流式细胞术实验方法及应用-课件

流式细胞术实验方法及应用流式细胞术实验方法及应用 科研型科研型 分选功能分选功能488nm488nm激光激光 四色荧光四色荧光(525(525、575575、610610、675nm675nm）一、流式细胞术的原理一、流式细胞术的原理 流式细胞仪的发展起源于细胞计数自动化的流式细胞仪的发展起源于细胞计数自动化的研究。其原理是被荧光染色的单细胞或颗粒，研究。其原理是被荧光染色的单细胞或颗粒，经过高速的液流系统形成细胞柱，排列成单细经过高速的液流系统形成细胞柱，排列成单细胞依次通过流动室，在激光照射区域，携带荧胞依次通过流动室，在激光照射区域，携带荧光素细胞受激发产生不同的荧光信号，这些荧光素细胞受激发产生不同的荧光信号，这些荧光信号可以反映细胞的生物特性。光信号可以反映细胞的生物特性。前向散射激光FCMFCM的液流系统（如的液流系统（如何形成单个细胞流）何形成单个细胞流）样本管样本管鞘液管鞘液管 近近3030年来流式细胞术在我国得到很年来流式细胞术在我国得到很快的发展，应用范围不断增大。目前，快的发展，应用范围不断增大。目前，流式细胞术作为一门生物检测技术广泛流式细胞术作为一门生物检测技术广泛应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞遗传学、细胞生物学、生物化学等临床遗传学、细胞生物学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域。医学和基础医学研究领域。速度快速度快极短时间内可分析大量细胞，每秒可检测上万极短时间内可分析大量细胞，每秒可检测上万个个细胞，甚至几万个细胞。细胞，甚至几万个细胞。多参数分析多参数分析可同时分析单个细胞的多种特性，获得单个细可同时分析单个细胞的多种特性，获得单个细胞多种信息，也可以根据其细胞表面标志的不同把胞多种信息，也可以根据其细胞表面标志的不同把细胞群分为各亚群。细胞群分为各亚群。二、流式细胞术的特点、优点二、流式细胞术的特点、优点定性、定量分析细胞定性、定量分析细胞通过荧光染色对单细胞的某些成分，如：通过荧光染色对单细胞的某些成分，如：DNADNA、抗原或受体等进行定性、定量分析。抗原或受体等进行定性、定量分析。灵敏度高灵敏度高 荧光能检测到单个微粒上标有荧光分子少于荧光能检测到单个微粒上标有荧光分子少于60010S10、G2/M15G2/M15或或S20S20、G2/M5G2/M5白细胞分化抗原（白细胞分化抗原（CDCD分子）的命名：分子）的命名：19821982年世界卫生组织和国际免疫学会联合会，年世界卫生组织和国际免疫学会联合会，将所有抗体根据白细胞分化抗原反应性的类型划将所有抗体根据白细胞分化抗原反应性的类型划分为分为2525群，把每一群抗体称为一个群，把每一群抗体称为一个分化抗体群分化抗体群(Cluster of Differentiation(Cluster of Differentiation，CD)CD)，进行编号、，进行编号、命名，即为单克隆抗体的国际命名法。由命名，即为单克隆抗体的国际命名法。由CDCD抗体抗体群识别的分化抗原就称为群识别的分化抗原就称为CDCD分子分子。目前已有。目前已有339339个个分化抗体群被鉴定并命名分化抗体群被鉴定并命名2 2、淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析 流式细胞结合单克隆抗体技术能准确分类流式细胞结合单克隆抗体技术能准确分类计数淋巴细胞亚群，被认为是血液中淋巴细胞计数淋巴细胞亚群，被认为是血液中淋巴细胞免疫表型分析的标准方法。