分子育种学ppt课件分子标记与植物育种

分子育种学分子育种学分子标记与植物育种分子标记与植物育种遗传标记？遗传标记？类型与特点？类型与特点？建立？建立？应用？应用？分子育种学分子标记与植物育种遗传标记？类型与特点？本章主要内容本章主要内容（一）、遗传标记概述（一）、遗传标记概述（二）、分子标记的类型及其基本原理（二）、分子标记的类型及其基本原理（三）、分子标记辅助选择（三）、分子标记辅助选择（四）、分子标记在植物遗传育种中的应用（四）、分子标记在植物遗传育种中的应用（五）、存在问题（五）、存在问题本章主要内容（一）、遗传标记概述1 1、概念、概念遗传标记遗传标记是指受基因控制的能够稳定遗传的，且是指受基因控制的能够稳定遗传的，且能代表个体或群体的遗传特性，并可被用作遗能代表个体或群体的遗传特性，并可被用作遗传分析的某种特征。传分析的某种特征。理想的遗传标记应具备的条件：理想的遗传标记应具备的条件：多态性高、遗传稳定、遗传行为简单、能检测整个基因组、不受环境影响、操作经济、简单等（一）、遗传标记概述（一）、遗传标记概述 1、概念（一）、遗传标记概述2 2、遗传标记的类型、遗传标记的类型根据建立标记的对象可分为：根据建立标记的对象可分为：n形态学标记形态学标记 MorphologicalMarkern细胞学标记细胞学标记 CytologicalMarkern生化标记生化标记 BiochemicalMarkernDNADNA分子标记分子标记 DNAMolecularMarker2、遗传标记的类型根据建立标记的对象可分为：*形态标记：形态标记：是生物特定的肉眼可见或简是生物特定的肉眼可见或简单工具可测量的外部形态特征。影响这单工具可测量的外部形态特征。影响这一特征的基因及其所在的染色体以及其一特征的基因及其所在的染色体以及其相邻基因在图谱上的位置都已明确相邻基因在图谱上的位置都已明确。n孟德尔首先将形态标记作为遗传标记孟德尔首先将形态标记作为遗传标记-分分离规律和独立分配规律；长期以来植物离规律和独立分配规律；长期以来植物种质资源鉴定及育种材料选择一般都是种质资源鉴定及育种材料选择一般都是根据形态标记进行的。根据形态标记进行的。（1 1）形态标记形态标记*形态标记：是生物特定的肉眼可见或简单工具可测量的外部形态分子育种学ppt课件分子标记与植物育种标记性状标记性状标记基因（括号内数字表示所在连锁群）标记基因（括号内数字表示所在连锁群）色素色素花色花色W1，w1（8）茸毛色茸毛色T，t（1）荚色荚色L1，l1（5）；）；L2，l2种皮种皮G，g（3）种脐种脐R，r-m（2）；）；I，i-i，I-k，i（7）双色双色K1；K2；K3子叶色子叶色D1（3）；）；D2；Cyt-G，Y3叶叶小叶数目小叶数目L-f1，l-f2叶形叶形ln（4）；）；Lo，lo；l-w1，l-w2；l-b1,l-b2；落叶性落叶性A叶绿素缺失叶绿素缺失V1；y3；y4；y20茸毛类型茸毛类型Pa1，pa1；Pa2，pa2；P1，p1（2）；P2，p2（4）；Pb，pb（14）；）；Pc，pc；Pd1，pd2；Ps，ps茎茎扁化茎扁化茎f(11)节间长度节间长度S，s短叶柄短叶柄Lps，lps矮杆矮杆df2（6）；）；df3；df4；df5（1）大豆部分形态标记性状及标记基因大豆部分形态标记性状及标记基因标记性状标记基因（括号内数字表示所在连锁群）色素花色W1，形态标记技术的评价形态标记技术的评价优点：优点：简单简单直观直观缺点：缺点：数量少、多态性差数量少、多态性差易受环境条件因素影响易受环境条件因素影响显隐关系要通过自交或杂交来检出显隐关系要通过自交或杂交来检出形态标记技术的评价细胞学标记：细胞学标记：以染色体以染色体结构和数目为基础的标结构和数目为基础的标记。能够与特定的表型记。能够与特定的表型结合起来，从而确定控结合起来，从而确定控制某些性状的基因所在制某些性状的基因所在的染色体或染色体区段的染色体或染色体区段连锁遗传和染色体学说连锁遗传和染色体学说（2 2）细胞学标记细胞学标记细胞学标记：以染色体结构和数目为基础的标记。能够与特定的表型染色体染色体三体名称三体名称特征特征1三体三体1（草状）（草状）生生长长缓缓慢慢，高高度度不不育育，籽籽粒粒较较细细长长且且稍稍呈呈三三角角形形，叶叶窄，与草相似窄，与草相似2三体三体2（矮生）（矮生）小小穗穗短短，护护颖颖较较长长，自自交交高高度度不不育育，叶叶片片短短且且基基部部附附近常扭曲近常扭曲3三体三体4（不育）（不育）植植株株最最矮矮，叶叶片片短短厚厚呈呈革革质质，中中脉脉凸凸出出，穗穗伸伸出出不不完完全，自交完全不育全，自交完全不育4三体三体12（高秆）（高秆）植株最高，叶片下垂，叶舌长，育性正常植株最高，叶片下垂，叶舌长，育性正常5三体三体5（叶片扭曲）（叶片扭曲）叶叶片片短短且且扭扭曲曲，有有密密生生茸茸毛毛，穗穗短短，小小穗穗着着生生紧紧密密，结实率高结实率高6三体三体3（有芒）（有芒）籽粒有芒，叶片厚而半卷，叶舌长，自交高度不育籽粒有芒，叶片厚而半卷，叶舌长，自交高度不育7三体三体7（窄叶）（窄叶）叶片窄而半卷，穗稍疏松，不完全伸出，部分可育叶片窄而半卷，穗稍疏松，不完全伸出，部分可育8三体三体8（卷叶）（卷叶）叶片窄卷，叶舌短，籽粒短而粗，部分可育叶片窄卷，叶舌短，籽粒短而粗，部分可育9三体三体9（粗壮）（粗壮）叶片厚而浓绿，茎秆短，小穗最大，百粒重最高叶片厚而浓绿，茎秆短，小穗最大，百粒重最高10三体三体10（短粒）（短粒）叶舌有毛，叶片直立，育性正常叶舌有毛，叶片直立，育性正常11三体三体11（拟正常）（拟正常）与二倍体姊妹系无法区别，育性正常，需细胞学鉴定与二倍体姊妹系无法区别，育性正常，需细胞学鉴定12三体三体6（丛生）（丛生）外型呈丛生草状，穗部顶端小穗退化，育性高外型呈丛生草状，穗部顶端小穗退化，育性高水稻水稻水稻水稻IR36IR36初级三体的形态特征初级三体的形态特征初级三体的形态特征初级三体的形态特征(Khushetal.1984)(Khushetal.1984)染色体三体名称特征1三体1（草状）生长缓慢，高度不育，籽粒较细胞学标记的细胞学标记的核心技术是显微镜技术核心技术是显微镜技术核型分析核型分析把体细胞内染色体显微摄影后再把体细胞内染色体显微摄影后再放大照片，按照染色体相对长度、臂指数、放大照片，按照染色体相对长度、臂指数、着丝粒指数、染色体臂数等将染色体作系统着丝粒指数、染色体臂数等将染色体作系统排列，显示染色体的特征排列，显示染色体的特征染色体分带技术染色体分带技术将所有染色体制片用不同将所有染色体制片用不同手段处理，再用不同染料染色，染色体显示手段处理，再用不同染料染色，染色体显示出不同的带数，如出不同的带数，如G带、带、C带、带、N带等，明确带等，明确鉴定许多物种中任一染色体鉴定许多物种中任一染色体细胞学标记的核心技术是显微镜技术分子育种学ppt课件分子标记与植物育种普普通通小小麦麦的的普普通通小小麦麦的的N N带带 与与带带 与与C C带带带带普通小麦的N带与C带玉米染色体荧光核型玉米染色体荧光核型（9个探针）个探针）小麦小麦-中间偃麦草附加系中间偃麦草附加系黄黄黄黄-A-A染色体染色体染色体染色体；棕棕棕棕-B-B染色体染色体染色体染色体红红红红-D-D染色体；染色体；染色体；染色体；绿绿绿绿-偃染色体偃染色体偃染色体偃染色体玉米染色体荧光核型小麦-中间偃麦草附加系评价：评价：克服了形态标记易受环境影响的缺点，但这种克服了形态标记易受环境影响的缺点，但这种标记材料的产生需要花费大量的人力物力进行培标记材料的产生需要花费大量的人力物力进行培养选择，从而限制了细胞学标记的应用。养选择，从而限制了细胞学标记的应用。有些物种对染色体结构和数目的变异的耐受性有些物种对染色体结构和数目的变异的耐受性较差，难以获得相应的标记材料较差，难以获得相应的标记材料某些物种虽然已有细胞学标记材料，但这些标某些物种虽然已有细胞学标记材料，但这些标记常常伴有对生物有害的表型效应，或有时观察记常常伴有对生物有害的表型效应，或有时观察和鉴定比较困难和鉴定比较困难评价：生化标记：生化标记：生化标记：生化标记：建立在生化遗传学基础上的特异性同建立在生化遗传学基础上的特异性同功酶或蛋白质。其编码基因的位置及其与其它基功酶或蛋白质。其编码基因的位置及其与其它基因位点的连锁关系也是明确的。因位点的连锁关系也是明确的。蛋白质是由基因编码的，特定的基因型决定了蛋蛋白质是由基因编码的，特定的基因型决定了蛋白质的特定组成，因此蛋白质组成能够反映出其白质的特定组成，因此蛋白质组成能够反映出其特征或特性特征或特性主要利用种子蛋白：数量丰富、稳定、易于提取主要利用种子蛋白：数量丰富、稳定、易于提取（3 3）生化标记生化标记生化标记：建立在生化遗传学基础上的特异性同功酶或蛋白质。其编19411941年年Beadle W GBeadle W G等提出了等提出了“一个基因一个酶一个基因一个酶”的的假说，创立了生化遗传学。假说，创立了生化遗传学。5050年代许多科学家发现年代许多科学家发现同一种酶可具有多种不同的形式。同时由于淀粉凝同一种酶可具有多种不同的形式。同时由于淀粉凝胶电泳技术的发展和化学染色剂的使用，使这种酶胶电泳技术的发展和化学染色剂的使用，使这种酶的多种形式成为肉眼可辩的带型的多种形式成为肉眼可辩的带型酶谱。酶谱。19591959年，年，MarkertMarkert等提出了用同工酶（等提出了用同工酶（isozymeisozyme）一）一词来描述具有同一底物专一性的不同分子形式的酶，词来描述具有同一底物专一性的不同分子形式的酶，并证实同工酶具有组织、发育及物种的特异性。并证实同工酶具有组织、发育及物种的特异性。2020世纪世纪60-7060-70年代出现了年代出现了在蛋白质水平反映生物遗传在蛋白质水平反映生物遗传变异的同工酶标记。变异的同工酶标记。生化标记的发展生化标记的发展1941年BeadleWG等提出了“一个基因一个酶”的假同工酶同工酶基因基因染色体染色体酸性磷酸酶酸性磷酸酶Acp-112Acp-212Acp-37乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶Adh-111氨基肽酶氨基肽酶Amp-12Amp-28Amp-36Amp-48-淀粉酶淀粉酶-Amy-17过氧化氢酶过氧化氢酶Cat-16内肽酶内肽酶Enp-16酯酶酯酶Est-26Est-39Est-51Est-77水稻的部分同工酶标记水稻的部分同工酶标记同工酶基因染色体酸性磷酸酶Acp-112Acp-212A以基因表达的结果为基础，是对基因的间接反映以基因表达的结果为基础，是对基因的间接反映共显性，数量上更丰富，受环境影响更小，能更共显性，数量上更丰富，受环境影响更小，能更好地反映遗传多态性，因此生化标记是一种较好好地反映遗传多态性，因此生化标记是一种较好的遗传标记，已被广泛应用于物种起源和进化研的遗传标记，已被广泛应用于物种起源和进化研究、种质鉴定、分类和抗病性筛选等领域。究、种质鉴定、分类和抗病性筛选等领域。但仍然存在诸多不足，如每一种同工酶标记都需但仍然存在诸多不足，如每一种同工酶标记都需特殊的显色方法和技术；某些酶的活性具有发育特殊的显色方法和技术；某些酶的活性具有发育和组织特异性；局限于反映基因组编码区的表达和组织特异性；局限于反映基因组编码区的表达信息等。信息等。最关键的不足是其标记数量还比较有限最关键的不足是其标记数量还比较有限不能成为理想的遗传标记不能成为理想的遗传标记生化标记的评价生化标记的评价以基因表达的结果为基础，是对基因的间接反映生化标记的评价DNADNA分子标记：分子标记：分子标记：分子标记：根据遗传物质根据遗传物质DNA本身的变异而本身的变异而建立的标记。确定建立的标记。确定DNA多态性与特定性状或多态性与特定性状或DNA片段的关系。片段的关系。