生物分离工程-第二章-细胞破碎课件

生物工程下游技生物工程下游技术第二章第二章 细胞分离与破碎胞分离与破碎3 3 学学时精品学学习目的和要求目的和要求掌握解掌握解细胞分离胞分离和和目目标产物物的的释放的放的原理原理和方法，熟知各种方法的和方法，熟知各种方法的优缺点缺点和和应用范用范围。精品目目录n一、一、细胞分离胞分离n（一）、重力沉降（一）、重力沉降n（二）、离心沉降（二）、离心沉降n（三）、（三）、过滤n二、二、细胞破碎与胞内物胞破碎与胞内物释放放精品细胞分离学胞分离学习要点要点n识记：重力沉降、离心沉降和重力沉降、离心沉降和过滤的概念。的概念。n理理解解：重重力力沉沉降降、离离心心分分离离与与过滤原原理理、理理论；掌握；掌握StokesStokes（斯托克斯）沉降公式（斯托克斯）沉降公式。n应用：用：常用离心方法及常用离心方法及优缺点；利用掌握的缺点；利用掌握的提高分离效率的方法分析决提高分离效率的方法分析决实际问题 精品（一）、重力沉淀n1、重力沉淀的定义n2、重力沉淀的理论n3 3、提高重力沉降的途径、提高重力沉降的途径精品1、重力沉降定、重力沉降定义重力沉降是重力沉降是传统化工化工过程中常用的从含有固体程中常用的从含有固体颗粒的流体中将粒的流体中将颗粒分离出来的操作。粒分离出来的操作。重力沉降重力沉降是利用流体与是利用流体与颗粒粒间的密度的密度差，在重力的作用下使差，在重力的作用下使颗粒与流体之粒与流体之间产生相生相对运运动，从而，从而实现两者的分离。两者的分离。在生物分离在生物分离过程中，定程中，定义中中颗粒粒为细胞、胞、细胞胞碎片等有形物碎片等有形物精品千姿百千姿百态态的微生物世界的微生物世界Bacterial morphology diagramHigh-density cell culture精品2、重力沉降理、重力沉降理论n理理论假假设n细胞或胞或细胞碎片按照球形胞碎片按照球形颗粒粒处理；理；n颗粒粒在在无无限限稀稀释的的溶溶液液中中进行行沉沉降降，颗粒粒之之间无相互干无相互干扰 n受力分析受力分析球形球形颗粒重力粒重力fg 液体的浮力液体的浮力fb 颗粒运粒运动方向相反的阻力方向相反的阻力 fs精品Fsd=2R球形球形颗粒沉降的受力情况粒沉降的受力情况精品重力沉降理重力沉降理论重力：重力：浮力：浮力：阻力：阻力：d,Ps分别指颗粒的直径（m）和密度（kg.m-3）精品精品重力沉降理重力沉降理论当球形当球形颗粒自身的重力与其所受到浮力和阻力粒自身的重力与其所受到浮力和阻力达到平衡达到平衡时，则精品重力沉降理重力沉降理论当球形当球形颗粒粒处于滞流区（于滞流区（）时 Stokes公式公式当球形当球形颗粒粒处于于过渡区（渡区（）时 Allen公式公式当球形当球形颗粒粒处于湍流区（于湍流区（）时Newton公式公式精品千姿百千姿百态态的微生物世界的微生物世界Bacterial morphology diagramHigh-density cell culture球形颗粒？无限稀无限稀释溶液？溶液？精品3 3、提高重力沉降的途径、提高重力沉降的途径n加入中性盐：双双电层排斥排斥电位降低位降低n加入高分子絮凝剂：架架桥作用形成大作用形成大絮凝絮凝图n引入外力引入外力精品（二）、离心沉淀n1、离心沉淀的定义n2、离心沉淀的理论n3、离心分离方法n4、离心分离设备精品1、离心沉降定、离心沉降定义离心沉降离心沉降是利用沉降是利用沉降设备使流体和使流体和颗粒旋粒旋转，在离心力的作用下，由于，在离心力的作用下，由于颗粒和流体粒和流体间存在密度差，所以存在密度差，所以颗粒沿径向与流体粒沿径向与流体产生相生相对运运动，从而使，从而使颗粒和流体分离。粒和流体分离。精品精品精品2、离心沉降理、离心沉降理论离心沉降速度离心沉降速度 令：令：精品3、离心分离方法、离心分离方法n差速离心分差速离心分级n区区带离心离心 差速区差速区带离心离心 平衡区平衡区带离心离心 精品差速离心分离差速离心分离 差速离心是以菌体细胞的收集或除去为目的的固液离心分离方法，应用某一特定颗粒沉淀的离心力在预定的离心时间内得到一部分颗粒沉淀及包含未沉淀颗粒的上清液。