生物技术制药课件

生物技术制药生物技术制药BiotechnologicalPharmaceutics一、课程内容一、课程内容第一章第一章 绪论绪论第二章第二章 基因工程制药基因工程制药第三章第三章 动物细胞工程制药动物细胞工程制药第四章第四章 抗体制药抗体制药第五章第五章 植物细胞工程制药植物细胞工程制药第六章第六章 酶工程制药酶工程制药第七章第七章 发酵工程制药发酵工程制药 Chapter1绪绪论论第一节第一节生物技术的开展史生物技术的开展史一、生物技术一、生物技术biotechnology生物技术：以生命科学为根底，利用生物体或生物生物技术：以生命科学为根底，利用生物体或生物组织、细胞及其组分的特性和功能，设计构建具有组织、细胞及其组分的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系，并与工程相结合，利用预期性状的新物种或新品系，并与工程相结合，利用这样的新物种或品系进展加工生产，为社会提供这样的新物种或品系进展加工生产，为社会提供商品和效劳的一个综合性的技术体系。商品和效劳的一个综合性的技术体系。包括包括 基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、生化工程以及后来衍生出来的第二代、第三代的蛋白生化工程以及后来衍生出来的第二代、第三代的蛋白质工程、抗体工程、糖链工程和海洋生物技术等。质工程、抗体工程、糖链工程和海洋生物技术等。不可取代性育种、制药不可取代性育种、制药快速、准确单克隆抗体检测妊娠快速、准确单克隆抗体检测妊娠低耗、高效生物酶催化：化学催化低耗、高效生物酶催化：化学催化副产物少、副作用小、平安性好副产物少、副作用小、平安性好高附加值性高附加值性符合生态型的经济技术开展体系符合生态型的经济技术开展体系生物技术的优越性生物技术的优越性现代生物技术的根底学科和分支现代生物技术的根底学科和分支分子生物学分子生物学 微生物学微生物学生物化学生物化学遗传学遗传学细胞生物学细胞生物学化学工程化学工程现现代代生生物物技技术术医药生物技术医药生物技术生物技术疫苗生物技术疫苗生物技术诊断生物技术诊断农业生物技术农业生物技术家畜生物技术家畜生物技术海洋生物技术海洋生物技术二、生物技术开展简史二、生物技术开展简史传统生物技术的技术特征是酿造技术传统生物技术的技术特征是酿造技术公元前公元前60006000年古代巴比伦人酿造啤酒年古代巴比伦人酿造啤酒公元前公元前40004000年埃及人发酵面包年埃及人发酵面包我国我国 殷朝殷朝 制酱制酱周朝周朝 制醋制醋特点特点:自然发酵、全凭经历自然发酵、全凭经历传统生物技术阶段传统生物技术阶段近代生物技术的技术特征是微生物发酵近代生物技术的技术特征是微生物发酵技术技术16741674年荷兰布商列文虎克自制了高倍显年荷兰布商列文虎克自制了高倍显微镜微镜(300(300倍左右倍左右)观察到了微生物。观察到了微生物。18651865年法国科学家巴斯德证明了发酵原年法国科学家巴斯德证明了发酵原理。理。19281928年英国年英国 Fleming Fleming发现青霉素发现青霉素19401940年英国弗洛里、钱恩别离出青霉素年英国弗洛里、钱恩别离出青霉素近代生物技术阶段近代生物技术阶段近代生物技术时期的特点：近代生物技术时期的特点：1.1.产品类型多产品类型多 初级氨基酸、酶、有机酸；次级初级氨基酸、酶、有机酸；次级抗生素；生物转化甾体抗生素；生物转化甾体 等；等；2.2.生物技术要求高纯种、无菌、通气、产品质量要生物技术要求高纯种、无菌、通气、产品质量要求也高；求也高；3.3.生产设备规模巨大生产设备规模巨大 500 500立方米，立方米，20002000立方米立方米 ；4.4.技术开展速度快。技术开展速度快。青霉素初期发酵效价为青霉素初期发酵效价为200 U/ml,200 U/ml,现在为现在为80000 80000 U/mlU/ml。现代生物技术的技术特征就是以基因工程为首要标志现代生物技术的技术特征就是以基因工程为首要标志19531953年年 Watson Watson、CrickCrick提出提出DNADNA双螺旋构造双螺旋构造19731973年年 建立建立DNADNA重组技术重组技术Boyer&CohenBoyer&Cohen，美国，美国19751975年年 建立单克隆抗体技术杂交瘤细胞建立单克隆抗体技术杂交瘤细胞19781978年年 大肠杆菌表达出胰岛素大肠杆菌表达出胰岛素19971997年年 英国克隆多利羊英国克隆多利羊现代生物技术现代生物技术现代生物技术包括现代生物技术包括:重组重组DNADNA技术技术 细胞和原生质体融合技术细胞和原生质体融合技术 酶和细胞的固定化技术酶和细胞的固定化技术 植物脱毒和快速繁殖技术植物脱毒和快速繁殖技术 动物和植物细胞的大量培养技术动物和植物细胞的大量培养技术 动物胚胎工程技术动物胚胎工程技术 现代生物反响工程和别离工程技术现代生物反响工程和别离工程技术 蛋白质工程技术蛋白质工程技术 海洋生物技术海洋生物技术 现代微生物发酵技术现代微生物发酵技术 不能忘记的人不能忘记的人JDWatsonFHCCrick19531953年年4 4月月2525日，英国日，英国?自然自然?杂志发表了沃杂志发表了沃森和克立克的文章森和克立克的文章“核酸的分子构造核酸的分子构造 DNADNA的一个构造模型。的一个构造模型。标志着标志着DNADNA双螺旋构造双螺旋构造的建立，从此，遗传的建立，从此，遗传学和生物学的历史从学和生物学的历史从细胞阶段进入了分子细胞阶段进入了分子阶段。阶段。不能忘记的人不能忘记的人F Sanger W Gilbert Sanger Sanger 英国化学家英国化学家最早测定胰岛素的氨最早测定胰岛素的氨基酸顺序获得基酸顺序获得19581958年诺年诺贝尔化奖。贝尔化奖。2222年后，他年后，他因测定了一种噬菌体的因测定了一种噬菌体的一级构造获一级构造获19801980年的诺年的诺贝尔化学奖。贝尔化学奖。Gilbert Gilbert 在在DNADNA测测序领域，因其卓越的工序领域，因其卓越的工作获得作获得19801980年诺贝尔化年诺贝尔化学奖。学奖。