生物技术药物质量控制课件

生物技术药物质量控制v生物技术产品的生产和管理按生物制品的要求进行，不仅对最终产品的质量实施有效控制，而且特别生物技术产品的生产和管理按生物制品的要求进行，不仅对最终产品的质量实施有效控制，而且特别重视对生产工艺的全过程进行质量控制重视对生产工艺的全过程进行质量控制,其中包括对每个生产步骤的验证、质量检定（其中包括对每个生产步骤的验证、质量检定（QC）、质量保）、质量保证部（证部（QA）对生产和质量检定的全过程进行严格的管理。）对生产和质量检定的全过程进行严格的管理。1、概念：、概念：2、分类、分类 生物技术药物生物技术药物重组重组DNADNA药物药物重组蛋白质药物重组蛋白质药物采用采用DNADNA重组技术或其他新生物技术生产的治疗和预防药物。重组技术或其他新生物技术生产的治疗和预防药物。1、重组蛋白质或重组多肽药物包括：、重组蛋白质或重组多肽药物包括：细胞因子类：细胞因子类：rIFNrIFN、IL-2IL-2、EPOEPO等；等；抗细胞素治疗：抗细胞素治疗：CD4CD4可溶性受体等；可溶性受体等；重组溶血栓类：重组溶血栓类：rSKrSK、rSAKrSAK等；等；人源化单克隆抗体制剂；人源化单克隆抗体制剂；重组疫苗和菌苗制剂。重组疫苗和菌苗制剂。2、重组、重组DNA药物包括：药物包括：v寡核苷酸药物：反义核酸等；寡核苷酸药物：反义核酸等；v基因药物：腺病毒基因药物：腺病毒-IL-2-IL-2、腺相关病毒、腺相关病毒-凝血凝血因子；腺病毒因子；腺病毒-P53-P53v细胞治疗制剂：抗原致敏的人树突状细胞细胞治疗制剂：抗原致敏的人树突状细胞 vDNADNA疫苗：治疗乙型肝炎、爱滋病的核酸疫苗等疫苗：治疗乙型肝炎、爱滋病的核酸疫苗等。我国生物技术药物质量标准研究现状我国生物技术药物质量标准研究现状v现代医药生物技术的发展以及人类基因组计划的完成和遗传病基因的不断发现，对医药领域产生了巨现代医药生物技术的发展以及人类基因组计划的完成和遗传病基因的不断发现，对医药领域产生了巨大影响。大影响。v自自1982年第一个基因重组药物年第一个基因重组药物重组胰岛素上市以来，全世界约有重组胰岛素上市以来，全世界约有60余种重组产品开发成功，包括基余种重组产品开发成功，包括基因工程药物、基因工程抗体，重组疫苗、反义核苷酸药物、基因治疗药物、因工程药物、基因工程抗体，重组疫苗、反义核苷酸药物、基因治疗药物、DNA疫苗。疫苗。v 我国在我国在“七五七五”、“八五八五”、“九五九五”期间国家期间国家“863”高技术项目支持下，先后建立一系列基因重组制品质高技术项目支持下，先后建立一系列基因重组制品质量标准和质控方法，共完成国家一类、二类新药量标准和质控方法，共完成国家一类、二类新药20余种产品的质量标准研究。余种产品的质量标准研究。生物技术药物质量标准研究的依据生物技术药物质量标准研究的依据一、主要依照重组一、主要依照重组DNADNA产品质量控制要点、中国生物制品规程、中国药典等要求进行。产品质量控制要点、中国生物制品规程、中国药典等要求进行。二、参考世界卫生组织（二、参考世界卫生组织（WHOWHO）和美国）和美国FDAFDA颁布的指南、颁布的指南、ICHICH文件和欧洲药典。文件和欧洲药典。检定标准、检定方法：准确可靠、切实可行；保证产品安全、有效。检定标准、检定方法：准确可靠、切实可行；保证产品安全、有效。生物技术药物质量标准研究的内容生物技术药物质量标准研究的内容1、目标产品的均一性目标产品的均一性2、建立目标产品生物学活性或免疫学效价测定方法建立目标产品生物学活性或免疫学效价测定方法3、研究建立目标产品的免疫学活性的测定方法及质控标准、研究建立目标产品的免疫学活性的测定方法及质控标准4、研究建立国家标准品或参考品研究建立国家标准品或参考品5、建立目标产品生产相关杂质的限量分析方法和标准建立目标产品生产相关杂质的限量分析方法和标准6、制定出保证上述生物技术产品临床安全、有效、与、制定出保证上述生物技术产品临床安全、有效、与WHO标准相一致的质量控制标准和规范化的检定方法标准相一致的质量控制标准和规范化的检定方法重组产品质量控制上存在的难点重组产品质量控制上存在的难点v建立重组药物的生物学活性测定方法；建立重组药物的生物学活性测定方法；v理化测定标准品的稳定性；理化测定标准品的稳定性；v人源化单抗中的人源化程度检测方法及标准研究；人源化单抗中的人源化程度检测方法及标准研究；v重组人白蛋白等大剂量重组产品安全性评价问题；重组人白蛋白等大剂量重组产品安全性评价问题；v反义核酸药物理化特性测定和效力测定，即如何评价反义核酸的体内及体外活力；反义核酸药物理化特性测定和效力测定，即如何评价反义核酸的体内及体外活力；v基因治疗药物的安全性评价包括反转录病毒、生物分布和效力测定；基因治疗药物的安全性评价包括反转录病毒、生物分布和效力测定；vDNA疫苗的安全性和效力检测方法研究；疫苗的安全性和效力检测方法研究；v干细胞治疗产品的质量标准的建立（干细胞鉴定及活力测定）干细胞治疗产品的质量标准的建立（干细胞鉴定及活力测定）。