现代分子物学复习三-课件

复习三复习三DNA的结构的结构n第一节第一节遗传物质的本质遗传物质的本质n第二节第二节核酸的化学组成核酸的化学组成n第三节第三节DNA的二级结构的二级结构n第四节第四节DNA的物理化学性质的物理化学性质第一节第一节遗传物质的本质遗传物质的本质 1 1、遗传物质必须具有的特性遗传物质必须具有的特性 a a、贮存并表达存并表达遗传信息信息 b b、能把信息、能把信息传递给子代子代 c c、物理和化学性、物理和化学性质稳定定 d d、具有、具有遗传变化的能力化的能力 DNA DNA的特征的特征 各各异异的的碱碱基基序序列列储存存大大量量的的遗传信息信息 碱基互碱基互补是其复制、是其复制、转 录表达表达遗传信息的基信息的基础 生理状生理状态下物理、化学性下物理、化学性质 稳定定 有突有突变和修复能力，可和修复能力，可稳定定遗 传是生物是生物进化的基化的基础1kb DNA1kb DNA序列序列4 410001000 种种遗传信息信息一、一、DNA携带两类不同的遗传信息携带两类不同的遗传信息2、DNADNA携带两种遗传信息携带两种遗传信息 a a、编码蛋白蛋白质和和RNARNA的信息的信息(编码tRNAtRNA、rRNA)rRNA)b b、编码基因基因选择性表达的信息性表达的信息二、二、RNARNA也可作为遗传物质也可作为遗传物质 三、三、是否存在核酸以外的遗传物质是否存在核酸以外的遗传物质 第二节第二节核酸的化学组成核酸的化学组成 核苷（核苷（nucleotide）糖苷键糖苷键Glycosidicbond嘧啶的的1 1位位N N原子、原子、嘌呤的呤的9 9位位N N原子原子核糖是戊糖核糖是戊糖RNA核糖核苷核糖核苷DNA脱氧核糖核苷脱氧核糖核苷一、一、含氮碱基、核苷、核苷酸含氮碱基、核苷、核苷酸二、二、DNA分子的一级结构分子的一级结构(DNAsequence)1 1、多聚核苷酸多聚核苷酸链 主主链是核糖和磷酸是核糖和磷酸 侧链为碱基碱基由由3,53,5磷酸二磷酸二酯键连接接2 2、链的方向：同一个磷酸的方向：同一个磷酸基的基的33酯键到到55酯键的方的方向向(5(53)5-UCAGGCUA-3=UCAGGCUA默默认书写写顺序序53353 3、DNA DNA一一级结构的特点构的特点 a a、脱氧核糖是其、脱氧核糖是其显著特点著特点 DNADNA极其极其稳定的根本原因定的根本原因 b b、磷酸呈四面体构型，脱氧核糖呈折叠的五元、磷酸呈四面体构型，脱氧核糖呈折叠的五元环，碱基是平，碱基是平 面的面的C C、主、主链是是亲水的，水的，侧链（碱基）是疏水的（碱基）是疏水的 主主链的脱氧核糖的的脱氧核糖的羟基能与水形成基能与水形成氢键，而磷酸，而磷酸 基基团在生理条件下离解在生理条件下离解为负离子离子 这些特点保些特点保证了多核苷酸了多核苷酸链可形成可形成稳定的构象定的构象4 4、一一级结构的概念构的概念 指指DNADNA分子中的核苷酸排列分子中的核苷酸排列顺序，序，不同生物借此不同生物借此贮存存遗传信息，决定信息，决定DNADNA的二的二级结构和高构和高级结构构第三节第三节DNA的二级结构的二级结构 每一每一单链具有具有 5 35 3极极性性 两条两条单链极性相极性相 反反向平行反反向平行 两条两条单链间以以氢 键 连接接 以中心以中心为轴，向向 右右 盘 旋（旋（直径直径2nm2nm）双双 螺螺 旋旋 中中 存存 在在 大，小大，小 沟。沟。*双螺旋的主链双螺旋的主链 直径直径20*双螺旋模型参数双螺旋模型参数 螺距为螺距为34（任一条（任一条链绕轴一周所升降的距离）一周所升降的距离）每圈有每圈有1010个核苷酸个核苷酸 （碱基）（碱基）有大沟和小沟有大沟和小沟 配对碱基并不充满双配对碱基并不充满双 螺旋空间，且碱基对螺旋空间，且碱基对 占据的空间不对称占据的空间不对称 两个碱基之间的垂两个碱基之间的垂直直 距离是距离是3.43.4。