精品差速离心分离差速离心分离应应用用实实例例600g10 min15000g10 min100000g60 min300000g120 minnucleiMitochondrialysosomesPlasma membraneRiosomal subunitshomogenateFiltered homogenateSoluble part of cytoplasmSedimentation精品区区带离心分离前提离心分离前提 在离心管内的溶液存在密度梯度。采用事先配好的不同浓度（密度）的梯度介质（蔗糖等），按照浓度从大到小的原则，依次层层加入。加入离心管中的梯度介质经高速离心或静置后可形成连续的密度梯度。精品操作操作过过程程精品区区带带离心种离心种类类n差速区带离心(速度区带离心）n平衡区带离心（等密度离心）精品差差速速区区带带离离心心精品差速区差速区带带离心离心n基于颗粒的大小、形状的分离n梯度液的最大密度不能超过所分离颗粒的最大密度n离心过程中，颗粒不断沉降至其浮力密度与梯度液密度相等n动态离心分离方法精品平平衡衡区区带带离离心心精品平衡区平衡区带带离心离心n梯度液密度范围含盖全部待分离颗粒密度n离心过程中，颗粒不断沉降至其浮力密度与梯度液密度相等n平衡离心分离方法精品梯度液的种梯度液的种类类和和应应用用精品细胞分离区胞分离区带离心异同离心异同区区带离心种离心种类差速区差速区带离心离心平衡区平衡区带离心离心共同点共同点事先在离心管内用低分子量溶事先在离心管内用低分子量溶质调配好密度梯度配好密度梯度梯度介梯度介质常用蔗糖常用蔗糖常用常用氯化化铯密度梯度密度梯度最最大大的的密密度度梯梯度度低低于于最最大大密密度的沉降度的沉降样品品最最大大的的密密度度梯梯度度大大于于最最大大密密度的沉降度的沉降样品品区区带形成条件形成条件根根据据各各个个组分分沉沉降降系系数数的的差差别，形成各自的区，形成各自的区带根据各根据各组分密度差形成区分密度差形成区带离心条件离心条件在在最最前前的的沉沉降降物物质达达到到管管底底前停止，短前停止，短时间，低速度，低速度使使各各组分分沉沉降降到到其其平平衡衡的的密密度区，度区，长时间，高速度，高速度精品离心方法新离心方法新进展具体表展具体表现在哪几个方面？在哪几个方面？n1.固定角固定角转子垂直管离心法的子垂直管离心法的进展展n使用垂直管转子的成功之例是1980年由B.H.Chung等提高的血清脂蛋r白分离的SVs方法(即Single Vertical Spin法,一单次垂直管离心法)，它使对临床诊断意义很大的这一分离在实用上成为可能.传统的血清脂蛋白分离用“顺序浮选法”(即SF法)，一次分离需时3天，用去驱动寿命1亿转以上。现用垂直管转子作SVS方法，不连续NaCI/KBr或NaCI/Sucrose梯度，5.5万一6.5万转/分，0.75-2.5 i)时，一次分离成功。精品n3.短液柱离心法短液柱离心法(Short-Columnmethod)n由美国的0.M.Griffith在1978年提出。短柱法是在角式或水平转子中人为地使用不加满的离心管来降低液柱高。此法不仅降低液柱高以减少离心时间，更重要的是使处千液面的样品受到更大的离心力从而进一步缩短了离心时间，在不减少样品量和样品浓度的条件下，可把离心时间缩短为常规满管离心时的一半或更少。短液柱法使用中厚PC管和厚壁PA管，它们在不加满离心时也不会变形。精品n4.细绝(或或细菌菌)的离心洗脱的离心洗脱(Flutriator)技技术n 这是美国Beckman公司近年发展的一种低速连续洗脱技术，特别适用于培养液的连续收集。使用的是带小容量连续离心池的JE-6B转子.其洗脱原理不是在一般转子中的沉降，而是被分离物在离心中的“浮选”。