不能忘记的人 Paul Berg Berg Berg 美国生物化美国生物化学家通过把两个不学家通过把两个不同来源的同来源的DNADNA连结在一连结在一起并发挥其应有的生起并发挥其应有的生物学功能，证明了完物学功能，证明了完全可以在体外对基因全可以在体外对基因进展操作。他作为进展操作。他作为“重组重组DNADNA技术之父于技术之父于19801980年获诺贝尔化奖。年获诺贝尔化奖。不能忘记的人Kary B Mullis19851985年穆利斯创造了高年穆利斯创造了高效复制效复制DNADNA片段的聚和酶片段的聚和酶链式反响链式反响PCRPCR技术，技术，利用该技术可从极其微利用该技术可从极其微量的样品中大量生产量的样品中大量生产DNADNA分子，使基因工程获得分子，使基因工程获得了革命性开展。了革命性开展。第二节第二节 生物技术药物生物技术药物生物技术制药：生物技术制药：生物技术药物：生物技术药物：生物药物：生物药物：采用现代生物技术，按照人的设采用现代生物技术，按照人的设想，借助动植物微生物来生产所想，借助动植物微生物来生产所需的医药品。需的医药品。一般来说一般来说,采用采用DNADNA重组技术或其重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。酸类药物。生物技术药物、生化药物、微生物生物技术药物、生化药物、微生物药物、海洋药物、生物制品的统称。药物、海洋药物、生物制品的统称。生物技术药物分类生物技术药物分类重组蛋白质药物重组蛋白质药物治疗性抗体药物治疗性抗体药物核酸药物核酸药物干扰素、生长激素、胰岛素、集落刺激干扰素、生长激素、胰岛素、集落刺激因子等因子等PanorexPanorex单抗用于结肠直肠炎治疗单抗用于结肠直肠炎治疗ZenapaxZenapax用于治疗急性肾移植排斥反响用于治疗急性肾移植排斥反响反义核酸、核酶、脱氧核酶、抗基因寡反义核酸、核酶、脱氧核酶、抗基因寡核苷酸、裸核苷酸、裸DNADNA疫苗与基因药物疫苗与基因药物生物技术药物的特性生物技术药物的特性1.1.分子构造复杂分子构造复杂2.2.具有种属特异性具有种属特异性3.3.治疗针对性强、疗效高治疗针对性强、疗效高4.4.稳定性差稳定性差5.5.基因稳定性基因稳定性6.6.免疫原性免疫原性7.7.体内的半衰期短体内的半衰期短8.8.受体效应受体效应9.9.多效性和网络性效应多效性和网络性效应10.10.检验的特殊性检验的特殊性第三节第三节生物技术制药生物技术制药一、生物技术制药的特征一、生物技术制药的特征高技术高技术 高知识层次的人才和高新的技术手段高知识层次的人才和高新的技术手段高投入高投入 一个新的生物医药的平均费用为一个新的生物医药的平均费用为1 13 3亿美元，有的高达亿美元，有的高达6 6亿。亿。高风险高风险 成功率为成功率为5%5%10%10%，研制时间却需，研制时间却需8 81010年。年。高收益高收益 利润率回报可高达利润率回报可高达1010倍倍,上市后上市后2 23 3便可收回投资。便可收回投资。二、生物技术在制药中的应用二、生物技术在制药中的应用1.1.基因工程制药基因工程制药1 1基因工程药物品种的开发基因工程药物品种的开发 生长激素抑制素生长激素抑制素 1 mg 1 mg 传统法：传统法：1010万只万只羊的下丘脑，现：羊的下丘脑，现：10 L10 L大肠杆菌培养液，美大肠杆菌培养液，美元元/mg/mg2 2基因工程疫苗基因工程疫苗3 3基因工程抗体基因工程抗体4 4基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗5应用基因工程技术建立新药的筛选模应用基因工程技术建立新药的筛选模型型6应用基因工程技术改进菌种，产生新应用基因工程技术改进菌种，产生新的微生物药物的微生物药物7基因工程技术在改进药物生产工艺中基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用的应用将血红蛋白基因克隆进菌种后可提高菌将血红蛋白基因克隆进菌种后可提高菌种对缺氧环境的耐受力。种对缺氧环境的耐受力。8利用转基因动、植物生产蛋白质类药利用转基因动、植物生产蛋白质类药物物人体蛋白人体蛋白AAT10万美元万美元/g，转基因羊羊，转基因羊羊奶中奶中20g/L2.2.细胞工程制药细胞工程制药1 1单克隆抗体技术单克隆抗体技术2 2动物细胞培养动物细胞培养3 3植物细胞培养生产次生代谢产物植物细胞培养生产次生代谢产物3.3.酶工程制药酶工程制药4.4.发酵工程制药发酵工程制药工艺改进、新药研制和菌种改造工艺改进、新药研制和菌种改造三、我国生物技术制药现状和开展前景三、我国生物技术制药现状和开展前景开场于开场于2020世纪世纪7070年代初，先是进展固定化酶的研究，以后固年代初，先是进展固定化酶的研究，以后固定化酶和固定化细胞的研究与应用得到开展。定化酶和固定化细胞的研究与应用得到开展。7070年代后期，开场跟踪国外基因工程技术的某些根底性工作。年代后期，开场跟踪国外基因工程技术的某些根底性工作。8080年代初期，开场乙型肝炎基因工程疫苗、基因工程干扰素年代初期，开场乙型肝炎基因工程疫苗、基因工程干扰素的研究，生物技术方面的工程得到了国家的支持，其中的研究，生物技术方面的工程得到了国家的支持，其中-1b-1b型干扰素为我国首创。型干扰素为我国首创。目前我国生物制药技术申报貌似目前我国生物制药技术申报貌似“活泼，实际上都是在活泼，实际上都是在围绕仅有的几个老品种进展改进或改制，完全创新技术很少。围绕仅有的几个老品种进展改进或改制，完全创新技术很少。与兴旺国家相比，我国生物技术实验室技术差距不大，但与兴旺国家相比，我国生物技术实验室技术差距不大，但在产业化方面与世界的差距正在逐渐加大：当今世界有在产业化方面与世界的差距正在逐渐加大：当今世界有2020多多种畅销生物药时，我国能生产种畅销生物药时，我国能生产1010种；而现在世界上有种；而现在世界上有140140多多种时，我国却只能生产种时，我国却只能生产2020多种多种 。