螺旋转。螺旋转角是角是36度度二、二、影响双螺旋结构稳定性的因素影响双螺旋结构稳定性的因素 l氢键氢键(Hydrogen bond 46 kc/mol)(Hydrogen bond 46 kc/mol)消除消除DNA单链上磷酸基团间的静电斥力单链上磷酸基团间的静电斥力弱键弱键,可加热解链可加热解链氢键堆积氢键堆积,有序排列有序排列(线性线性,方向方向)l磷酸酯键磷酸酯键(phosphoester bond 8090 kc/(phosphoester bond 8090 kc/mol)mol)l0.2 mol/L Na0.2 mol/L Na+生理盐条件生理盐条件强键强键,需酶促解链需酶促解链*维持稳定性的因素维持稳定性的因素l碱基堆积力碱基堆积力(非特异性结合力非特异性结合力)(1 kc/mol 0.6kc/mol)(1 kc/mol 0.6kc/mol)nn范德华力（范德华力（Van de waals forceVan de waals force）(1.7A/嘌呤环与嘧啶环嘌呤环与嘧啶环作用半径作用半径)(0.34nm/碱基对间距碱基对间距)3.4A疏水作用力疏水作用力(Hydrophobicinteraction)不溶于水的非极性分子在水中相互联合不溶于水的非极性分子在水中相互联合,成串结合的趋势力成串结合的趋势力.即熵即熵值值(Entrophy)S上升上升-热力学上的稳定态热力学上的稳定态成为碱基间的部分堆积力成为碱基间的部分堆积力(磷酸骨架磷酸骨架,氨基氨基,酮基周围水分子间的有序排列酮基周围水分子间的有序排列)非极性分子间（嘌呤和嘧啶碱基）的相互成串结合非极性分子间（嘌呤和嘧啶碱基）的相互成串结合熵值熵值上升上升(Sgoingup)l磷酸基团间的静电斥力磷酸基团间的静电斥力l碱基内能增加碱基内能增加(温度温度),使氢键使氢键因碱基排列有序状态的破坏因碱基排列有序状态的破坏而减弱而减弱*不稳定因素不稳定因素三、双螺旋结构的基本形式三、双螺旋结构的基本形式 B-DNA B-DNA 资料来自相料来自相对湿度湿度为9292所得到的所得到的DNADNA钠盐纤维 此外人此外人们还发现了了A A右手双螺旋和左手双螺旋右手双螺旋和左手双螺旋,BB、C C、D D、Z Z构象等形式。构象等形式。A-DNA A-DNA 是是B-DNA 的一条和两条的一条和两条链被被RNARNA所取代形成的所取代形成的结构。构。Z-DNA Z-DNA Rich 1979Rich 1979年年d d（CGCGCG)CGCGCG)结晶结晶 X X衍射衍射 是左手螺旋，是右手螺旋的补充是左手螺旋，是右手螺旋的补充 不具有转录活性，具有调节基因转录的模式，转化不具有转录活性，具有调节基因转录的模式，转化 成成B B有活性有活性ABZHandednessBaseInclinationRNA+DNADNA第四节第四节DNA的物理、化学性质的物理、化学性质一、一、DNA分子的变性分子的变性DNA双股链的互补双股链的互补是其结构和功能上的一个基本特征，是其结构和功能上的一个基本特征，也是也是DNA研究中一些实验技术的基础研究中一些实验技术的基础 变性（变性（denaturation denaturation 或融解或融解 melting melting）：）：DNADNA双螺旋区的双螺旋区的 氢键断裂，使双螺旋的两条链完全分开变成单链，这氢键断裂，使双螺旋的两条链完全分开变成单链，这 一链分离的过程叫做变性一链分离的过程叫做变性1、条件：加热、条件：加热,极端极端pH,有机溶剂（有机溶剂（尿素、尿素、酰胺酰胺)，低盐浓度，低盐浓度等等 2 2、变性过程的表现、变性过程的表现 是一个爆发式的协同过程，变性作用发生在一个很是一个爆发式的协同过程，变性作用发生在一个很 