19801980年年BotsteinBotstein等首次提出了等首次提出了DNADNA限制片段长度多限制片段长度多态性态性(restriction fragment length polymorphism(restriction fragment length polymorphism，RFLP)RFLP)的概念，的概念，并指出并指出RFLPRFLP可作为遗传标记，从此开创了利用可作为遗传标记，从此开创了利用DNADNA多态性进行分子标记的新阶段。多态性进行分子标记的新阶段。19851985年年MullisMullis发明了发明了PCR(DNAPCR(DNA聚合酶链式反应聚合酶链式反应)技技术，推动产生了许多以术，推动产生了许多以PCRPCR为基础新型的分子标记为基础新型的分子标记随着随着DNADNA研究技术的不断发展，分子标记的类型越研究技术的不断发展，分子标记的类型越来越丰富，已广泛用于很多研究领域。来越丰富，已广泛用于很多研究领域。（4 4）DNA分子标记分子标记DNA分子标记：根据遗传物质DNA本身的变异而建立的标记。确DNADNA分子标记的特点分子标记的特点分子标记的特点分子标记的特点直接对直接对DNA进行标记，在植物体的各种组织、器进行标记，在植物体的各种组织、器官，不同发育时期均可检测到，不受环境、季节的官，不同发育时期均可检测到，不受环境、季节的限制，不存在表达与否的问题限制，不存在表达与否的问题类型丰富，数量多，遍及整个基因组类型丰富，数量多，遍及整个基因组多多态态性性高高，自自然然存存在在着着许许多多等等位位变变异异，不不需需要要创创造造特殊的材料特殊的材料许许多多类类型型的的分分子子标标记记表表现现位位共共显显性性，能能够够鉴鉴别别出出纯纯合基因型和杂合基因型，提供完整的遗传信息合基因型和杂合基因型，提供完整的遗传信息表表现现为为中中性性，即即不不影影响响目目标标性性状状的的表表达达，与与不不良良性性状无必然的连锁关系状无必然的连锁关系可对控制任何目标性状的基因进行标记可对控制任何目标性状的基因进行标记理想的遗传标记理想的遗传标记DNA分子标记的特点理想的遗传标记DNA分子标记的多态性分子标记的多态性DNA分子标记的多态性共显性标记共显性标记（Co-dominant marker）杂合体显示双亲的带型杂合体显示双亲的带型显性标记显性标记（Dominant marker）杂合体显示双亲之一的带型杂合体显示双亲之一的带型F MFFHHHHHFMMMMMF MF/HDNA分子标记的显性与共显性分子标记的显性与共显性共显性标记显性标记FMFFHHHHHFM（二）、分子标记类型及其基本原理（二）、分子标记类型及其基本原理1、分子标记的类型、分子标记的类型按核心技术分按核心技术分n以分子杂交为基础的的标记以分子杂交为基础的的标记n以以PCR为基础的标记为基础的标记n其它类型的分子标记（其它类型的分子标记（PCR和分子杂交结合、和分子杂交结合、测序）测序）按建立标记的按建立标记的DNA序列来源分序列来源分n以基因组以基因组DNA为基础的标记为基础的标记n以以EST为基础的标记为基础的标记（二）、分子标记类型及其基本原理1、分子标记的类型2、常用分子标记技术简介、常用分子标记技术简介 1）限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性（R Restriction estriction F Fragment ragment L Length ength P Polymorphismolymorphism，RFLPRFLP）原理：生物体在长期的自然选择和进化过程中，原理：生物体在长期的自然选择和进化过程中，由于个别碱基的突变以及序列的缺失、插入或由于个别碱基的突变以及序列的缺失、插入或重排，会造成重排，会造成DNA在核苷酸序列上出现差异，在核苷酸序列上出现差异，从而导致限制性内切酶识别位点的不同，当用从而导致限制性内切酶识别位点的不同，当用限制性内切酶来消化不同材料的限制性内切酶来消化不同材料的DNA时，会产时，会产生数目和大小不同的生数目和大小不同的DNA片段，电泳后经转膜片段，电泳后经转膜和与探针杂交，就可以得到和与探针杂交，就可以得到DNA限制性片段长限制性片段长度多态性。度多态性。1980年Botstein等首次提出2、常用分子标记技术简介1）限制性片段长度多态性（RestRFLP技术流程技术流程RFLP技术流程探针探针探针RFLPRFLPRFLPRFLP产生的原因产生的原因产生的原因产生的原因多态性基础多态性基础多态性基础多态性基础A A A A）点突变）点突变）点突变）点突变RFLP产生的原因多态性基础A）点突变RFLPRFLPRFLPRFLP产生的原因产生的原因产生的原因产生的原因多态性基础多态性基础多态性基础多态性基础B B B B）缺失）缺失）缺失）缺失RFLP产生的原因多态性基础B）缺失RFLPRFLPRFLPRFLP产生的原因产生的原因产生的原因产生的原因多态性基础多态性基础多态性基础多态性基础C C C C）插入）插入）插入）插入RFLP产生的原因多态性基础C）插入RFLPRFLPRFLPRFLP图例图例图例图例RFLP图例RFLPRFLP标记的优点标记的优点 具有共显性特点，可以区别基因型纯合与杂合，具有共显性特点，可以区别基因型纯合与杂合，能提供单个位点上较完整的资料；能提供单个位点上较完整的资料；标记无表型效应，不受环境和发育条件影响；标记无表型效应，不受环境和发育条件影响；在非等位在非等位RFLPRFLP标记之间不存在上位效应，因而互标记之间不存在上位效应，因而互不干扰；不干扰；标记源于基因组标记源于基因组DNADNA的自然变异，数量上几乎不的自然变异，数量上几乎不受限制受限制缺陷：缺陷：RFLPRFLP标记对标记对DNADNA需要量较大，操作繁琐，花需要量较大，操作繁琐，花费昂贵费昂贵其应用受到一定程度的限制；（早期）主要用于其应用受到一定程度的限制；（早期）主要用于遗传连锁图的绘制和目标基因的标记遗传连锁图的绘制和目标基因的标记RFLP标记的优点2）DNA指纹指纹（DNAFingerprinting，DF）实际上是实际上是RFLP的一种特殊类型。