由于我国医药生物技术成果缺乏自主知识产权，而目前我由于我国医药生物技术成果缺乏自主知识产权，而目前我国生物制药公司中技术和产业开展比较成熟的也仅有北京天国生物制药公司中技术和产业开展比较成熟的也仅有北京天坛生物、深圳康泰生物、深圳科兴、长春金赛等少数几家企坛生物、深圳康泰生物、深圳科兴、长春金赛等少数几家企业，产业规模较小；而一些传统型的制药企业由于受技术条业，产业规模较小；而一些传统型的制药企业由于受技术条件等影响而难以迅速进入生物制药领域。件等影响而难以迅速进入生物制药领域。医药生物技术开展展望医药生物技术开展展望 21世纪是医药生物技术快速开展的时期,生物制药、化学药物、中药形成三足鼎立,有效的为人类安康效劳。1.利用新发现的人类基因开发新型药物。人类基因组方案已完成。1986年美国科学家达尔贝科提出的人类基因组方案，1990年启动该方案。23对染色体30亿对碱基，万个基因进展测序。美国承担54%，英33%，日7%，法2.8%,德2.2%,中国1%。1999年中国参加人类基因组方案，投资3亿元，负责测定3号染色体3000万对碱基，2000年4月完成。2.新型疫苗的研制 艾滋病疫苗和基因型癌疫苗等。3.基因工程活性肽的生产 基因药物:淋巴因子、生长因子、激素和酶 4.其它医药业将得到不断改造和开展 转基因药材利用转基因的烟草来生产人造血浆将成为现实5.5.新型生物反响器和新型生物技术不断出现新型生物反响器和新型生物技术不断出现新型生物反响器有:气升式生物反响器流化床式生物反响器固定床式生物反响器袋式或膜式生物反响器中空纤维生物反响器等。四、我国的医药生物技术四、我国的医药生物技术 已上市的基因工程药物和疫苗已上市的基因工程药物和疫苗 19951995年年 白细胞介素白细胞介素-2-2 1996 1996年年 1b-1b-干扰素干扰素2a-2a-干扰素干扰素 2b-2b-干扰素干扰素 19971997年年 粒细胞集落因子粒细胞集落因子 红细胞生成素红细胞生成素 19921992年年 乙型肝炎疫苗乙型肝炎疫苗作业：作业：1 1、生物技术制药的概念。、生物技术制药的概念。2 2、生物技术药物分为哪些类型？、生物技术药物分为哪些类型？3 3、生物技术制药有哪些特征？、生物技术制药有哪些特征？Chapter 2 基因工程制药基因工程制药用途：用途：主要用于癌症、人类免疫缺陷病毒性疾病、心主要用于癌症、人类免疫缺陷病毒性疾病、心血管疾病、糖尿病、贫血和许多遗传疾病的治疗。血管疾病、糖尿病、贫血和许多遗传疾病的治疗。获取方式：获取方式：生化提取生化提取 基因工程表达基因工程表达 本钱高产量低本钱高产量低质量难以保证质量难以保证本钱低产量高本钱低产量高活性强性质优活性强性质优实例：人生长激素侏儒症实例：人生长激素侏儒症50 具新鲜尸体具新鲜尸体脑下垂体中提取脑下垂体中提取采用基因工程从采用基因工程从 12 升升细菌培养液中提取获得细菌培养液中提取获得=1982 1982 年世界上第一个基因工程药物年世界上第一个基因工程药物 重组人胰岛素获准生重组人胰岛素获准生产销售，至今已有产销售，至今已有 100 100 多个生物技术药物上市多个生物技术药物上市;促红细胞生成素促红细胞生成素EPOEPO以全球销售额以全球销售额 38 38 亿美元的业绩，居亿美元的业绩，居全球最畅销全球最畅销 10 10 种药物的第种药物的第6 6名；名；美国是现代生物技术的发源地，一直稳居生物技术药物研发榜美国是现代生物技术的发源地，一直稳居生物技术药物研发榜首首,其其 2002 2002 年产值和销售额已超过年产值和销售额已超过 200 200 亿美元亿美元;1989 1989 年我国第一个拥有自主知识产权的基因工程药物年我国第一个拥有自主知识产权的基因工程药物 -重重组人干扰素组人干扰素IFN1bIFN1b上市以来，目前，世界上销售额排前上市以来，目前，世界上销售额排前 10 10 位的生物技术药物我国已能生产位的生物技术药物我国已能生产 8 8 种。种。国际生物医药产业开展动态国际生物医药产业开展动态第一节第一节概概述述生物技术的核心就是基因工程，生物技术的核心就是基因工程，2020世纪世纪7070年代基因年代基因工程诞生工程诞生,最先应用在医药科学领域。最先应用在医药科学领域。传统生物药物由于来源及制备上的困难、价格等因传统生物药物由于来源及制备上的困难、价格等因素的影响，此外在制备过程可能受到的病毒、衣原素的影响，此外在制备过程可能受到的病毒、衣原体、支原体等的感染等问题，促使人们寻求平安、体、支原体等的感染等问题，促使人们寻求平安、实用、疗效可靠的新方法来制备生物药物。实用、疗效可靠的新方法来制备生物药物。如：生长激素抑制素如：生长激素抑制素 1 mg 1 mg 传统法：传统法：1010万只羊的万只羊的下丘脑，现：下丘脑，现：10 L10 L大肠杆菌培养液，美元大肠杆菌培养液，美元/mg/mg；尿激；尿激酶从男性尿中提取；胎盘丙种球蛋白从胎盘中提取。酶从男性尿中提取；胎盘丙种球蛋白从胎盘中提取。应用基因工程技术可十分方便且有效地解决传统生物制药所遇到的问题，从量、质上都可以得到改进，且可以创造全新物质。如今，癌症、病毒性疾病、心血管疾病以及内分泌等方面的预防、治疗和诊断已可通过基因工程技术获得。利用基因工程技术生产药品的优点：利用基因工程技术生产药品的优点：1 1可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽如胰岛素、干扰素、细胞因子等，为临床使用提肽如胰岛素、干扰素、细胞因子等，为临床使用提供有效的保障；供有效的保障；2 2可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和构造进展深入的研究，从而扩大这些物质的理、生化和构造进展深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；应用范围；3 3利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；生理活性物质；4 4内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的缺乏之处，可通过基因工程和蛋白质工程进展改造和缺乏之处，可通过基因工程和蛋白质工程进展改造和去除。如白细胞介素去除。