用4.2ml的离心池可在1小时内从100-1 000m!的原液中回收10-10，个细胞。精品n2.超速超速连续离心法离心法n超速连续离心转子是由美国Beckman公司开发的，最适用于病毒的纯化，从大量的组织匀浆中分离亚细胞组织、培养液中细菌的收集，以及污水研究。精品4、离心、离心设备分分类分分类方法方法名称名称处理量理量实验室用离心机，工室用离心机，工业用离心机用离心机温度温度常温离心机、冷常温离心机、冷冻离心机离心机转速速低速离心机、高速离心机、超速离心机低速离心机、高速离心机、超速离心机转子子结构构管式、碟式管式、碟式精品常用离心常用离心设备Solids-ejecting disk bowl centrifuge of pilot size for sterilizable contained installation Nozzle machine with pressurized solids discharge for yeast and bacteria separation 精品常用离心常用离心设备Decanter centrifuge Multichamber bowl,vertical cut 精品管式离心管式离心设备A disposable cell separation insert PowerfugeTM one-chamber with scraper精品Tubularbowl精品碟片离心碟片离心设备(a)Solids-retaining disk bowl,(b)Radial solids-ejecting disk bowl,top feed.(c)Radial solids-ejecting disk bowl,hermetic feed.(d)Axial solids-ejecting disk bowl.(e)Nozzle bowl with pressurized solids discharge.(f)Nozzle bowl with peripheral discharge nozzles.精品精品离心离心设备比比较管式离心机管式离心机优点点结构构简单，转速和离心力速和离心力较大大缺点缺点沉降面沉降面积小、小、处理能力低；理能力低；碟式离心机碟式离心机优点点转子中存在隔板以增大沉降面子中存在隔板以增大沉降面积，处理能力大理能力大缺点缺点结构复构复杂、转速速较低；低；精品离心机离心机处理能力理能力粒子在径向上的沉降速度粒子在径向上的沉降速度 轴向移向移动速度速度 完全沉降的完全沉降的边界条件界条件 精品离心机离心机处理能力理能力影响因素影响因素处理理样品的特性，如密度、粒径等品的特性，如密度、粒径等溶液的特性，如密度、粘度等溶液的特性，如密度、粘度等离心机机械离心机机械结构，如构，如r1和和r2操作条件，操作条件，精品（三）、过滤n1、过滤的定义n2、过滤的受力分析n3、提高过滤速度的途径精品1、过滤定定义过滤是利用多孔性介是利用多孔性介质（如（如滤布）截留布）截留固液固液悬浮液中的固体粒子，浮液中的固体粒子，进行固液分行固液分离的方法。离的方法。过滤本身是一种膜分离技本身是一种膜分离技术。在分离。在分离细胞、菌体或胞、菌体或它它们的碎片的碎片过程中除了沉降分离方法外，程中除了沉降分离方法外，过滤技技术也是也是一种常一种常备的分离方法。的分离方法。