血液淋巴细胞是一免疫表型分析的标准方法。血液淋巴细胞是一群特异性极强的细胞，根据淋巴细胞的功能及群特异性极强的细胞，根据淋巴细胞的功能及膜表面标志，主要分为膜表面标志，主要分为T T淋巴细胞淋巴细胞(CD3+)(CD3+)、B B淋淋巴细胞巴细胞(CD19+)(CD19+)、NKNK细胞细胞(CD16+56+/CD3-)(CD16+56+/CD3-)三个三个亚群。亚群。CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+T淋巴细胞淋巴细胞（CD3+）淋巴细胞淋巴细胞 B淋巴细胞淋巴细胞（CD19+）NK细胞细胞（CD16+56）+NKNK细胞细胞:CD(16+56)CD(16+56)+/CD3/CD3-B B淋巴细胞淋巴细胞:CD19CD19+/CD3/CD3-NK+/CD3-CD（16+56）+/CD3+（T-cell）CD19+/CD3+（T-cell）CD19+/CD3-50ul+10ul50ul+10ul相应抗体相应抗体 避光孵育避光孵育15min 15min 加加OptiLyes COptiLyes C溶血素溶血素250ul 250ul 室温室温10min 10min PBS PBS洗一次洗一次 上机分析上机分析抗体抗体:CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CY5CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CY5三标抗体三标抗体CD19-PE/CD3-FITCCD19-PE/CD3-FITC二标抗体二标抗体CD16+56-PE/CD3-FITCCD16+56-PE/CD3-FITC二标抗体二标抗体IgG-FITC/IgG-PE/IgG-PE-CY5IgG-FITC/IgG-PE/IgG-PE-CY5同型对照同型对照外周血淋巴细胞亚群标记方法（表面标记）外周血淋巴细胞亚群标记方法（表面标记）淋巴细胞亚群检测临床淋巴细胞亚群检测临床意义：意义：CD3CD3+、CD4CD4+、CD8CD8+总数降低总数降低：细胞免疫功能低下细胞免疫功能低下 CD4CD4+（CD4CD4+/CD8/CD8+）降低或）降低或CD8CD8+(CD8+/CD4(CD8+/CD4+)升高：升高：AIDSAIDS、病毒感染、恶性肿瘤（复发或转移）、再生、病毒感染、恶性肿瘤（复发或转移）、再生障碍性贫血等障碍性贫血等 CD4CD4+(CD4(CD4+/CD8/CD8+)升高或升高或CD8CD8+(CD8(CD8+/CD4/CD4+)降低降低：自身：自身 免疫性疾、多发性硬化病、自身免疫性溶血性贫血免疫性疾、多发性硬化病、自身免疫性溶血性贫血 CD3CD3+CD4CD4+CD8CD8+T T细胞减少细胞减少：见于免疫球蛋白缺乏症、：见于免疫球蛋白缺乏症、胸腺发育不良、严重免疫缺陷病。胸腺发育不良、严重免疫缺陷病。NK CD(16+56)NK CD(16+56)+活性低下：活性低下：肿瘤、白血病、自肿瘤、白血病、自身免疫病、免疫缺陷病等身免疫病、免疫缺陷病等 NK+CD(16+56)NK+CD(16+56)+活性增高：活性增高：多发性骨髓瘤、骨瘤、骨髓移植感染、感染性疾病（髓移植感染、感染性疾病（B B病毒、疱疹病毒、肺病毒、疱疹病毒、肺TBTB）、习惯性流产等）、习惯性流产等 CD19CD19+B B细胞减少：细胞减少：体液免疫抑制体液免疫抑制 CD19CD19+B B细胞增高细胞增高：B B细胞恶性增殖性疾病（白血病）细胞恶性增殖性疾病（白血病）FCMFCM作为白血病辅助诊断，免疫分型是急作为白血病辅助诊断，免疫分型是急白血病诊断的关键技术。