如白细胞介素-2-2的半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨的半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸，白细胞介素酸，白细胞介素-2-2的活性以及热稳定性均有提高；的活性以及热稳定性均有提高；5 5利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。物筛选来源。利用基因工程技术生产药品的优点：利用基因工程技术生产药品的优点：第二节第二节基因工程药物生产的过程基因工程药物生产的过程 基因工程技术是将所要重组对象的基因工程技术是将所要重组对象的目的基因插入载体、拼接、转入新的目的基因插入载体、拼接、转入新的宿主细胞，构建成工程菌宿主细胞，构建成工程菌(或细胞，或细胞，实现遗传物质的重新组合，并使目的实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌基因在工程菌(或细胞，内进展复制或细胞，内进展复制和表达的技术。和表达的技术。基因工程药物生产的上游和下游基因工程药物生产的上游和下游上游阶段：主要指的是目的基因别离、工程菌上游阶段：主要指的是目的基因别离、工程菌或细胞构建。上游阶段的工作主要在实验室内或细胞构建。上游阶段的工作主要在实验室内完成；完成；下游阶段：主要指的是从工程菌或细胞的大下游阶段：主要指的是从工程菌或细胞的大规模培养一直到产品的别离纯化、质量控制等。规模培养一直到产品的别离纯化、质量控制等。获得目的基因获得目的基因组建重组质粒组建重组质粒培养工程菌培养工程菌构建基因工程构建基因工程菌或细胞菌或细胞产物别离纯化产物别离纯化除菌过滤除菌过滤半成品检定半成品检定包装包装成品检定成品检定基因工程药物制备的一般过程基因工程药物制备的一般过程基因工程根本过程基因工程根本过程切接转增检工程菌或细胞构建中重要的工具工程菌或细胞构建中重要的工具工具：酶工具：酶限制性内切酶限制性内切酶连接酶连接酶逆转录酶逆转录酶Klenow Klenow 酶大片段酶大片段DNADNA聚合酶聚合酶 I I核酸酶核酸酶S1S1第三节第三节目的基因的获得目的基因的获得 克隆真核基因常用方法：逆转录法和克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法。不能直接别离？化学合成法。不能直接别离？一、逆转录法一、逆转录法逆转录法就是先别离纯化目的基因的逆转录法就是先别离纯化目的基因的mRNAmRNA，再反转录成，再反转录成 cDNA cDNA，然后进展，然后进展 cDNA cDNA 的的克隆表达。克隆表达。cDNAcDNA与模板与模板mRNAmRNA序列严格互补，而不含内序列严格互补，而不含内含子。含子。逆转录法的步骤逆转录法的步骤 1 1、mRNAmRNA的纯化的纯化 2 2、cDNAcDNA第一链的合成第一链的合成 3 3、cDNAcDNA第二链的合成第二链的合成 4 4、cDNAcDNA克隆克隆 5 5、将重组体导入宿主细胞、将重组体导入宿主细胞 6 6、cDNAcDNA文库的鉴定文库的鉴定 7 7、目的、目的cDNAcDNA克隆的别离和鉴定克隆的别离和鉴定cDNA克隆示意图克隆示意图mRNA逆转录酶ss-DNADNA聚合酶IKlenow片段ds-cDNAds-cDNA核酸酶S11 1、mRNAmRNA的纯化的纯化真核细胞mRNA3-polyA20250)采用OligodT-纤维素，以亲和层析法将mRNA从细胞总RNA中别离出来。2 2、cDNAcDNA第一链的合成第一链的合成 可用寡聚可用寡聚dTdT作为引物，在逆转录酶的催化下，开作为引物，在逆转录酶的催化下，开场场cDNAcDNA链的合成。链的合成。3 3、cDNAcDNA第二链的合成第二链的合成除去除去cDNA-mRNAcDNA-mRNA杂交链中的杂交链中的mRNAmRNA链链(碱解或碱解或RNaseHRNaseH酶解酶解)然后以然后以cDNAcDNA第一链为模板合成第二链。由于第一链第一链为模板合成第二链。由于第一链cDNAcDNA链链3-3-末端往往形成一个发夹形构造，所以，可以从这末端往往形成一个发夹形构造，所以，可以从这一点开场合成一点开场合成cDNAcDNA第二链第二链(常用常用KlenowKlenow酶或酶或DNADNA聚合酶聚合酶I)I)切除发夹构造核酸酶切除发夹构造核酸酶S1S1，专一性切除单链，专一性切除单链DNADNA4 4、cDNAcDNA克隆克隆用于用于cDNAcDNA克隆的载体有三类：克隆的载体有三类：细菌质粒如细菌质粒如pBR322pBR322、pUC pUC等插入片段等插入片段10kb10kb 10kb 动植物病毒动植物病毒 根据重组后插入的根据重组后插入的cDNAcDNA能否经转录和翻译合成蛋白质能否经转录和翻译合成蛋白质 非表达型载体非表达型载体pBR322pBR322及及 gt10 gt10 表达型载体表达型载体pUCpUC及及 gt11 gt11 有利于目的基因的筛选有利于目的基因的筛选 5 5、将重组体导入宿主细胞、将重组体导入宿主细胞1 1、转化：、转化：指质粒指质粒DNA DNA 或以它为载体构建的重组或以它为载体构建的重组DNA DNA 导入导入细菌的过程。细菌的过程。2 2、转染、转染：指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。胞的过程。脂质体介导：脂质体介导：原生质体融合：原生质体融合：电穿孔：电穿孔：显微注射：显微注射：基因枪：基因枪：病毒介导：病毒介导：农杆菌转染：农杆菌转染：6 6、cDNAcDNA文库的鉴定文库的鉴定1 1、表型改变：、表型改变：抗生素抗性抗性基因失活和菌落或噬菌斑颜抗生素抗性抗性基因失活和菌落或噬菌斑颜色改变色改变 a a互补：互补：报告基因：报告基因：缺陷恢复：缺陷恢复：2 2、构造特征：、构造特征：DNA DNA大小：大小：酶切图谱：酶切图谱：杂交核酸、蛋白：杂交核酸、蛋白：PCR PCR检测：检测：DNA DNA序列分析序列分析3 3、免疫化学检测：表达产物分析、免疫化学检测：表达产物分析7 7、目的、目的cDNAcDNA克隆的别离和鉴定克隆的别离和鉴定从从cDNAcDNA文库中别离特异的文库中别离特异的cDNAcDNA克隆，主要采用：克隆，主要采用：1 1核酸探针杂交法。