酶联免疫吸附双抗体夹心法ppt课件

酶联免疫吸附双抗体夹心法酶联免疫吸附双抗体夹心法1优选酶酶联免疫吸附免疫吸附双抗体抗体夹心法心法优选酶联免疫吸附双抗体夹心法一、一、实验目的目的 1 掌握酶联免疫吸附实验（掌握酶联免疫吸附实验（ELISAELISA）的原理）的原理2 熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法一、实验目的 1 掌握酶联免疫吸附实验（ELI二、实验原理二、实验原理vv基础知识基础知识基础知识基础知识vv 1971 1971年瑞典学者年瑞典学者年瑞典学者年瑞典学者EngvailEngvail和和和和Perlmann,Perlmann,荷兰学者荷兰学者荷兰学者荷兰学者Van WeermanVan Weerman和和和和SchuursSchuurs分别报道将免疫技术发展分别报道将免疫技术发展分别报道将免疫技术发展分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法吸附测定法吸附测定法吸附测定法(enzymelinked immunosorbent assay (enzymelinked immunosorbent assay,ELISA),ELISA)。ELISAELISA现在已成为目前分析化学领域中的现在已成为目前分析化学领域中的现在已成为目前分析化学领域中的现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题前沿课题前沿课题前沿课题 ，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术技术技术技术(immunoenzymatic techniques)(immunoenzymatic techniques)的基础上的基础上的基础上的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。发展起来的一种新型的免疫测定技术。发展起来的一种新型的免疫测定技术。发展起来的一种新型的免疫测定技术。二、实验原理基础知识vv甲胎蛋白（甲胎蛋白（甲胎蛋白（甲胎蛋白（fetoprotein fetoprotein fetoprotein fetoprotein，AFPAFPAFPAFP）一种含一种含4%4%碳水化合物的碳水化合物的单链单链糖蛋白，分子量糖蛋白，分子量70KD70KD，半衰，半衰期期 5 5天，由天，由592 592 个氨基酸残基的个氨基酸残基的单肽链组单肽链组成。基因位于第成。基因位于第4 4对对染色体染色体4q1124q214q1124q21区域，由区域，由 15 15 个外个外显显子和子和1414个内含个内含子子组组成，属于血清中一种成，属于血清中一种 球蛋白，是一种胚胎性相关蛋球蛋白，是一种胚胎性相关蛋白。自白。自19631963年年发现发现以来，作以来，作为为一种一种肿肿瘤特异性抗原已广泛瘤特异性抗原已广泛应应用于用于临临床。它床。它对对原原发发性肝癌的早期性肝癌的早期诊诊断具有重要意断具有重要意义义，同同时对时对肝肝细细胞癌的胞癌的鉴别诊鉴别诊断，流行病学断，流行病学调查调查和理和理论论研究都研究都很有价很有价值值。甲胎蛋白（fetoprotein，AFP）v原理原理原理原理一一一一 ELISAELISA的基的基础础是抗原（或抗体）的固相化及抗原（或抗体）是抗原（或抗体）的固相化及抗原（或抗体）的的酶标记酶标记。结结合在固相合在固相载载体表面的抗原（或抗体）仍保持其免体表面的抗原（或抗体）仍保持其免疫学活性。疫学活性。v原理二原理二原理二原理二抗原抗原(或抗体或抗体)可通可通过过共价共价键键与与酶连酶连接形成接形成酶结酶结合物，而此种合物，而此种酶结酶结合物仍能保持其免疫学和合物仍能保持其免疫学和酶酶学活性。学活性。v原理三原理三原理三原理三固相上的固相上的酶酶量与量与标标本中受本中受检检物物质质的量呈一定的比例。加入的量呈一定的比例。加入酶酶反反应应的底物后，底物被的底物后，底物被酶酶催化成催化成为为有色有色产产物，物，产产物的量与物的量与标标本本中受中受检检物物质质的量直接相关，故可根据呈色的深浅的量直接相关，故可根据呈色的深浅进进行定性或定行定性或定量分析。由于量分析。由于酶酶的催化效率很高，的催化效率很高，间间接地放大了免疫反接地放大了免疫反应应的的结结果，使果，使测测定方法达到很高的敏感度。定方法达到很高的敏感度。ELISAELISA的三条基本原理的三条基本原理原理一ELISA的三条基本原理双抗体夹心法双抗体夹心法v方法方法方法方法v 用已知抗体包被，加入待测抗原，再加酶标抗用已知抗体包被，加入待测抗原，再加酶标抗用已知抗体包被，加入待测抗原，再加酶标抗用已知抗体包被，加入待测抗原，再加酶标抗体，加底物显色。体，加底物显色。体，加底物显色。体，加底物显色。v 固相固相固相固相(包被包被包被包被)抗体抗体抗体抗体Ab+Ab+样品样品样品样品(抗原抗原抗原抗原Ag)+Ag)+酶标酶标酶标酶标抗体抗体抗体抗体Ab*Ab*AbAgAb*+AbAgAb*+底物底物底物底物(TMB)(TMB)显色显色显色显色v应用应用应用应用v 这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要与包被于固相载体上的合的部位，因为其一端要与包被于固相载体上的合的部位，因为其一端要与包被于固相载体上的合的部位，因为其一端要与包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。用。用。用。双抗体夹心法方法双抗体夹心法图示双抗体夹心法图示1、已知抗体包 被于载体表面3、加酶标抗体 与抗原结合4、加酶作用的底物产生较深蓝色2、加肿瘤患者血清与抗体结合4、加酶作用的底物 无颜色或蓝色很淡双抗体双抗体夹心法心法测抗原抗原1、已知抗体包 被于载体表面2、加健康人血清与抗体结合3、加酶标抗体 无（少）抗原结合+-E EE EE EE EE EE EE EE EE E双抗体夹心法图示1、已知抗体包3、加酶标抗体4、加酶作用的底三、实验仪器三、实验仪器&试剂试剂v仪器 全自动酶标仪、全自动酶标洗板机三、实验仪器&试剂仪器v试剂试剂试剂试剂v 待测血清、抗待测血清、抗待测血清、抗待测血清、抗AFPL3 AFPL3 抗体、封闭蛋白溶液、抗体、封闭蛋白溶液、抗体、封闭蛋白溶液、抗体、封闭蛋白溶液、辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRPHRP）、底物四甲基联苯胺）、底物四甲基联苯胺）、底物四甲基联苯胺）、底物四甲基联苯胺（TMB)TMB)、显色液、终止液、显色液、终止液、显色液、终止液、显色液、终止液vOR:OR:甲胎蛋白（甲胎蛋白（甲胎蛋白（甲胎蛋白（AFPAFP）定量测定试剂盒（酶联免）定量测定试剂盒（酶联免）定量测定试剂盒（酶联免）定量测定试剂盒（酶联免疫法）疫法）疫法）疫法）试剂ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。