利用不同类型的白血白血病诊断的关键技术。利用不同类型的白血病具有不同抗原表达的特异性进行分型：髓系、病具有不同抗原表达的特异性进行分型：髓系、B B淋巴系、淋巴系、T T淋巴系、非系列特异性等。标记方淋巴系、非系列特异性等。标记方法：往往需要胞浆和胞膜同时标记，一线抗体法：往往需要胞浆和胞膜同时标记，一线抗体包括：胞浆包括：胞浆（髓系（髓系-MPO-MPO，B B淋巴系淋巴系-CD79a,T-CD79a,T淋巴系淋巴系-cyCD3cyCD3）,胞膜胞膜(髓系髓系-CD13-CD13、CD117CD117，B B淋巴系淋巴系-CD19-CD19、CD10,TCD10,T淋巴系淋巴系-CD3-CD3、CD2)CD2)等等3 3、白血病免疫分型白血病免疫分型 采用采用CD45CD45和侧向散射和侧向散射(SSC(SSC）设门技术可将各）设门技术可将各细胞群分开，荧光从强细胞群分开，荧光从强大到弱：大到弱：淋巴细胞群淋巴细胞群 单核细胞单核细胞 成熟粒细胞成熟粒细胞 原原/幼细胞幼细胞(白血病细胞白血病细胞)，而成，而成熟的红细胞和熟的红细胞和血小板血小板不表达。不表达。正常骨髓流式细胞分布图正常骨髓流式细胞分布图各系表达的抗原各系表达的抗原造血干细胞：造血干细胞：CD34CD34、CD33CD33髓系表达髓系表达 ：CD13CD13、CD14CD14、CD33CD33巨核细胞巨核细胞 ：CD61CD61、CD41CD41B B细胞系：细胞系：CD10 CD10、CD19CD19、CD20CD20T T细胞系：细胞系：CD2CD2、CD3CD3、CD5CD5、CD7CD7NKNK细胞细胞:CD16:CD16、CD56CD56、CD57CD57 细胞因子（细胞因子（CKCK）主要由免疫细胞产生，主要由免疫细胞产生，也可由非免疫细胞如内皮细胞、成纤维细也可由非免疫细胞如内皮细胞、成纤维细胞等产生。一种细胞可产生多种胞等产生。一种细胞可产生多种CKCK，一种，一种CKCK也可由多种细胞产生。细胞因子分为也可由多种细胞产生。细胞因子分为4 4类：类：白细胞介素（白细胞介素（lLlL）；干扰素（）；干扰素（IFNIFN）；造血）；造血生长因子；肿瘤坏死因子（生长因子；肿瘤坏死因子（TNFTNF）。）。4 4、细胞因子的检测细胞因子的检测血液中未活化的白细胞内无或仅极小量细胞因子，血液中未活化的白细胞内无或仅极小量细胞因子，当其被各种激活剂活化后，细胞内细胞因子合成增加当其被各种激活剂活化后，细胞内细胞因子合成增加并不断分泌到细胞外而发挥作用。因此，要测定细胞并不断分泌到细胞外而发挥作用。因此，要测定细胞内的细胞因子较为困难。通常应用内的细胞因子较为困难。通常应用刺激剂刺激剂（如：佛波（如：佛波脂）来刺激细胞因子分泌脂）来刺激细胞因子分泌 ，同时加入一定浓度的细，同时加入一定浓度的细胞内蛋白分泌胞内蛋白分泌抑制剂抑制剂（如：莫能霉素），使细胞因子（如：莫能霉素），使细胞因子合成后累积在细胞内，通过细胞因子特异的单克隆抗合成后累积在细胞内，通过细胞因子特异的单克隆抗体进行细胞内荧光染色，并结合膜表面抗原染色，进体进行细胞内荧光染色，并结合膜表面抗原染色，进行多色分析各种细胞内合成的细胞因子。行多色分析各种细胞内合成的细胞因子。全血或单细胞全血或单细胞+刺激素刺激素(佛波脂佛波脂)和阻断剂和阻断剂(莫能霉素莫能霉素)3737培养培养4-6h 4-6h 加入细胞加入细胞表面抗体表面抗体(如如CD3CD3、CD4/CD8)CD4/CD8)孵育孵育20-20-30min PBS30min PBS洗洗1 1次次 加固定破膜剂加固定破膜剂 室温室温15min 15min 加入加入IFN-rIFN-r和和IL-4IL-4抗体抗体 孵育孵育30min PBS30min PBS洗两次洗两次 FCMFCM。