核酸探针杂交法。根据目的蛋白质的氨基酸序列，人工合成相应的单链根据目的蛋白质的氨基酸序列，人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，从寡核苷酸作为探针，从cDNAcDNA文库中别离特异文库中别离特异cDNAcDNA克隆。克隆。2 2免疫反响鉴定法。免疫反响鉴定法。用表达型载体构建的用表达型载体构建的cDNAcDNA文库，可用免疫学方法分组文库，可用免疫学方法分组逐一鉴定各逐一鉴定各cDNAcDNA的表达产物，即以某种蛋白质的抗体寻的表达产物，即以某种蛋白质的抗体寻找相应的特异找相应的特异cDNAcDNA克隆。克隆。别离得到含有目的基因的阳性克隆后，必须对其作别离得到含有目的基因的阳性克隆后，必须对其作进一步的验证和鉴定限制酶图谱、基因测序等。进一步的验证和鉴定限制酶图谱、基因测序等。不需合成第二链不需合成第二链mRNA逆转录酶ss-DNAPCR特异引物目的cDNA链19851985，PCRPCR创造以后，创造以后，RT-PCRRT-PCR得到了广泛的应用。得到了广泛的应用。二、逆转录聚合酶链反响法二、逆转录聚合酶链反响法 RT-PCR RT-PCR 三、化学合成法三、化学合成法较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成法合成。法合成。必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的氨基酸顺序。氨基酸顺序。人工化学合成的限制：一不能合成太长的基因，人工化学合成的限制：一不能合成太长的基因，505060bp60bp；二是人工合成时，遗传密码的简并性；二是人工合成时，遗传密码的简并性可导致中性突变可导致中性突变；三是费用较高。；三是费用较高。第四节第四节基因表达基因表达 基因表达：是指构造基因在生物体中的转录、翻译基因表达：是指构造基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。以及所有加工过程。基因高效表达：将外源基因片段拼接到另一个基因基因高效表达：将外源基因片段拼接到另一个基因表达体系中，使即获得原生物活性又可高产的表达产表达体系中，使即获得原生物活性又可高产的表达产物。物。最正确的基因表达体系：生物活性高、表达产量高、最正确的基因表达体系：生物活性高、表达产量高、表达产物稳定、表达产物容易别离纯化。表达产物稳定、表达产物容易别离纯化。一、宿主细胞的选择一、宿主细胞的选择 1 1、培养容易、生长快速：、培养容易、生长快速：2 2、容易获得较高浓度的细胞：、容易获得较高浓度的细胞：3 3、能利用易得廉价原料：、能利用易得廉价原料：4 4、不致病、不产生内毒素：、不致病、不产生内毒素：5 5、发热量低、需氧低、适当的发酵温度：、发热量低、需氧低、适当的发酵温度：6 6、容易进展、容易进展DNADNA重组技术操作：重组技术操作：7 7、产物的产量、产率高：、产物的产量、产率高：8 8、产物容易提取纯化：、产物容易提取纯化：宿主细胞常用两大类：宿主细胞常用两大类：原核细胞原核细胞：常用有：常用有大肠杆菌大肠杆菌、枯草、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；芽胞杆菌、链霉菌等；真核细胞真核细胞：常用有：常用有酵母酵母、丝状真菌、丝状真菌、哺乳动物细胞等。哺乳动物细胞等。原核细胞原核细胞 大肠杆菌：基因工程研究中采用最多的原核表达体系。大肠杆菌：基因工程研究中采用最多的原核表达体系。优点：生长快速、代谢简单、遗传体系清楚、容易操优点：生长快速、代谢简单、遗传体系清楚、容易操作、细胞破碎容易。作、细胞破碎容易。缺点：缺点：不存在导向内质网的信号序列，分泌能力不存在导向内质网的信号序列，分泌能力缺乏，产品多为胞内产物，提取困难；缺乏，产品多为胞内产物，提取困难；蛋白表达后蛋白表达后不能修饰加工糖基化等；不能修饰加工糖基化等；产物蛋白质产物蛋白质N N端多余端多余一个蛋氨酸残基，能引起免疫反响；一个蛋氨酸残基，能引起免疫反响；内毒素存留。内毒素存留。枯草芽胞杆菌：枯草芽胞杆菌：分泌能力强，蛋白质不形成包含体。产物蛋分泌能力强，蛋白质不形成包含体。产物蛋白质不能糖基化。有很强的胞外蛋白酶对产白质不能糖基化。有很强的胞外蛋白酶对产物降解。物降解。链霉菌：链霉菌：作为外源性基因表达受到重视。不致病、使作为外源性基因表达受到重视。不致病、使用平安、分泌能力强、表达产物可糖基化。用平安、分泌能力强、表达产物可糖基化。真核细胞真核细胞酵母酵母是研究基因表达最有效的是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能外分形式，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达。基因成功表达。丝状真菌丝状真菌 优点：分泌能力强，能正确进展翻译后加工肽优点：分泌能力强，能正确进展翻译后加工肽剪切、糖基化有成熟的发酵和后处理工艺。剪切、糖基化有成熟的发酵和后处理工艺。哺乳动物细胞哺乳动物细胞 优点：表达产物可由重组转化细胞分泌到培养液优点：表达产物可由重组转化细胞分泌到培养液中，纯化容易。产物是糖基化的接近天然物。中，纯化容易。产物是糖基化的接近天然物。缺点：生长慢，生产率低，培养条件苛刻，费用缺点：生长慢，生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度稀。高，培养液浓度稀。二、大肠杆菌体系中的基因表达二、大肠杆菌体系中的基因表达一表达载体一表达载体表达载体必须具备的条件表达载体必须具备的条件1 1载体能独立地进展复制载体能独立地进展复制(复制起点，复制起点，ori)ori)2 2应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆、鉴定和筛选，且克隆以利于外源基因的克隆、鉴定和筛选，且克隆位点位于启动子序列后，以便外源基因表达。位点位于启动子序列后，以便外源基因表达。