窄的温度范围窄的温度范围 导致一些理化性质发生剧烈变化导致一些理化性质发生剧烈变化 熔液黏度降低熔液黏度降低 沉降速度加大沉降速度加大 浮力密度上升浮力密度上升 此外吸收值升高（此外吸收值升高（A260nmA260nm），即），即增色效应增色效应 指在指在DNADNA变性的过程中，他在变性的过程中，他在260nm260nm的吸收值先是缓慢的吸收值先是缓慢 上升，达到某一温度时及骤然上升上升，达到某一温度时及骤然上升 天然天然DNADNA和和变性性DNADNA的吸收的吸收值相差可达相差可达3434D.SDNAA260=1.0S.SDNAA260=1.37dNTPsA260=1.60当浓度为当浓度为50g/ml时：时：1.1851.01.37ODTm=ofCt=C0/2=OD增加值的中点温度增加值的中点温度(一般为一般为85-95)或或DNA双螺旋结构失去一半时的温度双螺旋结构失去一半时的温度3 3、熔解曲线与、熔解曲线与TmTm值值 缓慢而均匀地增加缓慢而均匀地增加DNA溶液的温度（现可做到溶液的温度（现可做到0.1分分）可根据各可根据各点的点的A260值绘制成值绘制成DNA的熔解曲线的熔解曲线这也是一般也是一般PCRPCR实验技技术中把中把变性温度定性温度定为94 94 的原因的原因 1、影响影响Tm值的因素值的因素（1）在在A,T,C,G随机分布的情况下随机分布的情况下，决定于，决定于GC含量含量（2）GC%含量相同的情况下含量相同的情况下GC%愈高愈高Tm值愈大值愈大GC%愈低愈低Tm值愈小值愈小AT形成变性核心，变性加快，形成变性核心，变性加快，Tm值小值小碱基排列对碱基排列对Tm值具有明显影响值具有明显影响5GC3CGn5CG3GCn5TA3ATn5AT3TAn36.757.02Tm136.1272.552、常用的变性方法常用的变性方法热变性热变性碱变性碱变性应用广泛，特别是用于变性动力学研究应用广泛，特别是用于变性动力学研究缺点：高温引起磷酸二缺点：高温引起磷酸二酯键的断裂，得到的断裂，得到长短不一的短不一的单链pH11.3时，全部氢键被淘汰时，全部氢键被淘汰无无热变性的缺点，性的缺点，为制制备单链DNADNA的首的首选方法方法 保存单链保存单链DNADNA的条件的条件 保持保持pHpH大于大于11.311.3 盐浓度低于盐浓度低于0.01mol/L0.01mol/LD.SDNAS.SDNADenaturationRenaturation复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞(DependsonthecollisionofcomplementaryS.S.DNA)二、二、DNA分子的复性分子的复性（annealorrenaturation）概念：变性概念：变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的链又可以在适当条件下，两条彼此分开的链又可以重新地合成双螺旋结构的过程（退火）重新地合成双螺旋结构的过程（退火）影响影响DNA复性过程的因素复性过程的因素：阳离子浓度阳离子浓度0.180.2MNa+可消除可消除polydNt间的静电斥力间的静电斥力复性反应的温度复性反应的温度低于低于Tm值值25左右左右(60-65)S.S,DNA的初始浓度的初始浓度C0 DNA分分子子中中,dNt的的排排列列状状况况(随随机机排排列列,重重复复排排列列)S.S.DNA分子的长度（片段的大小）分子的长度（片段的大小）S.S.DNA愈长愈长S.S.DNA愈短愈短分子扩散愈慢分子扩散愈慢复性愈慢复性愈慢分子扩散愈快分子扩散愈快复性愈快复性愈快n！需要掌握的问题 1 1、遗遗传传物物质质必必须须具具有有的的特特性性,DNA,DNA作作为为遗遗传传物物质质具有哪些特性？