我国基因工程产品安全管理我国基因工程产品安全管理法规和技术指南法规和技术指南传代细胞系生产生物制品的规程传代细胞系生产生物制品的规程人用鼠源性单克隆抗体质量控制要点人用鼠源性单克隆抗体质量控制要点预防用新生物制品临床研究的技术要求预防用新生物制品临床研究的技术要求人用重组人用重组DNA制品质量控制要点制品质量控制要点人的体细胞治疗申报临床试验指导原则人的体细胞治疗申报临床试验指导原则人基因治疗申报临床试验指导原则人基因治疗申报临床试验指导原则药理毒理检查指导原则药理毒理检查指导原则药品生产质量管理办法药品生产质量管理办法药品注册管理办法药品注册管理办法生物技术药物的质量控制生物技术药物的质量控制生物技术药物的特点：生物技术药物的特点：1、来源：活的生物体（细菌或细胞）；、来源：活的生物体（细菌或细胞）；2、结构：复杂（包括组成、空间结构）；、结构：复杂（包括组成、空间结构）；3、生产：涉及生物材料和生物学过程（发、生产：涉及生物材料和生物学过程（发 酵、细胞培养，分离纯化等），酵、细胞培养，分离纯化等），有其固有的易变性。有其固有的易变性。生物技术药物的质量控制生物技术药物的质量控制质量控制包括两个方面：质量控制包括两个方面：1、生产过程中质量控制、生产过程中质量控制GMP（硬件、软件）（硬件、软件）2、最终目标产品的质量控制（方法学研究）、最终目标产品的质量控制（方法学研究）质量控制方法学研究具体内容质量控制方法学研究具体内容一、生物学活性测定和比活性一、生物学活性测定和比活性二、蛋白质纯度检查二、蛋白质纯度检查三、蛋白质含量测定三、蛋白质含量测定四、蛋白质药物理化性质的鉴定四、蛋白质药物理化性质的鉴定五、蛋白质的二硫键分析五、蛋白质的二硫键分析六、对糖蛋白的特殊要求六、对糖蛋白的特殊要求七、残余杂质检查七、残余杂质检查八、安全性及其他检测项目八、安全性及其他检测项目九、生物技术药物待测样品保存九、生物技术药物待测样品保存一、生物学活性测定和比活性一、生物学活性测定和比活性1 1、意义：、意义：1 1）基因工程产品的化学本质为蛋白质、多肽，其活性由产品的氨基酸序列或其空间结构所形成）基因工程产品的化学本质为蛋白质、多肽，其活性由产品的氨基酸序列或其空间结构所形成 的活性中的活性中心所决定的，与其绝对质量不一致。心所决定的，与其绝对质量不一致。2 2）基因工程产品的生物学活性与药效学基本相一致。）基因工程产品的生物学活性与药效学基本相一致。3 3）利用生物学活性建立的测定效价体系，是给药品定量的依据，保证产品药效的重要手段。）利用生物学活性建立的测定效价体系，是给药品定量的依据，保证产品药效的重要手段。效价测定一般原则效价测定一般原则1 1、国际通用方法；、国际通用方法；2 2、测定结果须用国际或国家标准品校、测定结果须用国际或国家标准品校 正，以国际单位表示。正，以国际单位表示。生物学活性测定方法分类生物学活性测定方法分类1 1）体外细胞培养测定法）体外细胞培养测定法 a a、促进细胞生长作用（、促进细胞生长作用（G-CSF:NFS-60G-CSF:NFS-60）b b、抑制细胞生长作用、抑制细胞生长作用(TNF:L929)(TNF:L929)c c、间接保护细胞作用、间接保护细胞作用(IFN:VISH;VSV)(IFN:VISH;VSV)2 2）离体动物器官测定法）离体动物器官测定法 采用家兔主动脉条测定重组脑利钠肽生物活性。采用家兔主动脉条测定重组脑利钠肽生物活性。3 3）体内测定法体内测定法4 4）生化酶促反应测定法生化酶促反应测定法5 5）免疫学活性测定法免疫学活性测定法v取兔离体动脉条剪成约取兔离体动脉条剪成约1.5cm 1.5cm 长、长、2 23 mm 3 mm 宽的螺旋环，悬挂于含宽的螺旋环，悬挂于含10mL10mL通氧的通氧的3737台氏液台氏液(取取NaC1 NaC1 8.0 g8.0 g、KC1 0.2 gKC1 0.2 g、CaCl 20.2gCaCl 20.2g、NaHNaH2 2POPO4 40.05g0.05g、MgSOMgSO4 47H7H2 2O 0.1gO 0.1g、NaHCONaHCO3 3 1.0 g 1.0 g、Glucose Glucose 1.0g1.0g用蒸馏水配成用蒸馏水配成1 000 mL1 000 mL的溶液，的溶液，置于玻璃或塑料瓶中，用置于玻璃或塑料瓶中，用1 molL1 molL-1-1 NaOH NaOH 溶液调溶液调pH pH 至至7.4)7.4)的麦氏浴槽中，加负荷的麦氏浴槽中，加负荷1g1g，稳定，稳定1h1h，期间每，期间每20min20min换换1 1次台氏液：次台氏液：连接多导记录仪，调节灵敏度，连接多导记录仪，调节灵敏度，记录血管的张力变化。记录血管的张力变化。v待张力曲线基线稳定后，加入待张力曲线基线稳定后，加入1.25 mgmL1.25 mgmL-1-1盐酸去氧肾上腺素溶液盐酸去氧肾上腺素溶液0.05 mL0.05 mL于麦氏浴槽中使其终浓度为于麦氏浴槽中使其终浓度为6.25106.2510-5-5 mgmL mgmL-1-1 ，曲线升高至最高并稳定后，开始按累计浓度给药法，曲线升高至最高并稳定后，开始按累计浓度给药法(曲线稳定后对倍增加样品浓曲线稳定后对倍增加样品浓度为：度为：6.25106.2510-5-58.0108.010-2-2 RUmL)RUmL)加入重组人脑利钠肽对照品，记录血管的张力变化。完成上述给加入重组人脑利钠肽对照品，记录血管的张力变化。完成上述给药后，洗脱并稳定药后，洗脱并稳定1 h1 h，期问每，期问每20 min20 min换换1 1次台氏液。待基线稳定后，次台氏液。待基线稳定后，按测定对照品的方法测定待测样品，按测定对照品的方法测定待测样品，记录测定结果。计算对照品和各实验样品的半效稀释倍数，记录测定结果。