3 3应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNARNA聚合酶所识别。聚合酶所识别。4 4应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才进展转录。导时才进展转录。外源基因的高效表达往往会抑制宿主细胞的生外源基因的高效表达往往会抑制宿主细胞的生长、增殖，而阻遏子可使宿主细胞免除此不良影响长、增殖，而阻遏子可使宿主细胞免除此不良影响5 5应具有很强的终止子，以便使应具有很强的终止子，以便使RNARNA聚合酶集中聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，同时，很强的终止子所产生的因，同时，很强的终止子所产生的mRNAmRNA较为稳定。较为稳定。6 6所产生的所产生的mRNAmRNA必须具有翻译的起始信号，即起必须具有翻译的起始信号，即起始密码始密码AUGAUG和和SDSD序列序列,以便转录后能顺利翻译。以便转录后能顺利翻译。如：在大肠杆菌中表达非融合蛋白的操纵子如：在大肠杆菌中表达非融合蛋白的操纵子必须改建成：细菌启动子必须改建成：细菌启动子 细菌细菌SDSD序列序列 起始起始密码子密码子 构造基因构造基因 终止子。终止子。常用表达载体常用表达载体pBV220系统系统启动子启动子多克隆位点多克隆位点终止子终止子阻遏子阻遏子P23复制起始位点复制起始位点它已成功它已成功地表达了地表达了人白人白细胞介素细胞介素2，干扰素干扰素和和肿瘤肿瘤坏死因子坏死因子等外等外源基因。源基因。氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因限制性内切酶限制性内切酶SD序列序列pBV220pBV220系统国内使用最多的载体系统国内使用最多的载体,其组成其组成:来源于来源于pUC8pUC8多克隆位点多克隆位点 核糖体核糖体rrnBrrnB基因基因终止信号终止信号 pBR322pBR322第第4225422537353735位位 pUC18pUC18第第20662066680680位位 噬菌体噬菌体cIts857cIts857阻遏子基因阻遏子基因及及P PR R启动子启动子 pRC23pRC23的的P PL L启动子启动子及及SDSD序列序列 pBV220 pBV220系统优点：系统优点：cIts857 cIts857阻遏子基因与阻遏子基因与PLPL启动子同在一启动子同在一个载体上，可以转化任何菌株，以便选用个载体上，可以转化任何菌株，以便选用蛋白酶活性较低的宿主细胞，使表达产物蛋白酶活性较低的宿主细胞，使表达产物不易降解。不易降解。SD SD序列紧跟多克隆位点，便于插入带起序列紧跟多克隆位点，便于插入带起始始ATGATG的外源基因，可表达非融合蛋白；的外源基因，可表达非融合蛋白；强的转录终止信号可防止出现强的转录终止信号可防止出现“通读通读现象，有利于质粒现象，有利于质粒-宿主系统的稳定；宿主系统的稳定；整个质粒仅为，有利于增加其拷贝数及容整个质粒仅为，有利于增加其拷贝数及容量，可以插入大片段外源基因；量，可以插入大片段外源基因；PR和和PL启动子串联，可以增强启动作用；启动子串联，可以增强启动作用；本系统为温度诱导，外源基因表达量本系统为温度诱导，外源基因表达量可达细胞总蛋白的可达细胞总蛋白的20%20%30%30%；产物以包含；产物以包含体形式存在不易降解均一性好。体形式存在不易降解均一性好。PR和和PL启动子启动子 选用温度敏感突变体选用温度敏感突变体 cIts857 cIts857 的基因产物来的基因产物来调控调控 PL PL、PR PR 启动子的转录。启动子的转录。在较低温度在较低温度3030时以活性形式存在时以活性形式存在 在较高温度在较高温度4242时失活脱落时失活脱落PL、PRcIts857PL PL 和和 PR PR 表达系统存在的问题表达系统存在的问题 PL PL 和和 PR PR 表达系统诱导时不加化学诱导剂，表达系统诱导时不加化学诱导剂，本钱又低廉。本钱又低廉。缺陷缺陷1.1.在热脉冲诱导过程中，大肠杆菌热休克蛋白在热脉冲诱导过程中，大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激活，其中一些是蛋白水解酶，的表达也会被激活，其中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表达的重组蛋白。有可能降解所表达的重组蛋白。2.2.在大体积发酵培养菌体时，通过热平衡交换在大体积发酵培养菌体时，通过热平衡交换方式把培养温度从方式把培养温度从3030提高到提高到42 42 需要较长的需要较长的时间，这种缓慢的升温方式影响诱导效果，对时间，这种缓慢的升温方式影响诱导效果，对重组蛋白表达量有一定的影响。重组蛋白表达量有一定的影响。3.pBV2203.pBV220系统表达的外源蛋白以包含体的形式存在，不易纯化。系统表达的外源蛋白以包含体的形式存在，不易纯化。pBG-2 pBG-2是由是由pBV220pBV220系统衍生的便于产物纯化的系统衍生的便于产物纯化的融合表达载体。融合表达载体。该质粒在该质粒在PRPLPRPL启动子下游插入启动子下游插入G G蛋白中与蛋白中与IgG IgG FcFc段结合的构造域基因片段段结合的构造域基因片段180180个核苷酸，下游是个核苷酸，下游是多克隆位点，引入了剪切融合蛋白的切点，具有与多克隆位点，引入了剪切融合蛋白的切点，具有与IgGIgG结合的活性，可用亲和层析。简化下游工艺。结合的活性，可用亲和层析。简化下游工艺。pBG-2二影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素二影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素外源基因表达产量外源基因表达产量与与细胞浓度细胞浓度和和单个细胞平均表达产单个细胞平均表达产量量呈正相关。单个细胞产量取决于：呈正相关。