其的一种特殊类型。其基本原理与基本原理与RFLP是一致的，不同的是一致的，不同的是所用的探针，是所用的探针，RFLP所用的探针是所用的探针是单拷贝或低拷贝，而单拷贝或低拷贝，而DF所用的探针所用的探针是多拷贝或高拷贝的小卫星、微卫是多拷贝或高拷贝的小卫星、微卫星或人工合成的简单重复序列星或人工合成的简单重复序列。2）DNA指纹（DNAFingerprinting，DF3）随机扩增多态性随机扩增多态性DNADNA（Random andom A Amplified mplified P Polymorphism DNAolymorphism DNA，RAPD；RP-PCR；AP-PCR）1990年年Williams和和Welsh原理：原理：以以一个一个人工合成的随随机的寡核苷人工合成的随随机的寡核苷酸序列酸序列(通常为通常为10个碱基个碱基)作引物作引物，以基因以基因组总组总DNA DNA 为模板，利用为模板，利用PCRPCR技术随机扩增基技术随机扩增基因组因组DNADNA的不同位点，再经凝胶电泳分开，的不同位点，再经凝胶电泳分开，得到一系列多态性得到一系列多态性DNADNA片段。片段。3）随机扩增多态性DNA（RandomAmplifiedRAPD中多态性产生的基础中多态性产生的基础n n片段数量、大小和有无片段数量、大小和有无核苷酸置换造成引物与结合位点无法核苷酸置换造成引物与结合位点无法匹配匹配某个引物结合位点缺失某个引物结合位点缺失两引物结合位点间的间距过大，因片两引物结合位点间的间距过大，因片段太长致使扩增中断（段太长致使扩增中断（3kb)70bp）、小）、小卫星卫星（670bp）和微卫星和微卫星DNA(1-6bp)。微卫星微卫星(Microsatellite,MS)是指基因组中以少数几个核是指基因组中以少数几个核苷酸苷酸(多数为多数为24个个)为单位多次串联重复组成的长达为单位多次串联重复组成的长达几十个核苷酸的序列几十个核苷酸的序列，又称，又称简单序列重复简单序列重复(SimpleSequenceRepeats,SSR)或或短串联重复短串联重复(ShortTandemRepeats,STR)、或、或简单序列长度多态性简单序列长度多态性(SimpleSequenceLengthPolymorphism，SSLP)重复重复数目是可变的，重复序列数目是可变的，重复序列两侧都有物种特异性的保两侧都有物种特异性的保守序列守序列，所以通过设计引物进行所以通过设计引物进行PCR扩增扩增，就可以检就可以检测到不同的测到不同的DNA区域重复区域重复数目数目的多态性。的多态性。5）微卫星DNASSR的多态性基础的多态性基础SSR(数目变异数目变异)旁邻或侧翼序列旁邻或侧翼序列(具有保守性具有保守性引物设计引物设计)SSR的多态性基础SSR(数目变异)旁邻或侧翼序列(具有保SSR的类型的类型根据重复结构根据重复结构1）完全重复型）完全重复型(perfect),单一序列单元无中断单一序列单元无中断或无颠倒或无颠倒2）不完全重复型）不完全重复型(imperfect),单一序列单元有单一序列单元有中断或有颠倒；中断或有颠倒；3）混合型）混合型(compound)，不同序列混合、中断不同序列混合、中断根据来源的序列根据来源的序列1）gSSR：来源于基因组序列：来源于基因组序列2）EST-SSR：来源于：来源于EST（表达序列标签）（表达序列标签）SSR的类型aacgggtcattttgaggaggtgtgctgctggggagggggtagcggcagcgctagtgaaagagaagaagaagaaggaggaggaggaggaggaggaagaggaggaagggaggcagaaggagcagatgaaagaagagaatatgaatatggatgtggatgtggtcatggaagaaggggacgacgacaacaagaagaacgacgacgacgacgacgacgacgacgacgacgacgacgacggggatgtaacaagtccgccgccggcggctgaggatgagaccaaggatggtggaaaggctaa agg-不完全重复不完全重复cga-完全重复完全重复-aggagatgagtctctctctctctctcgaagaagaagaagaagaatc混合型混合型aacgggtcattttgaggaggtgtgctgctgSSR的分布的分布在基因组中的分布更为随机，在基因组中的分布更为随机，不仅可以存在于内含子中，也可不仅可以存在于内含子中，也可以存在于编码区及染色体上的其它任一区域。以存在于编码区及染色体上的其它任一区域。不同物种基因组中的分布频率有所差异：不同物种基因组中的分布频率有所差异：大麦、番茄、水稻、大麦、番茄、水稻、马铃薯及拟南芥基因组马铃薯及拟南芥基因组DNADNA序列中分别为序列中分别为1/7.41/7.4、1/7.11/7.1、1/7.41/7.4、1/6.41/6.4和和1/6.0kb(Cardle1/6.0kb(Cardle等，等，2000)2000)；人类基因组；人类基因组1/6 kb(1/6 kb(BeckmannBeckmann等等1992)1992)ESTEST中也广泛存在着中也广泛存在着SSRSSR：不同物种的不同物种的EST-SSREST-SSR分布频率存在很分布频率存在很大差异，大差异，1/3.4kb-1/20kb1/3.4kb-1/20kb；在单子叶和双子叶植物中在单子叶和双子叶植物中EST-SSR数量和分布也有差异数量和分布也有差异,平均分别为平均分别为1/64.6kb和和1/21.2kb不同不同ESTEST位置的位置的SSR SSR 