计算对照品和各实验样品的半效稀释倍数，按下式计算样品效价：样品效价按下式计算样品效价：样品效价=对照品效价对照品效价样品半效稀释倍数对照品半效稀释倍数样品半效稀释倍数对照品半效稀释倍数生物学活性测定方法选择生物学活性测定方法选择体内测定和体外测定方法体内测定和体外测定方法 a a、体内测定：即整体动物测定，能为较大范围的重组产品的效价提供有用信息，但费时、昂贵、难操作及同时、体内测定：即整体动物测定，能为较大范围的重组产品的效价提供有用信息，但费时、昂贵、难操作及同时存在伦理问题，大多数情况下倾向于选择体外测定方法。存在伦理问题，大多数情况下倾向于选择体外测定方法。b b、体外测定：可使用分离的器官或组织、原代细胞或传代细胞系，目前最常用方法是连续生长、因子依赖的、体外测定：可使用分离的器官或组织、原代细胞或传代细胞系，目前最常用方法是连续生长、因子依赖的、克隆化的细胞系的方法，其测定结果比较准确、重现性好、经济、容易使用和便于统计分析。克隆化的细胞系的方法，其测定结果比较准确、重现性好、经济、容易使用和便于统计分析。生物学活性测定方法选择生物学活性测定方法选择2 2、定量、半定量、定性方法、定量、半定量、定性方法 a a、通过研究首先选择能够定量评价的方法，最好的选择是背景较低的反应，并且对相关产品有陡峭的、通过研究首先选择能够定量评价的方法，最好的选择是背景较低的反应，并且对相关产品有陡峭的、可重复的剂量可重复的剂量-反应曲线；其次考虑半定量方法（如反应曲线；其次考虑半定量方法（如NGFNGF），最后考虑定性（如），最后考虑定性（如BMPBMP）方法。）方法。b b、对生产工艺稳定，生物学活性测定方法复杂，可采用其他替代方法（如重组人生长激素用、对生产工艺稳定，生物学活性测定方法复杂，可采用其他替代方法（如重组人生长激素用HPLCHPLC定量方定量方法代替复杂生物活性测定方法）。法代替复杂生物活性测定方法）。细胞培养法中细胞染色标记方法细胞培养法中细胞染色标记方法 3 3H-thymidineH-thymidine、BrdU BrdU 是反映是反映DNADNA合成、增殖细胞合成、增殖细胞数的比例的。数的比例的。BrdUBrdU：首先用：首先用BrdUBrdU做标记，固定细做标记，固定细胞，用核苷酸酶处理后使过氧化物酶结合抗胞，用核苷酸酶处理后使过氧化物酶结合抗BrdUBrdU抗抗体发生反应。体发生反应。MTT MTT（四氮唑盐）：其在活细胞的线粒体中可以（四氮唑盐）：其在活细胞的线粒体中可以定量地被琥珀酸脱氢酶还原为难溶性的蓝紫色结晶定量地被琥珀酸脱氢酶还原为难溶性的蓝紫色结晶物物MTT formazan,MTT formazan,二甲基亚砜（二甲基亚砜（DMSODMSO）和酸化的异丙）和酸化的异丙醇或酸化的醇或酸化的SDSSDS均能溶解紫色结晶物，均能溶解紫色结晶物，通过比色法测通过比色法测定定MTT formazanMTT formazan的量可以反映线粒体电子传递系统的量可以反映线粒体电子传递系统机能，间接表示细胞的生长状态。机能，间接表示细胞的生长状态。Alamar BlueAlamar Blue：氧化型：氧化型Alamar BlueAlamar Blue（600nm600nm）可被活细胞中的线粒体酶还原，还原后染料（）可被活细胞中的线粒体酶还原，还原后染料（570nm570nm）发）发生颜色和荧光改变，颜色和荧光的深浅与活细胞数成正比，可用分光光度计或荧光检测仪检测。生颜色和荧光改变，颜色和荧光的深浅与活细胞数成正比，可用分光光度计或荧光检测仪检测。Crystal violet Crystal violet：染活细胞后，在比色计中测定光吸收值（：染活细胞后，在比色计中测定光吸收值（A A），），A A值与着染色细胞数成正比。值与着染色细胞数成正比。几种细胞培养测定方法比较几种细胞培养测定方法比较 3H-thymidine BrdU MTT Alamar Blue靶向物靶向物 DNA合成系统合成系统 线粒体电子传递系统线粒体电子传递系统 检出细胞的状态检出细胞的状态 增殖增殖 增殖、生存增殖、生存检出法检出法 放射活性放射活性 色素、荧光色素、荧光 色素色素 色素、荧光色素、荧光抽出的必要性抽出的必要性 +-其他试剂的必要性其他试剂的必要性 +-成本（以成本（以MTT为为1时）时）60 80-100（试剂盒）（试剂盒）1 2缺点缺点 使用同位素使用同位素 不适合不适合 检出大量未增殖检出大量未增殖 检出未增检出未增 浮游细胞浮游细胞 细胞，处理时费力细胞，处理时费力 殖活细胞殖活细胞 生物学活性测定分析方法生物学活性测定分析方法 1 1、用能诱导、用能诱导50%50%最大反应的待测样品最高稀释度作为参考效价（或滴度），或以此稀释度中所含样品的量最大反应的待测样品最高稀释度作为参考效价（或滴度），或以此稀释度中所含样品的量为为1 1单位，即以此稀释度的倒数为待测样品所含的单位数。单位，即以此稀释度的倒数为待测样品所含的单位数。2 2、比较已知浓度或活性单位样品标准品和待测样品的实验结果。、比较已知浓度或活性单位样品标准品和待测样品的实验结果。活性标准品活性标准品待测样品待测样品稀释度稀释度a ba bA A值值生物学测定基本模式图生物学测定基本模式图蛋白质药物的比活性测定的意义蛋白质药物的比活性测定的意义1 1、比活性：每毫克蛋白质的生物学活性单位。、比活性：每毫克蛋白质的生物学活性单位。2 2、蛋白质的空间结构不能常规测定，而它的改变（如二硫键的错误配对）可影响蛋白质的生物学活性，从而影、蛋白质的空间结构不能常规测定，而它的改变（如二硫键的错误配对）可影响蛋白质的生物学活性，从而影响药效，比活性可以反映此种情况。响药效，比活性可以反映此种情况。3 3、比活性可反映产品生产工艺的稳定情况，可比较不同表达体系、不同生产厂家生产同一产品时的质量情况。