单个细胞产量取决于：外源基因的拷贝数外源基因的拷贝数质粒的扩增质粒的扩增过程通常发生在过程通常发生在受体细胞的对数生长期内受体细胞的对数生长期内，而此，而此时正是时正是细菌生理代谢细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降下降解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控可控制制的轨道的轨道 外源基因的表达效率外源基因的表达效率外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子转录转录翻译翻译启动子和终止子的强弱；启动子和终止子的强弱；大肠杆菌高效表达需要强的启动子和终止子。大肠杆菌高效表达需要强的启动子和终止子。外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑聚合酶滑过终止子构造继续转录质粒上邻近的过终止子构造继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的序列，形成长短不一的mRNA混合物混合物过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达。过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊构对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊构造，以增强其转录终止作用。造，以增强其转录终止作用。外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与而且在很大程度上还与 mRNA mRNA 的翻译起始效率密切相关。的翻译起始效率密切相关。mRNA mRNA 翻译的起始效率主要由其翻译的起始效率主要由其 5 5 端的构造序列消除二级构造端的构造序列消除二级构造所决定，称为核糖体结合位点所决定，称为核糖体结合位点RBSRBS。核糖体结合位点的有效性核糖体结合位点的有效性 SD SD 序列与翻译起始密码子之间的距离序列与翻译起始密码子之间的距离 SD SD序列与起始密码子序列与起始密码子AUGAUG之间的准确距离保证了之间的准确距离保证了mRNAmRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子在核糖体上定位后，翻译起始密码子 AUG AUG 正好处于核正好处于核糖体复合物构造中的糖体复合物构造中的 P P 位，这是翻译启动的前提条件。在位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，很多情况下，SD SD 序列位于序列位于 AUG AUG 之前大约七个碱基处，在此之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低。同程度的降低。由由于于原原核核生生物物和和真真核核生生物物基基因因组组中中密密码码子子的的使使用用频频率率具具有有较较大大程程大大的的差差异异性性，因因此此外外源源基基因因尤尤其其是是高高等等哺哺乳乳动动物物基基因因在在大大肠肠杆杆菌菌中中高高效效翻翻译译的的一一个个重重要要因因素素是是密密码码子子的的正正确确选选择。择。一一般般而而言言，有有两两种种策策略略可可以以使使外外源源基基因因上上的的密密码码子子在在大大肠杆菌细胞中获得最正确表达：肠杆菌细胞中获得最正确表达：外源基因全合成外源基因全合成 同步表达相关同步表达相关 tRNA tRNA 编码基因编码基因密码子组成密码子组成生物体对密码子的偏爱性生物体对密码子的偏爱性 表达产物的稳定性表达产物的稳定性 组建融合蛋白；组建融合蛋白；利用大肠杆菌的信号肽或真核多肽中自身的信号肽；利用大肠杆菌的信号肽或真核多肽中自身的信号肽；采用位点突变的方法；采用位点突变的方法；选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞，可能会减弱选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞，可能会减弱表达产物的降解。表达产物的降解。细胞代谢负荷细胞代谢负荷宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开细胞的生长和外源基因的表达分成两个阶段细胞的生长和外源基因的表达分成两个阶段工程菌的培养条件工程菌的培养条件除宿主、载体和克隆基因三者之间的关系影除宿主、载体和克隆基因三者之间的关系影响外源基因的高水平表达外，培养条件亦是非响外源基因的高水平表达外，培养条件亦是非常值得研究的因素。以后会对其进展详细的介常值得研究的因素。以后会对其进展详细的介绍。绍。三真核基因在大肠杆菌中的表达形式三真核基因在大肠杆菌中的表达形式以以融合蛋白融合蛋白的形式表达药物基因的形式表达药物基因以以原核多肽原核多肽和和真核蛋白真核蛋白结合在一起称融合蛋白。结合在一起称融合蛋白。优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，易实优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，易实现高效表达；现高效表达；缺点：只能作抗原用。缺点：只能作抗原用。以以非融合蛋白非融合蛋白的形式表达药物基因的形式表达药物基因非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的质以真核蛋白的mRNA的的AUG为起始，在为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。其氨基端不含细菌多肽序列。优点优点：保持原有蛋白活性；：保持原有蛋白活性；缺点缺点：易被蛋白酶破坏。：易被蛋白酶破坏。分泌型表达蛋白药物基因分泌型表达蛋白药物基因优点优点：在周质中稳定，有活性，不含蛋：在周质中稳定，有活性，不含蛋氨酸残基；氨酸残基；缺点缺点：产量不高，：产量不高，信号肽不被切割。信号肽不被切割。三、酵母中的基因表达三、酵母中的基因表达一表达载体一表达载体 酵母载体是可以携带外源基因在酵母细胞内酵母载体是可以携带外源基因在酵母细胞内保存和复制，并随酵母分裂传递到子代细胞的保存和复制，并随酵母分裂传递到子代细胞的DNADNA或或RNARNA单位。