含量与重复类型也各不相同含量与重复类型也各不相同:编码区主要是编码区主要是三核苷酸重复类型，三核苷酸重复类型，33端非翻译区主要是三、四核苷酸重复类端非翻译区主要是三、四核苷酸重复类型，型，55端非翻译主要是二、三核苷酸重复类型端非翻译主要是二、三核苷酸重复类型SSR的分布几种植物中几种植物中EST-SSR的的分布频率和主导类型分布频率和主导类型几种植物中EST-SSR的分布频率和主导类型SSR标记的开发标记的开发 前提：知道重复序列两侧的前提：知道重复序列两侧的DNA序列序列传统的传统的SSR标记开发标记开发基因组基因组DNA提取提取限制性酶切或超声波处理限制性酶切或超声波处理分离小片段分离小片段DNA连接到载体连接到载体转化大肠杆菌转化大肠杆菌构建基因组文库构建基因组文库合成合成SSR探针探针杂交筛选阳性克隆杂交筛选阳性克隆测序并设计引物测序并设计引物SSR-PCR及多态性分析及多态性分析SSR标记的开发前提：知道重复序列两侧的DNA序列基因组传统的传统的SSR分子标记开发方法简单分子标记开发方法简单、易掌握易掌握这种方法在许多作物的这种方法在许多作物的SSR标记开发中被广泛标记开发中被广泛应用应用，现已获得的基因组现已获得的基因组SSR标记中标记中，四分之四分之三以上的是利用传统开发方法获得的三以上的是利用传统开发方法获得的但必须对每个克隆进行筛选鉴定但必须对每个克隆进行筛选鉴定，工作量大工作量大，需花费大量人力，财力需花费大量人力，财力，而且效率较低而且效率较低，植物植物中已报道的阳性克隆比率约为中已报道的阳性克隆比率约为2%3%，成成功获得引物的机率则更低。功获得引物的机率则更低。传统的SSR分子标记开发方法简单、易掌握通过富集策略开发通过富集策略开发SSR标记标记为简化技术环节为简化技术环节，提高效率提高效率，降低开发成本，降低开发成本，通过研究建立了多种采取富积策略的通过研究建立了多种采取富积策略的SSRSSR标标记开发方法记开发方法基于基于RAPD的开发策略的开发策略将将RAPD RAPD 随机引物与随机引物与SSRSSR连接，作为连接，作为PCRPCR扩增扩增引物或者将引物或者将RAPDRAPD扩增产物条带用扩增产物条带用SSRSSR探针进探针进行行SouthernSouthern杂交，可以有效富集重复序列。杂交，可以有效富集重复序列。虽然目前尚不清楚虽然目前尚不清楚RAPDRAPD有利于有利于SSR SSR 富集的富集的机理机理,但这一发现大大激发了人们探求富集但这一发现大大激发了人们探求富集SSRSSR方法的兴趣。方法的兴趣。通过富集策略开发SSR标记PIMA(PCRIsolationofMicrosatelliteArrays)方法方法先用先用RAPD引物从基因组中获得随机扩增片引物从基因组中获得随机扩增片段段，扩增片段经载体克隆后扩增片段经载体克隆后，用特异用特异SSR及及载体引物对克隆阵列进行载体引物对克隆阵列进行PCR检测筛选含检测筛选含SSR克隆，对阳性克隆测序克隆，对阳性克隆测序根据以上两种利用根据以上两种利用RAPD富集富集SSR的报道的报道，均避免了基因组文库的构建均避免了基因组文库的构建，有利于节省时有利于节省时间和人力、物力间和人力、物力，但基于此方法进行大量但基于此方法进行大量SSR分离的成功报道并不多分离的成功报道并不多。PIMA(PCRIsolationofMicrosEST-EST-SSR标记的开发标记的开发数量迅速增加的数量迅速增加的ESTsESTs为开发新的为开发新的SSRSSR标记提标记提供了宝贵的供了宝贵的资源资源，各种植物中约有，各种植物中约有5-10%5-10%的的ESTEST含有可用于建立标记的含有可用于建立标记的SSRSSR建立建立EST-SSREST-SSR标记要标记要经济经济得多；而且得多；而且EST-EST-SSRSSR标记来源于标记来源于DNADNA的转录区域，比的转录区域，比gSSRgSSR标标记具有更高的记具有更高的通用性；通用性；功能标记功能标记-信息量高信息量高开发开发EST-SSREST-SSR的基本过程：的基本过程：ESTEST序列的获取序列的获取与冗余与冗余ESTEST序列剔除；序列剔除；SSRSSR的搜寻；的搜寻；SSRSSR的信的信息统计与分析；息统计与分析；SSRSSR引物设计；引物设计；PCRPCR扩增及扩增及扩增产物电泳检测扩增产物电泳检测 EST-SSR标记的开发ESTEST序列的获取与冗余序列的获取与冗余ESTEST序列剔除序列剔除公共数据库中已积累了大量的公共数据库中已积累了大量的ESTEST序列，这些序列，这些序列是共享的，可免费下载（如序列是共享的，可免费下载（如www.ncbi.www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/dbESTnlm.nih.gov/projects/dbEST ）采用采用ESTEST聚类分析软件，剔除冗余聚类分析软件，剔除冗余ESTESTSSRSSR的搜寻：的搜寻：利用软件利用软件RepeatMaskerRepeatMasker(可直接可直接登录使用登录使用-http:/repeatmasker.org/cgi-http:/repeatmasker.org/cgi-bin/WEBRepeatMasker)bin/WEBRepeatMasker)搜索非冗余搜索非冗余ESTEST中含中含有的有的SSRSSRSSRSSR的信息统计与分析：的信息统计与分析：明确明确SSRSSR特点特点SSRSSR引物设计：引物设计：Primer3Primer3（5 5）（http:/frodo.http:/frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgiwi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi）EST序列的获取与冗余EST序列剔除4584条非冗余白菜EST中SSR的出现频率重复类型重复类型基元种数基元种数SSR数目数目占占全全部部SSR比例（比例（%）出出 现现 频频 