旋为双螺旋旋正超螺旋为双螺旋旋转过度，通过分子整转过度，通过分子整体的左旋来解去过度体的左旋来解去过度的螺旋。的螺旋。正超螺旋正超螺旋正超螺旋正超螺旋 左旋左旋左旋左旋负超螺旋负超螺旋负超螺旋负超螺旋 右旋右旋右旋右旋7/10/202448生物化学核酸化学2、核小体中的 扭曲方式l在真核细胞染色质中，DNA双螺旋分子盘绕在组蛋白上形成核小体。l许多核小体由DNA连成念珠状结构，再盘绕压缩成高层次的结构 染色体。二、二、二、二、DNADNADNADNA7/10/202449生物化学核酸化学五、DNA的功能1、DNA一级结构的特点 基因：是含特定遗传信息的核苷酸序列 （DNA或RNA）是遗传物质的最小 功能单位。若干bp 多个基因 pr+DNA 染色体二、二、二、二、DNADNADNADNA7/10/202450生物化学核酸化学1）原核生物基因组：l 基因在同一染色体上基因在同一染色体上。A、除调节序列和信号序列外，多为、除调节序列和信号序列外，多为结构基因；结构基因；B、功能相关的基因常连在一起，并、功能相关的基因常连在一起，并转录在转录在 同一同一mRNA中。中。二、二、二、二、DNADNADNADNA7/10/202451生物化学核酸化学C、基因有、基因有重叠；重叠；同一核苷酸顺序中包含多种生物信息。同一核苷酸顺序中包含多种生物信息。7/10/202452生物化学核酸化学2）真核生物基因组：一般基因分布在若干染色体上一般基因分布在若干染色体上。A、有、有重复序列重复序列；B、有断裂基因：即有内含子。、有断裂基因：即有内含子。内含子内含子（intron)：DNA分子中不编码的序列。分子中不编码的序列。外显子外显子(exons)：DNA分子中可表达的序列。分子中可表达的序列。二、二、二、二、DNADNADNADNA7/10/202453生物化学核酸化学启动子启动子外显子外显子内含子内含子转录终止子转录终止子真核生物的基因结构7/10/202454生物化学核酸化学内含子与外显子7/10/202455生物化学核酸化学2、DNA是遗传信息的载体 半保留复制 保证了亲代性状传到子代，保证了亲代与子代 的相似性。二、二、二、二、DNADNADNADNA7/10/202456生物化学核酸化学3、DNA是变异的物质基础变异是生物进化的基础。变异的发生：1）DNA复制时出错；2）理化因素等引起碱基变化或缺失，使DNA碱基序列改变，从而发生性状变异。二、二、二、二、DNADNADNADNA7/10/202457生物化学核酸化学六、RNA（一）一）RNA的结构的结构组成组成：4种核苷酸，有稀有碱基；种核苷酸，有稀有碱基；连接连接：同：同DNA形成形成：一般以：一般以DNA为模板合成，有例外。为模板合成，有例外。结构结构：单链线形分子，局部区域有双螺旋。：单链线形分子，局部区域有双螺旋。7/10/202458生物化学核酸化学（二）RNA的类型三种：信使信使RNA（messenger RNA,mRNA)核糖体核糖体RNA(ribosomel RNA,rRNA)转运转运RNA(transfer RNA,tRNA)三、三、RNARNA7/10/202459生物化学核酸化学此外，在真核细胞中还有少量：核内小核内小RNA（snRNA）:参与核糖体的组成。参与核糖体的组成。不均一不均一RNA（hnRNA）：）：mRNA的前体。的前体。反义反义RNA（asRNA）：）：可与可与mRNA部分或全部序列互补；抑部分或全部序列互补；抑 制制DNA复制、转录；抑制复制、转录；抑制mRNA翻译。翻译。7/10/202460生物化学核酸化学1、tRNA 约占全部RNA的15%；由70-90个核苷酸组成许多种类；沉降系数4S。三、三、RNARNA7/10/202461生物化学核酸化学1）tRNA结构：一级结构一级结构多已清楚，多已清楚，含较多稀有碱基；含较多稀有碱基；二级结构二级结构为三叶草为三叶草 有：有：aa臂、臂、二氢嘧啶环、二氢嘧啶环、反密码环、反密码环、可变环、可变环、T C 环环三、三、RNARNA7/10/202462生物化学核酸化学tRNA三级结构为倒L型7/10/202463生物化学核酸化学A、在pr合成中转运aa；B、在pr合成的起始、DNA反转录合成及其它代谢调节中起作用。