细胞因子检测细胞因子检测（IFN-IFN-IFN-IFN-r r r r，IL-4IL-4IL-4IL-4）：）：）：）：结果分析：结果分析：运用流式设门技术，先利用前向散射（运用流式设门技术，先利用前向散射（FSFS）和侧）和侧向散射（向散射（SSSS）圈出淋巴细胞，再用）圈出淋巴细胞，再用CD3+CD3+和和SSCSSC设门圈出设门圈出T T淋淋巴细胞，再用巴细胞，再用CD8-/CD3+CD8-/CD3+设门选定设门选定T T淋巴细胞亚群，再分析淋巴细胞亚群，再分析IL-4+IL-4+和和CD4+/IFN-rCD4+/IFN-r淋巴细胞淋巴细胞T淋巴细胞（淋巴细胞（CD3+）CD3+CD8-（CD4+）IFN-rIL-4 检测检测 Fluo-3/AmFluo-3/Am是高特异性是高特异性CaCa2+2+荧光指示剂，能与荧光指示剂，能与CaCa2+2+特特异结合。异结合。Fluo-3Fluo-3它本身是亲水性，不易透过膜的，依赖其它本身是亲水性，不易透过膜的，依赖其脂溶性脂溶性AMAM（乙酰氧甲基）乙酰氧甲基），酯化后就容易跨过质膜进入胞浆，酯化后就容易跨过质膜进入胞浆，在胞内酯酶的作用下，脱去在胞内酯酶的作用下，脱去AMAM重新生成亲水性形式，一方重新生成亲水性形式，一方面不能再进入细胞器，另一方面易于在胞内扩散，与游离面不能再进入细胞器，另一方面易于在胞内扩散，与游离钙离子结合，通过检测其荧光强度可反映出细胞内游离钙离子结合，通过检测其荧光强度可反映出细胞内游离CaCa2+2+浓度的变化。浓度的变化。单细胞悬液单细胞悬液+flour-3/AM 37+flour-3/AM 37C C避光孵育避光孵育40min 40min PBS PBS洗洗1 1次次 上机检测上机检测 5 5、细胞内、细胞内CaCa2+2+浓度浓度CaCaCaCa2+2+2+2+超载是细胞损伤的重要标志，导致超载是细胞损伤的重要标志，导致超载是细胞损伤的重要标志，导致超载是细胞损伤的重要标志，导致DNADNADNADNA降解，降解，降解，降解，促使细胞凋亡。促使细胞凋亡。促使细胞凋亡。促使细胞凋亡。6 6、线粒体膜电位、线粒体膜电位 线粒体膜电位（线粒体膜电位（MMPMMP）是线粒体功能的重）是线粒体功能的重要参数，是评价线粒体功能的敏感指标，它要参数，是评价线粒体功能的敏感指标，它的大小直接反映线粒体功能及数量，的大小直接反映线粒体功能及数量，MMPMMP下降，下降，其氧化磷酸化功能障碍，使其氧化磷酸化功能障碍，使ATPATP产生减少，导产生减少，导致细胞凋亡和坏死。致细胞凋亡和坏死。Rhodamine123Rhodamine123（罗丹明（罗丹明123123）、）、DiOC6DiOC6、JC-1JC-1等多等多种种亲脂性的阳离子亲脂性的阳离子荧光素都能被流式细胞分析用于作荧光素都能被流式细胞分析用于作为检测为检测 MMPMMP的探针。这些亲脂性荧光染料，对膜具有的探针。这些亲脂性荧光染料，对膜具有通透性，另外线粒体内外膜之间存在着跨膜电位，通透性，另外线粒体内外膜之间存在着跨膜电位，线线粒体内膜的内侧带粒体内膜的内侧带负电荷负电荷，当它们与活细胞一起培养当它们与活细胞一起培养时，这些阳离子荧光素进入细胞内就能特异地聚集于时，这些阳离子荧光素进入细胞内就能特异地聚集于线粒体，其摄入量与线粒体膜电位成正比。线粒体，其摄入量与线粒体膜电位成正比。MMPMMP检测原理及方法：检测原理及方法：当当MMPMMP降低后，线粒体内的荧光素会发生外降低后，线粒体内的荧光素会发生外漏，在细胞内荧光强度降低。