率率（%）单核苷酸单核苷酸2214.434.430.460.46二核苷酸二核苷酸420042.1942.194.364.36三核苷酸三核苷酸1019240.5140.514.194.19四核苷酸四核苷酸7132.742.740.280.28五核苷酸五核苷酸6173.593.590.370.37六核苷酸六核苷酸10234.854.850.500.50其它其它/81.691.690.170.17总计总计40474100.00100.0010.3410.344584条非冗余白菜EST中SSR的出现频率重复类型基元种白菜白菜ESTEST中二核苷酸和三核苷酸重复基元中二核苷酸和三核苷酸重复基元 重复基元重复基元数量数量发生频率发生频率(%)所占比例所占比例(%)二核苷酸二核苷酸GA/TCGA/TC1431433.123.1271.5071.50ATAT49491.071.0724.5024.50GT/ACGT/AC5 50.110.112.502.50GCGC3 30.070.071.501.50三核苷酸三核苷酸GAA/TTCGAA/TTC72721.571.5737.5037.50TCC/AGGTCC/AGG38380.830.8319.7919.79CAT CAT 26260.570.5713.5413.54CCA/TGGCCA/TGG19190.410.419.909.90TTG/AACTTG/AAC16160.350.358.338.33CGG/CCGCGG/CCG9 90.200.204.694.69CGACGA5 50.110.112.602.60CTGCTG4 40.090.092.082.08TCTTCT2 20.040.041.041.04GATGAT1 10.020.020.520.52白菜EST中二核苷酸和三核苷酸重复基元重复基元数量发生频重复重复基元基元长度长度(bp)重复性质重复性质变化范围变化范围 平均长度平均长度)完全重复完全重复不完全重复不完全重复总计总计二核苷酸二核苷酸12-7927.411684200三核苷酸三核苷酸16-18355.288104192四核苷酸四核苷酸21-17671.88513五核苷酸五核苷酸26-15240.712517六核苷酸六核苷酸18-17482.732023合计合计12-18344.1227218445白菜白菜ESTEST中中SSRSSR的重复长度和性质的重复长度和性质重复长度(bp)重复性质变化范围平均长度)完全重复不引物编号引物编号重复基元重复基元预期产物大小预期产物大小Tm(Tm()GC%GC%序列序列(5(5 3 3)EST-EST-SSRP001SSRP001（CTGCTG）242424459.8845.00AGCTCGTTGGTTCATTTGCTAGCTCGTTGGTTCATTTGCT59.5255.00GCAACCACAGTTACAGCAGCGCAACCACAGTTACAGCAGCEST-EST-SSRP002SSRP002（TCTC）171721360.0850.00ACGATGAATCCAGTCAAGGCACGATGAATCCAGTCAAGGC59.8345.00TAAAACCCTGTTCGTTTGGGTAAAACCCTGTTCGTTTGGGEST-EST-SSRP003SSRP003（TCTC）141421260.0250.00TTTCTCCGCCAAGTAGTGCTTTTCTCCGCCAAGTAGTGCT60.0750.00GACGGTTACGGAATCGAGAAGACGGTTACGGAATCGAGAAEST-EST-SSRP004SSRP004（CATCAT）7 719960.7245.00TGCTTGCAGAAAGACGAACATGCTTGCAGAAAGACGAACA29359.8545.00TTGAGCGTAGGCAGGAAAATTTGAGCGTAGGCAGGAAAATEST-EST-SSRP005SSRP005（CATACATA）171729360.6160.00CACGCCTAGCACTGTCTCCTCACGCCTAGCACTGTCTCCT59.9355.00GGACTCGATGTAGGGGTTGAGGACTCGATGTAGGGGTTGAEST-EST-SSRP006SSRP006（TTCTTC）202024660.1960.00GGCTCCTCGGTTATAGCCTCGGCTCCTCGGTTATAGCCTC59.9650.00ACCAGCTTCCATCCATAACGACCAGCTTCCATCCATAACGEST-EST-SSRP007SSRP007（GAGA）383825159.8950.00TGGATTAAGACCATCCCGAGTGGATTAAGACCATCCCGAG59.8955.00AGAAGGAGCTCTTGTGAGCGAGAAGGAGCTCTTGTGAGCGEST-EST-SSRP008SSRP008（GAGA）222222060.7355.00AGATTACTGGAGAAGCCGCCAGATTACTGGAGAAGCCGCC59.8955.00AGAAGGAGCTCTTGTGAGCGAGAAGGAGCTCTTGTGAGCG对白菜对白菜EST-SSREST-SSR设计的引物（其中设计的引物（其中8 8对）对）引物编号重复基元预期产物大小Tm()GC%序列(53扩增产物电泳检测扩增产物电泳检测 600500400300200tea planttea plantChinese cabbageChinese cabbageoilseed rapeoilseed rape 扩增产物电泳检测600t分子育种学ppt课件分子标记与植物育种SSR标记的特点标记的特点(1)数量较为丰富，覆盖整个染色体组数量较为丰富，覆盖整个染色体组(2)具有多等位基因特性，信息含量高具有多等位基因特性，信息含量高(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性以孟德尔方式遗传，呈共显性(4)易于利用易于利用PCR技术分析，对技术分析，对DNA数量及数量及纯度要求不高，结果重复性好纯度要求不高，结果重复性好(5)每个位点由引物序列顺序决定，便于交换每个位点由引物序列顺序决定，便于交换SSR标记的特点分子育种学ppt课件分子标记与植物育种分子育种学ppt课件分子标记与植物育种6）ISSRISSR标记标记(I