、比活性可反映产品生产工艺的稳定情况，可比较不同表达体系、不同生产厂家生产同一产品时的质量情况。4 4、比活性是重组蛋白质药物不同于化学药的一项重要指标，也是进行成品分装的重要定量依据。、比活性是重组蛋白质药物不同于化学药的一项重要指标，也是进行成品分装的重要定量依据。生物活性测定标准范围确定生物活性测定标准范围确定1 1、使用验证过的测定和分析方法，并提供用此方法的效价测定平均值和单测定一批误差的可信限范围。、使用验证过的测定和分析方法，并提供用此方法的效价测定平均值和单测定一批误差的可信限范围。2 2、对于成品的生物活性测定标准，要根据不同方法的特点规定相当标示量的范围，目前，生物活性的测定方、对于成品的生物活性测定标准，要根据不同方法的特点规定相当标示量的范围，目前，生物活性的测定方法有四类：动物基础、细胞基础、生化（酶）法、特异（免疫、受体）结合法。法有四类：动物基础、细胞基础、生化（酶）法、特异（免疫、受体）结合法。不同生物活性测定方法的规定标准表不同生物活性测定方法的规定标准表 测定方法测定方法 规定标准规定标准动物基础的生物活性测定动物基础的生物活性测定 70%70%130%130%标示量标示量细胞基础的生物活性测定细胞基础的生物活性测定 80%80%120%120%标示量标示量体外酶法的生物活性测定体外酶法的生物活性测定 85%85%115%115%标示量标示量受体结合的生物活性测定受体结合的生物活性测定 85%85%115%115%标示量标示量生物学活性效价测定过程中生物学活性效价测定过程中标准品的作用标准品的作用1 1、生物学活性测定变异范围大，同样制品在不同实验室测定结果差异很大，必须有一个统一的标准。、生物学活性测定变异范围大，同样制品在不同实验室测定结果差异很大，必须有一个统一的标准。2 2、标准品的使用，最大限度地减少实验室之间和各种影响测定因素地干扰。、标准品的使用，最大限度地减少实验室之间和各种影响测定因素地干扰。二、蛋白质纯度检查二、蛋白质纯度检查1、蛋白质纯度检查是重组蛋白质药物地重要指标之一。、蛋白质纯度检查是重组蛋白质药物地重要指标之一。2、按、按WHOWHO规定必须用规定必须用HPLCHPLC和非还原和非还原SDS-PAGESDS-PAGE两种方法测定，其纯度都应达到两种方法测定，其纯度都应达到95%以上，有的甚至要求达以上，有的甚至要求达到到99%以上。以上。3、纯度的检查通常是在原液中进行。、纯度的检查通常是在原液中进行。4、方法：非还原、方法：非还原SDS-PAGESDS-PAGE电泳法、电泳法、HPLCHPLC法、毛细管电泳。法、毛细管电泳。非还原非还原SDS-PAGESDS-PAGE电泳法：电泳法：1 1、银染加样量、银染加样量5ug 5ug （1 110ng10ng）2 2、考马斯亮蓝、考马斯亮蓝R-250R-250 加样量加样量10ug 10ug （100ng100ng）结结 果：无明显杂蛋白带出现；目标蛋白量应不低于总蛋白量的果：无明显杂蛋白带出现；目标蛋白量应不低于总蛋白量的95%95%或或98%98%。蛋白质样品在荷质比均一。蛋白质样品在荷质比均一。HPLCHPLC法：分子筛、反相层析，离子交换层析，尽量采用与法：分子筛、反相层析，离子交换层析，尽量采用与SDS-PAGESDS-PAGE原理不同的反相或离子交换层析，原理不同的反相或离子交换层析，不主张用分子筛分析。不主张用分子筛分析。毛细管电泳：简便、快速、灵敏度和分辨率高；价格高、重现性差。毛细管电泳：简便、快速、灵敏度和分辨率高；价格高、重现性差。几种检定重组蛋白纯度方法的比较几种检定重组蛋白纯度方法的比较特性特性 HPLC SDS-PAGEHPLC SDS-PAGE、IEF CEIEF CE分离机制分离机制 极性、非极性分配，极性、非极性分配，电荷、等电点电荷、等电点 电荷等电荷等 分子大小、离子交换分子大小、离子交换 分析所需时间分析所需时间 10120min 几小时几小时 1030min 分辨力分辨力 好好 好好 好好样品体积样品体积 1050ul 150ul 150nl 灵敏度范围灵敏度范围 ng ug ngug pg 定量准确性定量准确性 +分析方式分析方式 紫外、荧光、折射紫外、荧光、折射 紫外（可见、荧光）紫外（可见、荧光）同同HPLCHPLC 电化学、放射性电化学、放射性 银染、放射自显影银染、放射自显影仪器价格仪器价格 中高中高 低低 中高中高日常消耗日常消耗 低低 高高 低低自动化自动化 中高中高 低低 中高中高人力操作人力操作 低低 高高 低低制备级制备级 中中 中中 微量级制备微量级制备收集样品收集样品 可以可以 可以可以 较困难较困难 用于研究蛋白质纯度的方法和机制用于研究蛋白质纯度的方法和机制 方法方法 分析机制分析机制 反相反相HPLC HPLC 疏水性疏水性 疏水性相互作用疏水性相互作用HPLC HPLC 疏水性疏水性 毛细管电泳毛细管电泳 荷质比荷质比 离子交换离子交换HPLC HPLC 电荷电荷 等电聚焦等电聚焦 电荷电荷 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 电荷比电荷比 SDS SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 电荷，分子大小电荷，分子大小 分子排阻分子排阻HPLC HPLC 分子大小分子大小 质谱测量法质谱测量法 分子大小分子大小三、蛋白质含量测定三、蛋白质含量测定1 1、此项目主要用于原液比活性计算和成品规格的控制。