具有哪些特性？a a、贮存并表达存并表达遗传信息信息 b b、能把信息、能把信息传递给子代子代 c c、物理和化学性、物理和化学性质稳定定 d d、具有、具有遗传变化的能力化的能力 DNA DNA的特征的特征 各各异异的的碱碱基基序序列列储存存大大量量的的遗传信息信息 碱基互碱基互补是其复制、是其复制、转 录表达表达遗传信息的基信息的基础 生理状生理状态下物理、化学性下物理、化学性质 稳定定 有突有突变和修复能力，可和修复能力，可稳定定遗 传是生物是生物进化的基化的基础1kb DNA1kb DNA序列序列4 410001000 种种遗传信息信息 直径直径202 2、双螺旋模型参数、双螺旋模型参数 螺距为螺距为34（任一条（任一条链绕轴一周所升降的距离）一周所升降的距离）每圈有每圈有1010个核苷酸个核苷酸 （碱基）（碱基）有大沟和小沟有大沟和小沟 配对碱基并不充满双配对碱基并不充满双 螺旋空间，且碱基对螺旋空间，且碱基对 占据的空间不对称占据的空间不对称 两个碱基之间的垂两个碱基之间的垂直直 距离是距离是3.43.4。螺旋转。螺旋转角是角是36度度3、维持稳定性的因素维持稳定性的因素 l氢键氢键(Hydrogen bond 46 kc/mol)(Hydrogen bond 46 kc/mol)l磷酸酯键磷酸酯键(phosphoester bond 8090 kc/(phosphoester bond 8090 kc/mol)mol)l0.2 mol/L Na0.2 mol/L Na+生理盐条件生理盐条件l碱基堆积力碱基堆积力(非特异性结合力非特异性结合力)范德华力（范德华力（Van de waals forceVan de waals force）疏水作用力疏水作用力(Hydrophobicinteraction)4、DNA分子的变性分子的变性 变性（变性（denaturation denaturation 或融解或融解 melting melting）：）：DNADNA双螺旋区的双螺旋区的 氢键断裂，使双螺旋的两条链完全分开变成单链，这氢键断裂，使双螺旋的两条链完全分开变成单链，这 一链分离的过程叫做变性一链分离的过程叫做变性5、增色效应、增色效应指在指在DNA变性的过程中，他在变性的过程中，他在260nm的吸的吸收值先是缓慢上升，达到某一温度时及骤然上收值先是缓慢上升，达到某一温度时及骤然上升升6Tm=ofCt=C0/2=OD增加值的中点温度增加值的中点温度(一般为一般为85-95)或或DNA双螺旋结构失去一半时的温度双螺旋结构失去一半时的温度5 5、熔解曲线、熔解曲线 缓慢而均匀地增加缓慢而均匀地增加DNA溶液的温度（现可做到溶液的温度（现可做到0.1分分）可根据各可根据各点的点的A260值绘制成值绘制成DNA的熔解曲线的熔解曲线7、DNA分子的复性分子的复性（annealorrenaturation）概念：变性概念：变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的链又可以在适当条件下，两条彼此分开的链又可以重新地合成双螺旋结构的过程（退火）重新地合成双螺旋结构的过程（退火）8、影响影响DNA复性过程的因素复性过程的因素：阳离子浓度阳离子浓度0.180.2MNa+可消除可消除polydNt间的静电斥力间的静电斥力复性反应的温度复性反应的温度低于低于Tm值值25左右左右(60-65)S.S,DNA的初始浓度的初始浓度C0 DNA分分子子中中,dNt的的排排列列状状况况(随随机机排排列列,重重复复排排列列)S.S.DNA分子的长度（片段的大小）分子的长度（片段的大小）S.S.DNA愈长愈长S.S.DNA愈短愈短分子扩散愈慢分子扩散愈慢复性愈慢复性愈慢分子扩散愈快分子扩散愈快复性愈快复性愈快34谢谢！谢谢！