检测其荧光强漏，在细胞内荧光强度降低。检测其荧光强度能反映线粒体数量和度能反映线粒体数量和MMPMMP的降低或丧失。的降低或丧失。操作：操作：单细胞悬液（单细胞悬液（1*10 1*10 6 6 ）+1umol/L+1umol/L的的Rh123 Rh123 37 37 C,30minC,30min PBS PBS洗两次洗两次 上机检测上机检测 细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序结束其生命的过条件下，遵循自身的程序结束其生命的过程。细胞凋亡为一种可调控的、主动的细程。细胞凋亡为一种可调控的、主动的细胞死亡过程，有很多的促进或抑制凋亡的胞死亡过程，有很多的促进或抑制凋亡的调控途径存在，因而就可以人为地诱导或调控途径存在，因而就可以人为地诱导或抑制某些细胞的凋亡，从而达到防病、治抑制某些细胞的凋亡，从而达到防病、治病的目的。病的目的。7 7、FCMFCM检测细胞凋亡检测细胞凋亡 半胱氨酸蛋白酶（半胱氨酸蛋白酶（CaspaseCaspase）以无活性的酶）以无活性的酶原形式存在细胞内，需被水解加工后才能成为有原形式存在细胞内，需被水解加工后才能成为有活性的片段。活化的活性的片段。活化的CaspaseCaspase进一步激活其他的进一步激活其他的CaspaseCaspase前体，形成了级联放大切割过程，是直前体，形成了级联放大切割过程，是直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统，目前已发现接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统，目前已发现1515个个CaspaseCaspase家族成员，分别命名为家族成员，分别命名为Caspase1-15Caspase1-15。在在CaspaseCaspase家族成员中，家族成员中，Caspase-3Caspase-3是最重要的指是最重要的指示蛋白酶。示蛋白酶。（1 1）CaspaseCaspase家族家族操作：操作：单细胞悬液（单细胞悬液（1*10 1*10 6 6）固定和破膜剂固定和破膜剂 冰浴冰浴20min Perm/Wash Buffer20min Perm/Wash Buffer洗两次洗两次 20ul20ul单抗单抗 室温孵育室温孵育30min 30min Perm/Wash BufferPerm/Wash Buffer洗洗1 1次次 加加0.5ml 0.5ml Perm/Wash Buffer Perm/Wash Buffer 上机检测上机检测。细胞凋亡过程中有多种基因蛋白参与调细胞凋亡过程中有多种基因蛋白参与调控。凋亡相关基因可分两类：诱导凋亡基因控。凋亡相关基因可分两类：诱导凋亡基因和抗凋亡基因。主要有和抗凋亡基因。主要有bcl-2bcl-2家族、家族、P53P53、cedced基因家族等。基因家族等。抗凋亡基因抗凋亡基因:bcl-2:bcl-2、bcl-XLbcl-XL、BadBad 等 促凋亡基因促凋亡基因:bax:bax、bakbak、bcl-XSbcl-XS等等 染色标记同CaspaseCaspase（2 2）凋亡相关基因蛋白凋亡相关基因蛋白 FasFas又称又称APO-1APO-1，即，即CD95CD95分子，是细胞膜上的跨分子，是细胞膜上的跨膜蛋白，表达在各种组织细胞，是典型的细胞死亡膜蛋白，表达在各种组织细胞，是典型的细胞死亡受体。受体。