、此项目主要用于原液比活性计算和成品规格的控制。2 2、可根据物理化学性质采用、可根据物理化学性质采用Folin-Folin-酚试剂法（酚试剂法（LowryLowry法）法）、染色法（染色法（BradfordBradford法）法）、双缩脲法、双缩脲法、紫外紫外吸收法、吸收法、HPLCHPLC法和凯氏定氮等方法。法和凯氏定氮等方法。蛋白质常用的定量方法的比较蛋白质常用的定量方法的比较方法方法 所需蛋白质所需蛋白质 破坏破坏 蛋白质蛋白质/蛋白蛋白 技术技术 方法的变异方法的变异 的量（的量（mg/mlmg/ml）与否与否 质变化情况质变化情况 复杂性复杂性 系数（系数（%）双缩脲双缩脲 0.5 0.55 5 是是 少少 简单、快速简单、快速 5 5Lowry 0.05Lowry 0.055 5 是是 中等中等 显色慢、试剂多显色慢、试剂多 5 5凯氏定氮凯氏定氮 0.05 0.053 3 是是 少少 干扰、复杂、慢干扰、复杂、慢 0.154 0.154紫外吸收法紫外吸收法 0.05 0.052 2 否否 大大 简单、快速、简单、快速、0.439 0.439（280nm280nm）干扰物质多干扰物质多染料结合法染料结合法 0.01 0.010.05 0.05 是是 中等中等 简单、快速简单、快速 3.75 3.75荧光法荧光法 0.001 0.0010.01 0.01 否否 中等中等 较易较易 3.75 3.75四、蛋白质药物理化性质的鉴定四、蛋白质药物理化性质的鉴定v特异性鉴别试验特异性鉴别试验v相对分子质量测定相对分子质量测定v等电点测定等电点测定v肽图分析肽图分析v吸收光谱吸收光谱v氨基酸组成分析氨基酸组成分析vN N末端和末端和C C末端氨基酸测序末端氨基酸测序特异性鉴别试验特异性鉴别试验v主要确定蛋白质的抗原性主要确定蛋白质的抗原性v免疫学方法（免疫印迹、斑点免疫、免疫电泳、免疫扩散）：根据抗原抗体特异性反应建立的方法。免疫学方法（免疫印迹、斑点免疫、免疫电泳、免疫扩散）：根据抗原抗体特异性反应建立的方法。v抗体中和活性抑制法：此法可用于原液和成品的鉴别试验，该方法简便易行、要求抗体必须为中和抗体。抗体中和活性抑制法：此法可用于原液和成品的鉴别试验，该方法简便易行、要求抗体必须为中和抗体。相对分子质量测定相对分子质量测定v还原型还原型SDS-PAGESDS-PAGE：蛋白质在：蛋白质在SDSSDS和和-巯基乙醇存在下沸水浴巯基乙醇存在下沸水浴5min5min，形成表面带大量负电荷的杆状分子，形成表面带大量负电荷的杆状分子，降低了分子形态和电荷的影响，在电泳过程中蛋白迁移率基本只与其相对分子质量相关。降低了分子形态和电荷的影响，在电泳过程中蛋白迁移率基本只与其相对分子质量相关。v凝胶过滤（分子筛）法：根据蛋白分子大小和性状进行测定。凝胶过滤（分子筛）法：根据蛋白分子大小和性状进行测定。等电点测定等电点测定v重组蛋白质药物的等电点往往是不均一的，重组蛋白质药物的等电点往往是不均一的，但在生产过程中批与批之间的电泳结果应一致，但在生产过程中批与批之间的电泳结果应一致，以说明其生产工艺的稳定性。以说明其生产工艺的稳定性。v方法：等电聚焦电泳法方法：等电聚焦电泳法(IEF)(IEF)毛细管电泳法。毛细管电泳法。肽图分析肽图分析v肽图分析可作为与天然产品或参考品的蛋白质一级结构做精密比较的手段。肽图分析可作为与天然产品或参考品的蛋白质一级结构做精密比较的手段。v蛋白质一般经化学裂解法及蛋白酶裂解后用蛋白质一般经化学裂解法及蛋白酶裂解后用HPLCHPLC、SDS-PAGESDS-PAGE电泳法、质谱法测定。电泳法、质谱法测定。v同种产品不同批次的肽图的一致性是工艺稳定性的验证指标。同种产品不同批次的肽图的一致性是工艺稳定性的验证指标。吸收光谱吸收光谱v对某一重组蛋白质来说，其最大吸收波长是固定的。对某一重组蛋白质来说，其最大吸收波长是固定的。v在生产工程中每批产品的紫外吸收光谱应当一致。在生产工程中每批产品的紫外吸收光谱应当一致。v重组产品一级结构不含芳香族氨基酸，可不做紫外吸收光谱测定。重组产品一级结构不含芳香族氨基酸，可不做紫外吸收光谱测定。氨基酸组成分析氨基酸组成分析v采用微量氨基酸自动分析仪测定，包括蛋白质水解，自动进样、氨基酸分析、定量分析报告等。采用微量氨基酸自动分析仪测定，包括蛋白质水解，自动进样、氨基酸分析、定量分析报告等。v有柱前衍生法和柱后反应法，前者是氨基酸先和荧光试剂作用生成衍生物，然后用色谱柱进行分离，检测有柱前衍生法和柱后反应法，前者是氨基酸先和荧光试剂作用生成衍生物，然后用色谱柱进行分离，检测氨基酸衍生物的荧光；后者是氨基酸先用色谱柱分离，再与茚三酮、荧胺等试剂显色后进行分析检测。氨基酸衍生物的荧光；后者是氨基酸先用色谱柱分离，再与茚三酮、荧胺等试剂显色后进行分析检测。N-N-末端和末端和C-C-末端氨基酸测序末端氨基酸测序v作为重组蛋白质和肽的重要鉴别指标，一般要求至少测定作为重组蛋白质和肽的重要鉴别指标，一般要求至少测定N-N-末端末端1515个氨基酸、个氨基酸、C-C-末端末端1 13 3氨基酸。氨基酸。五、蛋白质的二硫键分析五、蛋白质的二硫键分析v二硫键和巯基与蛋白质的生物活性密切相关，发生错误配对，不但活性降低而且会引起抗原性增二硫键和巯基与蛋白质的生物活性密切相关，发生错误配对，不但活性降低而且会引起抗原性增加。加。六、对糖蛋白的特殊要求六、对糖蛋白的特殊要求v评价用生物技术方法生产的糖蛋白时，应考虑糖基化位点的上调或下调及其对生物活性、代谢、稳评价用生物技术方法生产的糖蛋白时，应考虑糖基化位点的上调或下调及其对生物活性、代谢、稳定性、溶解性的影响。