Internter S Simple imple S Sequence equence R Repeatepeat，ISSRISSR ）ISSRISSR标记由加拿大标记由加拿大ZietkiewiczZietkiewicz等等(1994)(1994)所发展所发展ISSRISSR原理：原理：根据基因组内广泛存在的根据基因组内广泛存在的SSRSSR设计引物，设计引物，对两侧具有反向排列对两侧具有反向排列SSRSSR的一段的一段DNADNA序列进行扩增，序列进行扩增，然后进行电泳检测，根据谱带的有无及相对位置来然后进行电泳检测，根据谱带的有无及相对位置来分析多态性。分析多态性。(A)(B)SSR引物引物6）ISSR标记(InterSimpleSequenceISSRISSR引物引物组成：组成：16-1816-18个碱基，由个碱基，由2-42-4个碱基组成的串联个碱基组成的串联重复序列和几个非重复的重复序列和几个非重复的1-41-4个锚定碱基组成个锚定碱基组成无锚定碱基引物可与无锚定碱基引物可与任何位置任何位置(TC)(TC)结合结合5 5端加端加2 2个锚定碱基个锚定碱基（NNNN）引物只能与）引物只能与3 3端特异位置端特异位置(TC)(TC)结合结合3 3端加端加2 2个锚定碱基个锚定碱基（NNNN）引物只能与）引物只能与5 5端特异位置端特异位置(TC)(TC)结合结合ISSR引物组成：16-18个碱基，由2-4个碱基组成的串联2 2个个ISSRISSR引物的扩增引物的扩增 2个ISSR引物的扩增ISSRISSR标记标记技术要点技术要点引物中串联重复序列的选择：引物中串联重复序列的选择：基因组中出现最多的是基因组中出现最多的是二、三核苷酸二、三核苷酸SSRSSR，设计，设计ISSRISSR引物时应与这些序列互引物时应与这些序列互补的加锚重复序列为主（补的加锚重复序列为主（单个或两个组合单个或两个组合单个或两个组合单个或两个组合）引物中锚定碱基位置的确定：引物中锚定碱基位置的确定：根据用根据用100个个引物对小引物对小麦基因组进行扩增麦基因组进行扩增，55个引物能扩增，产生多态性个引物能扩增，产生多态性最多的是最多的是CTCT、GAGA、CA CA 和和CCTCCT的引物，而且大多数引的引物，而且大多数引物是在物是在3端加锚，只有引物端加锚，只有引物ATAT是在是在5 5 端加锚，在端加锚，在 3 3端加锚的端加锚的ATAT引物没有扩增产物引物没有扩增产物反应条件：反应条件：同普通同普通PCRPCR一样，也要对反应条件进行优一样，也要对反应条件进行优化，化，主要考虑引物浓度及其退火温度、镁离子浓度、主要考虑引物浓度及其退火温度、镁离子浓度、模板浓度。模板浓度。ISSRISSR扩增产物的分离：扩增产物的分离：常用琼脂糖浓度为常用琼脂糖浓度为1.5-2.0%1.5-2.0%，聚丙烯酰胺浓度为聚丙烯酰胺浓度为6-8%6-8%ISSR标记技术要点ISSRISSR标记优点标记优点产物在进行测序胶电泳分离，具有单碱基的高分产物在进行测序胶电泳分离，具有单碱基的高分辨率辨率，遗传信息量大遗传信息量大呈孟德尔式遗传呈孟德尔式遗传，具有很好的稳定性和多态性具有很好的稳定性和多态性DNA用量少用量少，技术要求低技术要求低引物具有通用性引物具有通用性ISSRISSR标记技术的缺点标记技术的缺点由于由于SSR座位突变率高座位突变率高，对变异反应非常敏感对变异反应非常敏感，所以易受到平行演化程度的影响所以易受到平行演化程度的影响，从而给物种间从而给物种间亲缘关系的评估带来误差亲缘关系的评估带来误差针对每个座位测定并找到针对每个座位测定并找到SSR两端寡聚核苷酸两端寡聚核苷酸来设计引物来设计引物，较费时耗力较费时耗力通常为显性标记通常为显性标记，不能区分杂合体，不能区分杂合体ISSR标记优点7）单核苷酸多态性单核苷酸多态性(S Single ingle N Nucleotide ucleotide P Polymorphismolymorphism，SNPSNP）第三代分子第三代分子第三代分子第三代分子标记技术标记技术标记技术标记技术 测序测序测序测序SNPSNP是指基因组内是指基因组内单个核苷酸变异引起的单个核苷酸变异引起的DNADNA序列多序列多态性，包括单个碱基的转换态性，包括单个碱基的转换(transition(transition，如，如TCTC和和AG)AG)以及颠换以及颠换(transversion)(transversion)，而且其中最少一，而且其中最少一种等位基因在群体中的种等位基因在群体中的频率不小于频率不小于频率不小于频率不小于1%1%1%1%。7）单核苷酸多态性(SingleNucleotidePon转换的发生率总是明显较高：转换的发生率总是明显较高：属属于转换型变异的于转换型变异的SNP约占全部约占全部SNP的的2/3。n在单个基因或整个基因组中在单个基因或整个基因组中SNP的分布不均匀的分布不均匀，在非转录序列中，在非转录序列中要多于转录序列，而且在转录区要多于转录序列，而且在转录区也是非同义突变的频率比同义突也是非同义突变的频率比同义突变的频率低得多变的频率低得多转换的发生率总是明显较高：属于转换型变异的SNP约占全部S不同个体的不同个体的PCRPCR扩增片段直接测序是发现扩增片段直接测序是发现SNPSNP的最常的最常用方法：用方法：利用目的性状相关的基因位点或利用目的性状相关的基因位点或EST EST 序列设计序列设计引物，通过引物，通过PCR PCR 扩增，对扩增，对PCR PCR 产物进行测序，然后应用产物进行测序，然后应用SNP SNP 发现的专业软件发现的专业软件GenalysGenalys或或DNAstarDNAstar，结合，结合ClustalClustal等等软件，分析测序结果，排除测序错误，发现软件，分析测序结果，排除测序错误，发现SNPSNP。