精品2、过滤过程受力分析程受力分析推推动力：力：过滤操作以操作以压力差力差为主要推主要推动力；力；阻阻 力：力：过滤过程的阻力来自多孔性程的阻力来自多孔性过滤介介 质和介和介质表面不断堆表面不断堆积形成的形成的滤饼 精品过滤速率速率Q：液体的流量：液体的流量A:面面积Rm表示介表示介质的阻力；的阻力；Rc表示表示滤饼的阻力；的阻力；L为滤液的粘度液的粘度精品恒恒压过滤方程方程Ruth恒恒压过滤方程方程其中，其中，K为Ruth恒恒压过滤系数，表示系数，表示为精品3、提高提高过滤速度的途径速度的途径n采用絮凝或凝聚的方法采用絮凝或凝聚的方法预处理改理改变料液料液的性的性质，降低，降低滤饼阻力阻力n加入助加入助滤剂以改以改变滤饼的的压缩性指数，性指数，提高提高过滤速度速度精品滤饼传统的过滤cakeConventionalfiltration精品精品精品精品精品二、二、细胞破碎与胞内物胞破碎与胞内物释放放n1、概述n2、细胞破碎技术的分类n3、常用破碎方法的介绍精品学学习要点要点n理理解解：各各种种细胞胞破破碎碎方方法法原原理理、优缺缺点点及其适用范及其适用范围。n应用：用：采用不同的采用不同的细胞破碎方法胞破碎方法对不同不同细胞胞进行不同程度的破碎。行不同程度的破碎。精品1、概述n（1）细胞结构n（2）细胞膜的组成n（3）影响产物释放的因素精品（1）细胞胞结构构（真核（真核细胞与原核胞与原核细胞）胞）动物物细胞胞没有没有细胞壁，只有由脂胞壁，只有由脂质和蛋白和蛋白质组成的成的细胞膜胞膜植物植物细胞胞细胞膜外有一胞膜外有一层坚固的固的细胞壁胞壁酵母酵母细胞胞细胞壁由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白胞壁由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质构成，更加构成，更加难以破碎以破碎真核真核细胞胞原核原核细胞胞革革兰氏阳性菌氏阳性菌细胞胞壁壁由由肽聚聚糖糖层组成成，壁壁厚厚约1550nm，肽聚聚糖糖含含量量为4090%，细胞壁胞壁较革革兰氏阴性菌氏阴性菌坚固。固。革革兰氏阴性菌氏阴性菌细胞胞壁壁在在肽聚聚糖糖的的外外侧还有有分分别由由（1）脂脂蛋蛋白白和和（2）磷磷脂脂和和脂脂多多糖构成的两糖构成的两层外壁外壁层，外壁，外壁层厚度越厚度越810nm。精品（2）细胞膜胞膜组成成（A）（B）精品（3）影响）影响产物物释放的放的环境因素境因素在在复复杂培培养养基基中中生生长的的大大肠杆杆菌菌细胞胞其其破破碎碎较单一培养基中生一培养基中生长的大的大肠杆菌杆菌细胞更胞更难；对数数生生长期期的的细胞会表胞会表现得更加脆弱。得更加脆弱。从从连续培培养养过程程中中获得得的的、具具有有较高高比比生生长速速率率的的念念珠珠菌菌的的细胞胞壁壁更更加加脆脆弱弱，而而摇瓶瓶培培养养的的念念珠珠菌体菌体则有更加充裕的机会构建更加有更加充裕的机会构建更加坚固的固的细胞壁。胞壁。酵母酵母细胞壁的厚度和破碎阻力随胞壁的厚度和破碎阻力随年年龄增增长而增加而增加经常在幼酵母常在幼酵母细胞中出胞中出现的的芽痕芽痕（Budscars）可引起酵母可引起酵母细胞局部胞局部细胞壁胞壁强度的降低度的降低精品2、细胞破碎技术的分类n细胞破碎的目的 是释放出细胞内含物，其方法很多，按照是否存在外加作用力可分为机械法和非机械法两大类。精品细胞破碎技胞破碎技术分分类细胞胞破碎破碎机械破碎机械破碎高高压均均浆法法，珠珠磨磨法法、撞撞击破破碎碎、超超声声波波破碎破碎非机械破碎非机械破碎物理法物理法渗渗透透压冲冲击、冻结-融融化化、（超声波）（超声波）化学法化学法酸碱酸碱处理、化学理、化学试剂处理理生物法生物法酶溶、自溶、噬菌体溶、自溶、噬菌体精品精品3、常用细胞破碎方法介绍精品（1）机械破碎高）机械破碎高压匀匀浆细胞胞悬浮液在高浮液在高压的作用下从的作用下从阀座与座与阀杆之杆之间的的环隙高速（可隙高速（可达到达到450m/s）喷出后撞出后撞击到碰撞到碰撞环上，上，细胞在受到高速撞胞在受到高速撞击作作用后，急用后，急剧释放到低放到低压环境，从而在撞境，从而在撞击力和剪切力等力和剪切力等综合作合作用下破碎。用下破碎。精品缺点：n这种方法较易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性首以及有些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合用该法处理。