每一种真核细胞具有其独特的糖基化能力称为它的糖类型，通过基因工程方定性、溶解性的影响。每一种真核细胞具有其独特的糖基化能力称为它的糖类型，通过基因工程方法将一种糖蛋白在不同细胞中表达，可以导致生产不同类型的糖蛋白，即使在相同的细胞类型中，法将一种糖蛋白在不同细胞中表达，可以导致生产不同类型的糖蛋白，即使在相同的细胞类型中，也可能会出现糖形成时由于一些寡糖的精细结构不同等而产生截然不同的糖蛋白。也可能会出现糖形成时由于一些寡糖的精细结构不同等而产生截然不同的糖蛋白。七、残余杂质检测七、残余杂质检测 1、对残余杂质进行限制的意义、对残余杂质进行限制的意义 a、残余杂质可能具有毒性，引起安全性问题；、残余杂质可能具有毒性，引起安全性问题；b、可能影响产品的生物学活性和药理作用，或使产品变质；、可能影响产品的生物学活性和药理作用，或使产品变质；c、反映产品生产工艺的稳定性。、反映产品生产工艺的稳定性。残余杂质检测残余杂质检测 2、残余杂质分类、残余杂质分类 a、外来污染物：微生物、热原、细胞成分（蛋白质、外来污染物：微生物、热原、细胞成分（蛋白质、DNA等）、培养基成分、纯化步骤引入的成分等）、培养基成分、纯化步骤引入的成分（亲和柱中的抗体、增溶用的（亲和柱中的抗体、增溶用的SDS）等；）等；b、与产品相关的杂质：突变物、错误裂解物，二硫化物异构体、二聚体和多聚体；化学修饰形态、与产品相关的杂质：突变物、错误裂解物，二硫化物异构体、二聚体和多聚体；化学修饰形态（脱酰氨基或氧化形式、其他降解产物）（脱酰氨基或氧化形式、其他降解产物）残余杂质检测内容残余杂质检测内容v宿主细胞蛋白含量宿主细胞蛋白含量v宿主细胞宿主细胞DNADNAv鼠源型鼠源型IgGIgG含量（含量（10ng/10ng/剂量）剂量）v蛋白蛋白A A含量含量v小牛血清残留量小牛血清残留量v残余抗生素（氨苄西林）残余抗生素（氨苄西林）v内毒素含量（内毒素含量（LALLAL）v产品相关物质产品相关物质v其他杂质（加入的离子、其他杂质（加入的离子、SDSSDS、甲醛等）、甲醛等）宿主细胞蛋白含量宿主细胞蛋白含量v以双抗体夹心以双抗体夹心ELISAELISA为宜，尽量不用斑点免疫。为宜，尽量不用斑点免疫。v常采用常采用5 5种最常用的种最常用的E.coliE.coli菌株混和作为菌株混和作为ELISAELISA测菌体蛋白含量的通用标准。测菌体蛋白含量的通用标准。v不同表达体系对菌体蛋白含量标准不同。不同表达体系对菌体蛋白含量标准不同。来自来自E.coliE.coli菌株的产品为不大于菌株的产品为不大于0.1%0.1%；来自；来自CHOCHO细胞的产品为细胞的产品为不大于不大于0.05%0.05%。宿主细胞宿主细胞DNADNAv测定方法：采用测定方法：采用DNADNA杂交实验，用固相斑点杂交法，以地高辛标记检测试剂盒或者用同位素标记杂交实验，用固相斑点杂交法，以地高辛标记检测试剂盒或者用同位素标记DNADNA探探针进行测定，必须提供相应宿主细胞针进行测定，必须提供相应宿主细胞DNADNA标准品。标准品。v现行生物制品规程对宿主细胞现行生物制品规程对宿主细胞DNADNA残留量标准作了相应调整：残留量标准作了相应调整：由由小于小于100pg/100pg/剂量调整为剂量调整为小于小于10ng/10ng/剂量。剂量。v宿主细胞宿主细胞DNADNA只作为一种细胞污染因素不作为一种只作为一种细胞污染因素不作为一种危险因素危险因素。安全性及其他检测项目安全性及其他检测项目v无菌试验无菌试验v热源试验热源试验v异常毒性试验异常毒性试验v免疫原性检查免疫原性检查v水分、装量、水分、装量、pH检测检测生物技术药物待测样品保存生物技术药物待测样品保存v 生物技术药物大多为具有生物活性的蛋白质、多肽，易受环境条件的影响。生物技术药物大多为具有生物活性的蛋白质、多肽，易受环境条件的影响。v 根据不同产品原液与成品、冻干与液体制剂的不同要求，根据不同产品原液与成品、冻干与液体制剂的不同要求，可选择在可选择在2020、8080、44和常温条件下和常温条件下保存。保存。v冷冻保存的原液样品最好分成小包装保存，避免反复冻溶。冷冻保存的原液样品最好分成小包装保存，避免反复冻溶。检定方法的验证检定方法的验证v检定方法的验证就是根据方法的需要测定该方法的专属性、准确性、精密性、直线性、测定范围、检定方法的验证就是根据方法的需要测定该方法的专属性、准确性、精密性、直线性、测定范围、测定限度、测定限度、测量限度、测量限度、特异性和耐用性（或可靠性）等几个指标中的一个或几个。对于理化测定特异性和耐用性（或可靠性）等几个指标中的一个或几个。对于理化测定方法已有了确定的要求和判定标准，而生物学测定的结果具有更大的可变性，一般要使用动物或细方法已有了确定的要求和判定标准，而生物学测定的结果具有更大的可变性，一般要使用动物或细胞，这些有机体本身就具有较大的可变性，因此生物学测定的要求和合格标准要松一些。胞，这些有机体本身就具有较大的可变性，因此生物学测定的要求和合格标准要松一些。验证中需测定的参数验证中需测定的参数v1 1、专属性、专属性/特异性（特异性（selectivity/specificityselectivity/specificity）是指当检测方法对测试样品中含有制品中应有的其他化合物时，测定待测物的能力。本参数用于鉴别试是指当检测方法对测试样品中含有制品中应有的其他化合物时，测定待测物的能力。