2 熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法载体连接形成固相抗体然后在第三孔和第四孔中先各取50l 弃掉，再各取50l 分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；液后15 分钟以内进行。抗体待测抗原酶标记抗体加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。温育：用封板膜封板后置37温育30 分钟。或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。结合在固相载体表面的抗原（或抗体）仍保持其免疫学活性。（稀释后各孔加样量都为50l，浓度分别为（1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L）。（稀释后各孔加样量都为50l，浓度分别为（1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L）。标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10 孔，在第一、第二孔中分别加标准品100l，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50l，混匀；混匀后从第五、第六中各取50l 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50，混匀后从第七、第八孔中分别取50l 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50l，混匀后从第九第十孔中各取50l 弃掉。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40l，然后再加待测样品10l（样品最终稀释度为5 倍）。混匀后从第五、第六中各取50l 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50，混匀后从第七、第八孔中分别取50l 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50l，混匀后从第九第十孔中各取50l 弃掉。四、实验步骤四、实验步骤获得得AFP未未标定抗体定抗体将将AFP抗体与固相抗体与固相载体体连接形成固相抗体接形成固相抗体 洗洗涤除去未除去未结合的合的抗体及抗体及杂质 加入封加入封闭蛋白溶液以封蛋白溶液以封闭载体体表面残留的蛋白表面残留的蛋白结合位点合位点洗洗涤并除去未并除去未结合的封合的封闭蛋白蛋白加血清形成加血清形成固相抗体抗原复合物固相抗体抗原复合物ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种洗洗涤除去其他除去其他未未结合的物合的物质 加加HRP酶标抗体生成抗体生成抗体抗体待待测抗原抗原酶标记抗体抗体的复合物的复合物 彻底洗底洗涤未未结合合 的的HRP酶标抗体抗体 加底物四甲基加底物四甲基联苯胺苯胺(TMB)进行行酶催化反催化反应 根据根据颜色反色反应的程度的程度进行行AFP的定量的定量测定定洗涤除去其他加HRP酶标抗体生成彻底洗涤未结合加底物四甲基联详细步骤详细步骤1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10 孔，在第一、第二孔中分别加标准品100l，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50l，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100l 分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50l，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50l 弃掉，再各取50l 分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六中各取50l 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50，混匀后从第七、第八孔中分别取50l 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50l，混匀后从第九第十孔中各取50l 弃掉。（稀释后各孔加样量都为50l，浓度分别为（1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L）。详细步骤1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔12.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40l，然后再加待测样品10l（样品最终稀释度为5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3.温育：用封板膜封板后置37温育30 分钟。4.配液：将20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水20 倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复5 次，拍干。6.加酶：每孔加入酶标试剂50l，空白孔除外。7.温育：操作同3。8.洗涤：操作同5。9.显色：每孔先加入显色剂A50l，再加入显色剂B50l，轻轻震荡混匀，37避光显色15 分钟.10.终止：每孔加终止液50l，终止反应（此时蓝色立转黄色）。11.测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。测定应在加终止液后15 分钟以内进行。2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP)(HRP)常用底物：常用底物：(1)邻苯二胺苯二胺(OPD)：反：反应显橙黄色，橙黄色，应避光，致癌性。