Fas/FasLFas/FasL是凋亡诱导家族的重要成员之一，是凋亡诱导家族的重要成员之一，是调节组织发育和体内平衡的重要分子是调节组织发育和体内平衡的重要分子,Fas/FasL,Fas/FasL结合结合,可向细胞传递死亡信号可向细胞传递死亡信号,引起细胞凋亡。引起细胞凋亡。检测：同表面标记检测：同表面标记（3 3）Fas/Fas/FasLFasL被认为比较成熟的方法：被认为比较成熟的方法：（4 4）凋亡率检测凋亡率检测PIPI单染色法单染色法Annexin VAnnexin VPIPI双染法。双染法。TUNELTUNEL法法碘化丙啶（碘化丙啶（PIPI）单染法）单染法（DNADNA周期分析）周期分析）：由于凋亡细胞由于凋亡细胞DNADNA被降解，小分子被降解，小分子DNADNA可可通过细胞膜渗透到细胞外，另外凋亡小体也通过细胞膜渗透到细胞外，另外凋亡小体也可带走部分可带走部分DNADNA，造成凋亡细胞，造成凋亡细胞DNADNA含量减少，含量减少，与荧光染料结合减少，荧光强度减弱，在与荧光染料结合减少，荧光强度减弱，在DNADNA直方图上显示在直方图上显示在G0/G1G0/G1峰前出现一个峰前出现一个DNADNA含量含量减少的减少的亚二倍体峰亚二倍体峰，称凋亡细胞峰。，称凋亡细胞峰。Annexin VAnnexin VPIPI双染法：双染法：在凋亡细胞的形态学改变中，胞膜的改变是最在凋亡细胞的形态学改变中，胞膜的改变是最早的。在细胞凋亡早期，细胞膜内侧磷脂酰丝氨早的。在细胞凋亡早期，细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸（酸（PSPS）从细胞膜内层翻转，暴露在凋亡细胞表）从细胞膜内层翻转，暴露在凋亡细胞表面，构成早期凋亡的重要生化特征，面，构成早期凋亡的重要生化特征，PSPS被特异的被特异的Annexin V-FITCAnnexin V-FITC探针所标记，而探针所标记，而PIPI对细活细胞和对细活细胞和早期凋亡细胞是拒染的，故早期凋亡细胞是拒染的，故Annexin V-FITC/PIAnnexin V-FITC/PI双双染法能区分活细胞、早期凋亡细胞和死亡细胞。染法能区分活细胞、早期凋亡细胞和死亡细胞。机械损伤细胞：机械损伤细胞：Annexin V-/PI+Annexin V-/PI+晚期凋亡、坏死细晚期凋亡、坏死细胞：胞：Annexin V Annexin V+/PI+/PI+早期凋亡细胞：早期凋亡细胞：Annexin V+/PI-Annexin V+/PI-活细胞：活细胞：Annexin V-/PI-Annexin V-/PI-TUNELTUNEL法：法：细胞凋亡时，双链细胞凋亡时，双链DNADNA会出现断裂点，即产会出现断裂点，即产生一系列生一系列3 3 端。在脱氧核糖核酸转移酶端。在脱氧核糖核酸转移酶(TdT)(TdT)催化的反应下，能将荧光素催化的反应下，能将荧光素-脱氧尿苷三磷酸脱氧尿苷三磷酸(dUTP)(dUTP)标记到断裂的标记到断裂的DNADNA末端，从而使凋亡的末端，从而使凋亡的细胞具有荧光。细胞具有荧光。HLA-B27HLA-B27淋巴细胞亚群淋巴细胞亚群（CD3CD3、CD4CD4、CD8CD8、CD16+56CD16+56、CD19CD19）白血病免疫分型（白血病免疫分型（CD2CD2、CD3CD3、CD13CD13、CD14CD14、CD33CD33、CD34CD34、CD117CD117、CD79aCD79a、cCD3cCD3、MPOMPO等）等）阵发性血红蛋白尿（阵发性血红蛋白尿（CD55CD55、CD59CD59）血小板活化指标（血小板活化指标（CD62PCD62P、CD63CD63）细胞周期分析细胞周期分析FCMFCM的临床检测项目的临床检测项目