NasuNasu等等(2002)(2002)以水稻以水稻3 3个栽培种和个栽培种和1 1个野生种为实验材料，个野生种为实验材料，对分布于全基因组的对分布于全基因组的417417个位点进行个位点进行SNPSNP研究，发现了研究，发现了2 2 800 800 个个SNPSNP，发生频率平均每，发生频率平均每89 bp 89 bp 有一个有一个SNPSNP。TenaillonTenaillon等等(2001)(2001)以以2525个玉米近等系为材料，对分布在个玉米近等系为材料，对分布在1 1号染色体上的号染色体上的2121个遗传位点序列多样性进行了研究，发现个遗传位点序列多样性进行了研究，发现平均每平均每104 bp104 bp有一个有一个SNPSNP。Kota(2001)Kota(2001)等等从从1900019000个个ESTEST中选择了目的性状相关的中选择了目的性状相关的EST EST 180180个，用个，用7 7个基因型的大麦进行了研究，发现了个基因型的大麦进行了研究，发现了7272个个SNPSNP。开发开发SNP的方法的方法不同个体的PCR扩增片段直接测序是发现SNP的最常用方法：基于公共数据库的直接方法：基于公共数据库的直接方法：公共数据库中已有大公共数据库中已有大量的量的ESTEST、STSSTS、cDNAcDNA文库和基因组测序公开的序列文库和基因组测序公开的序列等信息。在这些序列之间必然存在大量的重叠区域，等信息。在这些序列之间必然存在大量的重叠区域，通过比较这些重叠区域，并运用一些软件删除由测通过比较这些重叠区域，并运用一些软件删除由测序造成的碱基错读，就可得到候选序造成的碱基错读，就可得到候选SNP SNP 甚至真正的甚至真正的SNPSNP，这种策略可大大降低成本。利用拟南芥数据，这种策略可大大降低成本。利用拟南芥数据库发现了大量库发现了大量SNPSNP，通过，通过httphttp：/www.arabidopsis.org/cereon/index.html www.arabidopsis.org/cereon/index.html 可以查可以查到这些数据。到这些数据。基因芯片技术也可用于基因芯片技术也可用于SNPSNP的开发：的开发：Wang Wang 等等(1998)(1998)报道采用报道采用DNA DNA 芯片技术从芯片技术从1672516725个个STS(STS(包含包含2Mb2Mb的的人类人类DNA)DNA)中得到中得到27482748个个SNPSNP，平均每，平均每721bp721bp有一个有一个SNPSNP。基于公共数据库的直接方法：公共数据库中已有大量的EST、SSNP的检测几种方法的检测几种方法SNPSNP检测检测要求：要求：高通量高通量、敏感、费用低、敏感、费用低n n单链构象多态性单链构象多态性单链构象多态性单链构象多态性(SingleStrandConformationPolymorphism)(SingleStrandConformationPolymorphism)生物大分子在单链旋转时，由取代基团形成的不同立生物大分子在单链旋转时，由取代基团形成的不同立体结构而产生不同的构象，这种改变不涉及共价键破体结构而产生不同的构象，这种改变不涉及共价键破坏。双链坏。双链DNA片段形成单链后，在非变性条件下会折片段形成单链后，在非变性条件下会折叠成不同的空间构象，这种构象会因个别核苷酸的不叠成不同的空间构象，这种构象会因个别核苷酸的不同而改变，长度相同或相近的单链在电泳时由于构象同而改变，长度相同或相近的单链在电泳时由于构象不同而具不同迁移率，从而显示出多态性。在不同而具不同迁移率，从而显示出多态性。在SSCP分析时，应先将扩增后的分析时，应先将扩增后的DNA片段变性为单链，然后片段变性为单链，然后在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳n1989年日本年日本Orita等创建等创建SNP的检测几种方法只能提示样本有无突变只能提示样本有无突变只能提示样本有无突变只能提示样本有无突变不能提供具体的突变位置不能提供具体的突变位置不能提供具体的突变位置不能提供具体的突变位置SSCP的技术流程的技术流程只能提示样本有无突变SSCP的技术流程变性高效液相色谱法变性高效液相色谱法(denaturinghighperformanceliquidchromatography，DHPLC)通过通过PCRPCR扩增出包含多态性位点的片段，由带正电荷的流动扩增出包含多态性位点的片段，由带正电荷的流动相将带负电荷的相将带负电荷的DNADNA分子吸附到固定相上。在加热部分变性分子吸附到固定相上。在加热部分变性的条件下，由于碱基的错配会形成的条件下，由于碱基的错配会形成2 2种同源双链分子和种同源双链分子和2 2种种异源杂合双链分子。在相同的部分变性条件下，错配的异异源杂合双链分子。在相同的部分变性条件下，错配的异源双链源双链DNADNA更易变性，被色谱柱保留时间短于同源双链更易变性，被色谱柱保留时间短于同源双链DNADNA。增加洗脱强度时，与固定相亲和力较弱的异源双链将先于增加洗脱强度时，与固定相亲和力较弱的异源双链将先于同源双链被洗脱出来，从而发现同源双链被洗脱出来，从而发现DNADNA的突变，据此可检测单的突变，据此可检测单个碱基置换、插入或缺失杂合二倍体的片段。个碱基置换、插入或缺失杂合二倍体的片段。DHPLCDHPLCDHPLCDHPLC只能提示待测样本有无突变，不能只能提示待测样本有无突变，不能只能提示待测样本有无突变，不能只能提示待测样本有无突变，不能100%100%100%100%检出检出检出检出;对每个对每个对每个对每个DNADNADNADNA片段的分析需