2）tRNA功能：功能：7/10/202464生物化学核酸化学2、mRNA和hnRNA1）合成：）合成：以以DNA为模板为模板(核内核内)合成合成 hnRNA（含内含子和外显子）（含内含子和外显子）加工加工 成熟的成熟的mRNA 入细胞质入细胞质 蛋白质合成蛋白质合成三、三、RNARNA7/10/202465生物化学核酸化学RNA转录自转录自DNA7/10/202466生物化学核酸化学合成mRNA7/10/202467生物化学核酸化学切除内含子7/10/202468生物化学核酸化学2)mRNA结构特点：结构特点：3末端有末端有polyA结构结构：与：与mRNA从核入质有从核入质有关，与关，与mRNA 半寿期有关。半寿期有关。5末端有帽子结构末端有帽子结构：G被甲基化，此可能与被甲基化，此可能与pro合成的起始有关。合成的起始有关。7/10/202469生物化学核酸化学3)功能：功能：是蛋白质合成的模板是蛋白质合成的模板mRNAtRNA核糖体核糖体7/10/202470生物化学核酸化学3、rRNA1)占占RNA总量的总量的80%，是是构成核糖体的骨架。构成核糖体的骨架。2)核糖体功能：核糖体功能：pr合成的部位合成的部位.3）结构：）结构：分大、小亚基分大、小亚基 一、二级结构多已确定，一、二级结构多已确定，但功能不清。但功能不清。三、三、RNARNA7/10/202471生物化学核酸化学l原核细胞：原核细胞：70S核糖体；核糖体；l真核细胞：真核细胞：80S核糖体；核糖体；7/10/202472生物化学核酸化学4、RNA的功能1）在）在DNA复制、转录、翻译中起重要调控复制、转录、翻译中起重要调控作用；作用；a.遗传密码的中间担体(mRNA)b.mRNA剪接等加工的活性成份(snRNA)c.核糖体的骨架结构及与mRNA的识别 (rRNA)d.活化氨基酸的担体(tRNA)2）有催化作用；）有催化作用；3）可作为遗传物质（如逆转录病毒）。）可作为遗传物质（如逆转录病毒）。三、三、RNARNA7/10/202473生物化学核酸化学7/10/202474生物化学核酸化学第四节、核酸的性质第四节、核酸的性质一、一般理化性质一、一般理化性质1、两性电解质：、两性电解质：2、溶解性、溶解性：微溶于水，不溶于一般有机试：微溶于水，不溶于一般有机试 剂（乙醇沉淀核酸），钠盐易溶于水。剂（乙醇沉淀核酸），钠盐易溶于水。3、粘度高、粘度高：一般：一般DNA比比RNA粘度高。粘度高。4、水解性、水解性：可被酸、碱或酶水解，：可被酸、碱或酶水解，DNA比比 RNA对稀碱稳定。对稀碱稳定。7/10/202475生物化学核酸化学5、颜色反应：1）核糖核糖与浓盐酸和苔酚蓝共热呈绿色，在与浓盐酸和苔酚蓝共热呈绿色，在 670nm处可测处可测RNA；2）2-脱氧核糖脱氧核糖与酸和二苯胺共热呈蓝紫色，与酸和二苯胺共热呈蓝紫色，在595nm处可测DNA。二种反应可作定性试验，定量试验灵敏度低、准确性差，但快、简便。四、核酸的性质四、核酸的性质四、核酸的性质四、核酸的性质7/10/202476生物化学核酸化学二、紫外吸收性质 碱基具共轭双键强烈吸收260-290nm波段紫外光，最大吸收峰在260nm附近。l应用：1、不同核苷酸有不同吸收特性，可用紫外分光光度计进行定性、定量测定。1 OD相当于：50g/ml DNA 40g/ml RNA 20g/ml Nt(核苷酸）四、核酸的性质四、核酸的性质四、核酸的性质四、核酸的性质7/10/202477生物化学核酸化学2、确定所提取的核酸是否纯品。1）DNA：1.8 纯品 OD260/OD290 1.8 RNA 污染 1.8 pro 污染 2）RNA：OD260/OD290 2.0 纯品四、核酸的性质四、核酸的性质四、核酸的性质四、核酸的性质7/10/202478生物化学核酸化学3、紫外可使相邻T T间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体，引起基因突变。A=TC=GT=AT=A紫外A=TC=GT AT A7/10/202479生物化学核酸化学三、核酸结构的稳定性1、碱基堆积力碱基堆积力：双螺旋内部碱基形成的疏：双螺旋内部碱基形成的疏 水区；水区；2、碱基间的氢键碱基间的氢键：3、磷酸基与介质中阳离子形成的离子键、磷酸基与介质中阳离子形成的离子键4、范德华力。、范德华力。四、核酸的性质四、核酸的性质四、核酸的性质四、核酸的性质7/10/202480生物化学核酸化学四、核酸的变性1、变性的概念变性的概念1）现象现象：双螺旋：双螺旋DNA和具双螺旋区的和具双螺旋区的RNA氢键氢键 断裂，空间结构被破坏，形成单链无规断裂，空间结构被破坏，形成单链无规 则线团状的过程。