本参数用于鉴别试验、浓度或效力试验和纯度试验的测定，以确定使用该检测方法所测定的结果是否准确地反映了制品验、浓度或效力试验和纯度试验的测定，以确定使用该检测方法所测定的结果是否准确地反映了制品的鉴别、效价或纯度。特异性就象准确性一样，一般用偏差或测定值与已知值之间的错误率（的鉴别、效价或纯度。特异性就象准确性一样，一般用偏差或测定值与已知值之间的错误率（%）来）来表示。表示。2 2、直线性（、直线性（linearitylinearity）是测定结果与样品中测试物浓度的线性关系，该参数的测定将确定检测方法的测量范围，它可以表是测定结果与样品中测试物浓度的线性关系，该参数的测定将确定检测方法的测量范围，它可以表示为回归直线的斜率和离散性，或者相关系数示为回归直线的斜率和离散性，或者相关系数R R和测定系数和测定系数R R2 2 。3 3、测量范围（、测量范围（RangeRange）是指当准确性和精密性都能达到要求时所能测得的样品中待检物的最高和最低浓度范围，它就是测定直是指当准确性和精密性都能达到要求时所能测得的样品中待检物的最高和最低浓度范围，它就是测定直线性的上下限，如果剂量和反应间的关系不成直线，测量范围可以通过校正曲线来测得。在中华人民线性的上下限，如果剂量和反应间的关系不成直线，测量范围可以通过校正曲线来测得。在中华人民共和国药典中规定测量范围是指能达到一定精密度、准确性和直线性，测定方法适用的高低限度或量共和国药典中规定测量范围是指能达到一定精密度、准确性和直线性，测定方法适用的高低限度或量的区间。的区间。4 4、准确性（、准确性（accuracyaccuracy）表示测定值与真实值之间的一致性或接近的程度。一般采用填加和回收试验来测定准确性，即将已知量的样品加表示测定值与真实值之间的一致性或接近的程度。一般采用填加和回收试验来测定准确性，即将已知量的样品加到空白中进行测定，比较测定值与真实值之比。准确性一般表示为偏差或测定值与真值之间的错误率（回收率）到空白中进行测定，比较测定值与真实值之比。准确性一般表示为偏差或测定值与真值之间的错误率（回收率）（即测定值（即测定值/真实值真实值100%100%）。一般对于生物制品而言，因为没有纯的标准品，所以准确性不太实用。生物制品）。一般对于生物制品而言，因为没有纯的标准品，所以准确性不太实用。生物制品测定时一般与同时进行的参考品进行比较而得，此时的合格标准一般是测定出的参考品值的合格范围或样品与测定时一般与同时进行的参考品进行比较而得，此时的合格标准一般是测定出的参考品值的合格范围或样品与参考品之间的比值。参考品之间的比值。5 5、精密性（、精密性（precisionprecision）表示测定值之间的一致性或接近的程度，一般表示为变异系数表示测定值之间的一致性或接近的程度，一般表示为变异系数(CV%)(CV%)，变异系数即，变异系数即是测定值的标准差与测定值的比值。精密性分几种：一种是实验内的精密性（即重复性是测定值的标准差与测定值的比值。精密性分几种：一种是实验内的精密性（即重复性 ），它是在同一），它是在同一次试验内同一个样品多次测定结果间的变异系数。另一种是试验间的精密性，它是在同一实验室内不同次试验内同一个样品多次测定结果间的变异系数。另一种是试验间的精密性，它是在同一实验室内不同次试验间对同一样品多次测定结果间的变异系数。实验室之间的精密性即重现性一般可通过协作研究得次试验间对同一样品多次测定结果间的变异系数。实验室之间的精密性即重现性一般可通过协作研究得到，此参数不适合生产设施的验证。到，此参数不适合生产设施的验证。6 6、测定限度（、测定限度（Limit of DetectionLimit of Detection）是指能够测定出的样品中测试物的最低量。该量并不一定要定是指能够测定出的样品中测试物的最低量。该量并不一定要定量测出其准确的含量或浓度，量测出其准确的含量或浓度，LODLOD是检查限度实验中最重要的一个参数。是检查限度实验中最重要的一个参数。7 7、测量限度（、测量限度（Limit of QuantitationLimit of Quantitation）是指在准确性和精密性都能达到要求时能够定量测定出的样品中测试物的最低量。是指在准确性和精密性都能达到要求时能够定量测定出的样品中测试物的最低量。LOQLOQ是检查测定药是检查测定药品中不纯物方法的一个参数。品中不纯物方法的一个参数。8 8、耐用性（、耐用性（robustness/ruggednessrobustness/ruggedness）是通过有效地改变实验方法的参数，来测定此改变对试验结果的影响，即实验结果不受影响的承受程度。是通过有效地改变实验方法的参数，来测定此改变对试验结果的影响，即实验结果不受影响的承受程度。参数的改变可以是室温或培养温度，或湿度、或改变培养时间，或对试剂的参数的改变可以是室温或培养温度，或湿度、或改变培养时间，或对试剂的pHpH进行较小范围的调整等。进行较小范围的调整等。在每种试验条件下，对准确性、精密性、或其他参数进行测定，以确定试验方法的耐受或承受能力。在每种试验条件下，对准确性、精密性、或其他参数进行测定，以确定试验方法的耐受或承受能力。