单位。1.1.载体的复制序列载体的复制序列 酵母附加体质粒酵母附加体质粒yeast episomal plasmidyeast episomal plasmid，Yep Yep类类 酵母复制型质粒酵母复制型质粒yeast replication plasmidyeast replication plasmid，YppYpp类类酵母着丝粒质粒酵母着丝粒质粒yeast centromeric plasmidyeast centromeric plasmid，YCpYCp类类酵母整合型质粒酵母整合型质粒yeast inteegrative plasmidyeast inteegrative plasmid，YIpYIp类类 (1)(1)克隆载体克隆载体 从大肠杆菌中制备质粒比从酵母中容易得多，因此酵母从大肠杆菌中制备质粒比从酵母中容易得多，因此酵母质粒的加工和制备大局部是通过大肠杆菌进展的，只有在最质粒的加工和制备大局部是通过大肠杆菌进展的，只有在最后阶段才转入酵母中，这就要求酵母载体也同时具有在大肠后阶段才转入酵母中，这就要求酵母载体也同时具有在大肠杆菌中复制和增殖的能力。杆菌中复制和增殖的能力。(2)(2)表达载体表达载体 将酵母菌的启动子和终止子等有关控制序列引入载体的将酵母菌的启动子和终止子等有关控制序列引入载体的适当位点后，就构成了酵母菌的表达载体。适当位点后，就构成了酵母菌的表达载体。普通表达载体，只能方便地引入外源基因并进展表达，普通表达载体，只能方便地引入外源基因并进展表达，对表达产物的组成，特别是对其对表达产物的组成，特别是对其N N末端氨基酸是否增减并无末端氨基酸是否增减并无严格要求。严格要求。准确表达载体，要求在启动子或信号肽编码序列的适当准确表达载体，要求在启动子或信号肽编码序列的适当部位有内切酶点，以利于接入外源基因，并使他在表达后部位有内切酶点，以利于接入外源基因，并使他在表达后加工后加工后N N末端氨基酸序列与天然产物一样，既无多余的氨基末端氨基酸序列与天然产物一样，既无多余的氨基酸，也无缺失的氨基酸。酸，也无缺失的氨基酸。影响目的基因在酵母菌中表达的因素影响目的基因在酵母菌中表达的因素外源基因的剂量外源基因的剂量高稳定的高拷贝数的质粒可使外源基因高效表达，高稳定的高拷贝数的质粒可使外源基因高效表达，但高拷贝数通常会引起细胞生长量的降低；而单拷贝但高拷贝数通常会引起细胞生长量的降低；而单拷贝数的质粒对细胞的最大生长没有影响，因而也能到达数的质粒对细胞的最大生长没有影响，因而也能到达高效表达。高效表达。外源基因的表达效率外源基因的表达效率启动子启动子(组成型和诱导型组成型和诱导型)分泌信号的效率分泌信号的效率终止序列的影响终止序列的影响 外源基因表达产量与细胞浓度和单个细胞平均表达产量呈正外源基因表达产量与细胞浓度和单个细胞平均表达产量呈正相关。单个细胞产量取决于：相关。单个细胞产量取决于：外源蛋白的糖基化外源蛋白的糖基化外源蛋白经酿酒酵母糖基化后，可靠有效地以活外源蛋白经酿酒酵母糖基化后，可靠有效地以活性型分泌到培养基中；某些蛋白质糖基化后更加稳性型分泌到培养基中；某些蛋白质糖基化后更加稳定，便于别离精制。定，便于别离精制。宿主菌株的影响宿主菌株的影响菌体生长力强菌体生长力强菌体内源蛋白酶要较弱菌体内源蛋白酶要较弱菌体性能稳定菌体性能稳定常用的几乎是突变株，防止使用回复突变率高常用的几乎是突变株，防止使用回复突变率高的不稳定体系；最好使用二倍体或多倍体菌株；的不稳定体系；最好使用二倍体或多倍体菌株；分泌能力强分泌能力强(5)培养条件培养条件四、动物中的基因表达四、动物中的基因表达优点：产物类似于天然产物，容易别离纯化缺点：动物细胞生长慢，培养条件苛刻，费用高培养液浓度较小。主要基因工程表达体系比较主要基因工程表达体系比较表达体系表达体系产产 物物 产生部位产生部位 培养方式培养方式 提提 纯纯 产物活性产物活性 潜在危性潜在危性大肠杆菌大肠杆菌 多肽蛋白质多肽蛋白质 菌体内菌体内 容易容易 一般一般 对原核好对原核好 不大不大 融合蛋白质融合蛋白质 部分高产部分高产 对真核差对真核差 酵酵 母母 多肽蛋白质多肽蛋白质 菌体内菌体内 容易容易 菌体内菌体内 真核的接近真核的接近 不大不大 糖基化蛋白糖基化蛋白 外分泌外分泌 可高产可高产 稍复杂稍复杂 天然产物天然产物 哺乳动物哺乳动物 完完 整整 外分泌外分泌 较难成本高较难成本高 简单简单 可达天然可达天然 需注意需注意 糖基化蛋白糖基化蛋白 可高产可高产 产物产物 致癌致癌第五节第五节 基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点 菌体的生长通常用菌体的生长通常用比生长速率比生长速率来表示。来表示。比生长速率比生长速率:菌体生长速率与培养基中菌体浓度之比。菌体生长速率与培养基中菌体浓度之比。工程菌培养可通过选用工程菌培养可通过选用不同的碳源不同的碳源、控制补料控制补料和和稀稀释速率释速率等方法来控制菌体的生长。等方法来控制菌体的生长。控制菌体的生长对控制菌体的生长对提高质粒的稳定性提高质粒的稳定性、减少代谢副减少代谢副产物积累产物积累、提高外源蛋白产率提高外源蛋白产率有重要意义。有重要意义。大肠杆菌的蛋白大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是根本菌体量的比值是根本恒定的，因而菌体的生长速度反映了蛋白恒定的，因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度。质的合成速度。培养条件的改变，都会改变菌体的能培养条件的改变，都会改变菌体的能量代谢和小分子前体的供给，影响生物大量代谢和小分子前体的供给，影响生物大分子的和成和菌体的生长。分子的和成和菌体的生长。一、菌体的生长与能量的关系一、菌体的生长与能量的关系 碳源物质碳源物质是组成培养基的主要成分。是组成培养基的主要成分。碳源物质碳源物质为为细胞提供能量细胞提供能量，当菌体生，当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量长所需能量大于菌