则线团状的过程。四、核酸的性质四、核酸的性质四、核酸的性质四、核酸的性质7/10/202481生物化学核酸化学2）结果结果：A、增色效应：增色效应：260nm紫外吸收增加；紫外吸收增加；B、粘度下降、浮力密度上升；、粘度下降、浮力密度上升；C、生物学性能部分或全部丧失生物学性能部分或全部丧失。3）引起变性的因素引起变性的因素：温度、温度、pH、尿素、甲醛等。、尿素、甲醛等。7/10/202482生物化学核酸化学2、热变性与TmTm：在热变性中，紫在热变性中，紫外吸收增加的中点外吸收增加的中点值所对应的温度，值所对应的温度，称该称该DNA的熔解温的熔解温度（度（melting temperature,Tm);又又称称热解链温度热解链温度。四、核酸的性质四、核酸的性质四、核酸的性质四、核酸的性质7/10/202483生物化学核酸化学3、影响Tm的因素：1）DNA的均一性；的均一性；2）G-C含量：含量：Tm与与G-C含量成正比。含量成正比。3）介质中的离子强）介质中的离子强度：度：离子强度低，离子强度低，Tm低，熔解温度范低，熔解温度范围窄。围窄。7/10/202484生物化学核酸化学DNADNA分子的分子的TmTm与与GCGC含量的关系含量的关系7/10/202485生物化学核酸化学盐浓度对盐浓度对DNADNA变性的影响变性的影响7/10/202486生物化学核酸化学五、核酸的复性概念概念：变性：变性DNA在适当条件下（在适当条件下（缓慢降温缓慢降温），可），可 使两条彼此分开的链使两条彼此分开的链重新缔合重新缔合成双螺旋结成双螺旋结 构的过程。构的过程。复性后，许多物化性质可得到恢复，复性后，许多物化性质可得到恢复，生物学活性部分恢复。生物学活性部分恢复。影响因素影响因素：温度、：温度、DNA片段大小、片段大小、DNA浓浓 度、碱基重复序列多少、离子浓度。度、碱基重复序列多少、离子浓度。四、核酸的性质四、核酸的性质四、核酸的性质四、核酸的性质7/10/202487生物化学核酸化学DNA变性与复性变性与复性7/10/202488生物化学核酸化学第五节、分子生物学技术一、分子杂交与探针技术1、概念：1）分子杂交（hybrization):利用核酸变性、复性性质，根据碱基配对 原则，将二条不同来源的nt链形成杂合双链的过程。DNA-DNA：DNA-RNA:7/10/202489生物化学核酸化学2)探针（probe)l一小段（十几至数百）多聚核苷酸单链用 32P、35S或生物素标记其末端或全链。l制备：用确诊病人细胞中提取的DNA；用病毒DNA；用肿瘤组织提取的DNA。7/10/202490生物化学核酸化学上：探针标记右：放射自显影7/10/202491生物化学核酸化学7/10/202492生物化学核酸化学二、限制性内切酶：1、核酸的工具酶有：水解酶类；聚合酶类；连接酶；碱性磷酸酯酶；反转录酶；7/10/202493生物化学核酸化学2、水解酶：水解磷酸二酯键1）按专一性分：DNA水解酶、RNA水解酶2）按作用方式分：外切酶：从核酸链3或5一个个水解。内切酶：作用于核酸链内部。7/10/202494生物化学核酸化学3、限制性内切酶l在核苷酸链内特定序列切开DNA双链的酶。因切法不同，产生三种产物：交错切产生粘性末端：平切产生平头末端：7/10/202495生物化学核酸化学粘性末端粘性末端7/10/202496生物化学核酸化学应用于克隆、测序、检测DNA等7/10/202497生物化学核酸化学DNA凝胶电泳凝胶电泳7/10/202498生物化学核酸化学三、Southern印迹法分子生物学技术分子生物学技术分子生物学技术分子生物学技术用于检测DNA方法：如图7/10/202499生物化学核酸化学Northern blot：用于检测RNAWestern blot：用于检测蛋白质7/10/2024100生物化学核酸化学四、聚合酶链 式反应（polymeerase chain polymeerase chain reaction,PCR)reaction,PCR)7/10/2024101生物化学核酸化学原理：l碱基配对；l聚合酶可催化在试管内合成与模板互补的 DNA新链；l双脱氧核苷酸无3-OH，合成到此终止；l可电泳分离随机得到的大小不等的片段。五、核酸序列测定五、核酸序列测定7/10/2024102生物化学核酸化学核核酸酸序序列列测测定定7/10/2024103生物化学核酸化学