精品（2）机械破碎珠磨）机械破碎珠磨珠磨机的破碎室内填充有珠磨机的破碎室内填充有8085（v/v）的玻璃（密度的玻璃（密度为2.5g/ml）或氧化或氧化锆（密度（密度为6.0g/ml）的微球（粒径的微球（粒径约0.11.0mm）。）。在在搅拌拌桨的高速的高速搅拌下微球高速运拌下微球高速运动，微球与微球之，微球与微球之间以及微球和以及微球和细胞之胞之间发生冲生冲击和研磨，使和研磨，使悬浮液中的浮液中的细胞胞受到研磨剪切和撞受到研磨剪切和撞击而破碎。而破碎。精品缺点：n设备是珠后机，在珠波分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作，破碎中，生的热量由夹套中的冷却液带走。存在的问题：操作参数多，一般凭经验估计并且珠子之间的液体损失30左右。精品（3）机械破碎撞）机械破碎撞击破碎破碎撞撞击破碎原理：破碎原理：细胞胞悬浮液以浮液以喷雾状高速状高速冻结（冻结速度速度为数数千千/min），），形成粒径小于形成粒径小于50微米的微粒子，高速微米的微粒子，高速载气（如氮气，流速气（如氮气，流速为300m/s）将将冻结的微粒子送的微粒子送入破碎室，高速撞入破碎室，高速撞击撞撞击板，使板，使冻结的的细胞胞发生破生破碎。碎。精品（4）机械破碎超声波破碎）机械破碎超声波破碎 压电传感器将感器将电子振子振荡器的交器的交变电流流转换为声波。在超声波的作用下液体声波。在超声波的作用下液体发生空化作用，生空化作用，空穴的形成、增大和空穴的形成、增大和闭合合产生极大的冲生极大的冲击波和波和剪切力，使剪切力，使细胞破碎。胞破碎。精品精品缺点：n超声波破碎在实验室规模应用较普遍，处理少量样品时操作简便，液量损失少，但是超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活。而且大容量装置声能传递，散热均有困难。精品非机械破碎之非机械破碎之q酸碱酸碱处理理q化学化学试剂处理理 q酶溶溶 q自溶自溶 q渗透渗透压冲冲击法法q冻结-融化法融化法 精品（5）化学渗透法n有些有机溶剂(如苯、甲苯)、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内合物有选择地渗透出来。其作用机理；化学渗透取决于化学试剂的类型以及细胞壁和膜的结构与组成。精品缺点：n时间长，效率低；化学试剂毒性较强，同时对产物也有毒害作用，进一步分离时需要用透析等方法除去这些试剂；通用性差：某种试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞。精品（6）酶溶法n就是用生物酶将细胞壁和细胞腊消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶，-1，3-葡聚糖酶、蛋白酶等。精品缺点：n易造成产物抑制作用，这可能是导致胞内物质释放率低的一个重要因素。而且溶酶价格高，限制了大规模利用。若回收溶酶，则又增加百分离纯化溶酶的操作。另外酶港法通用性差，不同菌种需选择不同的酶。精品（7）破碎方式比）破碎方式比较机械破碎机械破碎非机械破碎非机械破碎物理物理化学化学生物生物速度速度效率效率选择性性释放率放率条件条件高高高高差差大大剧烈烈较低低差差高高低低温和温和低低差差高高低低视方法定方法定低低差差高高低低精品（7）细胞破碎技术研究发展方向n1、多种破碎方法相结合n2、与上游过程相结合n（1）克隆噬菌体溶解基因n（2）耐高温产品的基因表达n3、与下游过程相结合精品小结：n1、细胞分离n 重力沉淀、离心沉淀、过滤n2、细胞破碎n 机械破碎法与非机械破碎法，不同方法的区别n3、细胞破碎的发展方向。精品作业：n1、常用细胞破碎方法的原理、特点及适用性。n2、机械法细胞破碎方法非机械破碎方法相比有何特点？精品