不同测定方法应进行的验证的参数不同测定方法应进行的验证的参数 参参 数数 鉴别试验鉴别试验 杂质检查杂质检查 效价效价测定测定 组成测定组成测定 定量定量 限度限度 准确性准确性 +精确性精确性 +耐用性耐用性 +直线性和直线性和测定范围测定范围 +选择性或选择性或特异性特异性 +测定限度测定限度 +测量限度测量限度 +生物测定的特殊性生物测定的特殊性 由于生物测定的持续性、复杂性、以及参考品和样品贮存时间较长的特性，除了上述验证参数外，对于生物测由于生物测定的持续性、复杂性、以及参考品和样品贮存时间较长的特性，除了上述验证参数外，对于生物测定有另外几个参数也非常重要，包括：定有另外几个参数也非常重要，包括：1 1、试验顺序（、试验顺序（front-to-back testfront-to-back test）的影响：它是测定在一个较复杂的试验中，先测和后测对试验参数的影响。）的影响：它是测定在一个较复杂的试验中，先测和后测对试验参数的影响。这是由于它们相对于对照品的测定时间不一样而造成的。这是由于它们相对于对照品的测定时间不一样而造成的。生物测定的特殊性生物测定的特殊性 2)2)冻融稳定性的影响：将样品反复冻融，以确定对测定结果的影响。冻融稳定性的影响：将样品反复冻融，以确定对测定结果的影响。3 3）批间的精密性：测定不同批细胞、血清、或其他具有较高变化性的物质对测定方法精确性的影响。）批间的精密性：测定不同批细胞、血清、或其他具有较高变化性的物质对测定方法精确性的影响。生物技术药物生物学活性生物技术药物生物学活性测定方法的验证测定方法的验证 生物学活性测定验证应考虑的问题：生物学活性测定验证应考虑的问题：1 1、生物学活性是相对活性，须用标准品或、生物学活性是相对活性，须用标准品或参比品作对照；参比品作对照；2 2、样品和标准品的剂量反应曲线必须是平、样品和标准品的剂量反应曲线必须是平行的；行的；3 3、应对方法的变异性进行统计学分析，确、应对方法的变异性进行统计学分析，确定生物学活性可接受的范围；定生物学活性可接受的范围；4 4、应对引起系统偏差的某些因素进行综合、应对引起系统偏差的某些因素进行综合分析。分析。几种生物技术药物检验项目表几种生物技术药物检验项目表IFN2bIFN2b原液原液1 1、蛋白含量、蛋白含量8 8、宿主菌蛋残留量、宿主菌蛋残留量总蛋白质的总蛋白质的0.1%0.1%2 2、等电点、等电点 4.0 4.06.7 6.7 9 9、鼠、鼠IgGIgG含量含量100 ng/100 ng/剂量剂量3 3、电泳纯度、电泳纯度95.0%95.0%分子量分子量 19.2Kg10%19.2Kg10%1010、残留外源性、残留外源性DNA 10ng/DNA 10ng/剂量剂量4 4、HPLCHPLC纯度纯度95.0%95.0%1111、残留抗生素活性、残留抗生素活性5 5、紫外光谱扫描应为、紫外光谱扫描应为 278nm3nm 278nm3nm 1212、细菌内毒素含量、细菌内毒素含量10Eu/30010Eu/300万万IUIU6 6、比活性、比活性1.0101.0106 6IU/mgIU/mg 蛋白蛋白1313、无菌试验、无菌试验7 7、肽、肽 图图几种生物技术药物检验项目表几种生物技术药物检验项目表IFN2bIFN2b粉针剂粉针剂IFN2bIFN2b注射液注射液1 1、外观性状、外观性状1 1、外观性状、外观性状2 2、PHPH值值 6.5 6.57.67.62 2、PHPH值值 6.5 6.57.67.63 3、水分、水分3.0%3.0%3 3、装量、装量1.0ml1.0ml4 4、无菌试验、无菌试验4 4、无菌试验、无菌试验5 5、热源试验均低于、热源试验均低于0.600.60总和不超过总和不超过1.401.405 5、热源试验均低于、热源试验均低于0.600.60总和不超过总和不超过1.401.406 6、效价测定、效价测定 标示量标示量80%80%150%150%6 6、效价测定、效价测定 标示量标示量80%80%150%150%7 7、异常毒性、异常毒性7 7、异常毒性、异常毒性几种生物技术药物检验项目表几种生物技术药物检验项目表IFN2b IFN2b 栓剂栓剂IFN2bIFN2b乳膏乳膏IFN2bIFN2b滴眼液滴眼液外观性状外观性状外观性状外观性状外观性状外观性状重量差异重量差异7.5%7.5%装量检查每支装量不得低于标示量的装量检查每支装量不得低于标示量的93%93%PHPH值值 5.0 5.06.06.0效价测定效价测定80%80%150%150%效价测定效价测定80%80%150%150%效价测定效价测定80%80%150%150%细菌细菌100100个个/克克细菌细菌100100个个/克克无菌试验无菌试验霉菌霉菌1010个个/克克霉菌霉菌1010个个/克克装量检查每支装量不低于标示装量检查每支装量不低于标示量的量的93%93%铜绿假单胞菌不得检出铜绿假单胞菌不得检出铜绿假单胞菌不得检出铜绿假单胞菌不得检出鉴别试验鉴别试验金黄色葡萄球菌不得检出金黄色葡萄球菌不得检出金黄色葡萄球菌不得检出金黄色葡萄球菌不得检出栓剂融变时限栓剂融变时限6060分钟分钟鉴别试验鉴别试验鉴别试验鉴别试验几种生物技术药物检验项目表几种生物技术药物检验项目表重组人生长激素原液重组人生长激素原液重组人生长激素粉针剂重组人生长激素粉针剂 外观性状外观性状 外观性状外观性状 含量及高分子蛋白含量及高分子蛋白4.0%4.0%PH PH值值6.56.58.58.5 总相关蛋白含量总相关蛋白含量10.0%10.0%总相关蛋白含量总相关蛋白含量13.0%13.0%无菌试验无菌试验 无菌试验无菌试验 泳迁移率泳迁移率 电泳迁移率电泳迁移率 肽肽 图图 水分水分3.0%3.0%细菌内毒素含量细菌内毒素含量5Eu/mg5Eu/mg 细菌内毒素含量细菌内毒素含量5Eu/mg5Eu/mg 含量及高分子蛋白含量含量及高分子蛋白含量90.0%90.0%110.0%110.0%；高分子蛋白；高分子蛋白6.0%6.0%谢谢大家！