避光，致癌性。(2)四甲基四甲基联苯胺苯胺(TMB)：TMBTMB是一种脂溶性是一种脂溶性较强的基的基团，由于由于这种高度的脂溶性，使其易形成多聚体，在种高度的脂溶性，使其易形成多聚体，在HRPHRP活性活性部位部位产生粗大的、深生粗大的、深蓝色沉淀物反色沉淀物反应后呈后呈蓝色。色。酶反反应用用HCL或或H2SO4终止后，止后，TMB产物由物由蓝色呈黄色，最适吸色呈黄色，最适吸收波收波长为 450nm。辣根过氧化物酶(HRP)常用底物：五、结果分析五、结果分析以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。五、结果分析以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标（稀释后各孔加样量都为50l，浓度分别为（1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L）。抗体待测抗原酶标记抗体（稀释后各孔加样量都为50l，浓度分别为（1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L）。加底物四甲基联苯胺(TMB)抗原(或抗体)可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性。或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。表面残留的蛋白结合位点表面残留的蛋白结合位点结合在固相载体表面的抗原（或抗体）仍保持其免疫学活性。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40l，然后再加待测样品10l（样品最终稀释度为5 倍）。（稀释后各孔加样量都为50l，浓度分别为（1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L）。显色：每孔先加入显色剂A50l，再加入显色剂B50l，轻轻震荡混匀，37避光显色15 分钟.基因位于第4对染色体4q1124q21区域，由 15 个外显子和14个内含子组成，属于血清中一种球蛋白，是一种胚胎性相关蛋白。待测血清、抗AFPL3 抗体、封闭蛋白溶液、辣根过氧化物酶（HRP）、底物四甲基联苯胺（TMB)、显色液、终止液洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复5 次，拍干。表面残留的蛋白结合位点优选酶联免疫吸附双抗体夹心法(2)四甲基联苯胺(TMB)：TMB是一种脂溶性较强的基团，由于这种高度的脂溶性，使其易形成多聚体，在HRP活性部位产生粗大的、深蓝色沉淀物反应后呈蓝色。(2)四甲基联苯胺(TMB)：TMB是一种脂溶性较强的基团，由于这种高度的脂溶性，使其易形成多聚体，在HRP活性部位产生粗大的、深蓝色沉淀物反应后呈蓝色。（稀释后各孔加样量都为50l，浓度分别为（1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L）。试验中哪些因素可能会对实验结果造成影响？在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40l，然后再加待测样品10l（样品最终稀释度为5 倍）。或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。(2)四甲基联苯胺(TMB)：TMB是一种脂溶性较强的基团，由于这种高度的脂溶性，使其易形成多聚体，在HRP活性部位产生粗大的、深蓝色沉淀物反应后呈蓝色。全自动酶标仪、全自动酶标洗板机液后15 分钟以内进行。辣根过氧化物酶(HRP)优选酶联免疫吸附双抗体夹心法加底物四甲基联苯胺(TMB)在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40l，然后再加待测样品10l（样品最终稀释度为5 倍）。（稀释后各孔加样量都为50l，浓度分别为（1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L）。（稀释后各孔加样量都为50l，浓度分别为（1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L）。抗体待测抗原酶标记抗体加底物四甲基联苯胺(TMB)酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，最适吸收波长为 450nm。（稀释后各孔加样量都为50l，浓度分别为（1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L）。测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。抗体待测抗原酶标记抗体显色：每孔先加入显色剂A50l，再加入显色剂B50l，轻轻震荡混匀，37避光显色15 分钟.混匀后从第五、第六中各取50l 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50，混匀后从第七、第八孔中分别取50l 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50l，混匀后从第九第十孔中各取50l 弃掉。加酶：每孔加入酶标试剂50l，空白孔除外。固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10 孔，在第一、第二孔中分别加标准品100l，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50l，混匀；结合在固相载体表面的抗原（或抗体）仍保持其免疫学活性。抗原(或抗体)可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性。表面残留的蛋白结合位点(2)四甲基联苯胺(TMB)：TMB是一种脂溶性较强的基团，由于这种高度的脂溶性，使其易形成多聚体，在HRP活性部位产生粗大的、深蓝色沉淀物反应后呈蓝色。混匀后从第五、第六中各取50l 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50，混匀后从第七、第八孔中分别取50l 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50l，混匀后从第九第十孔中各取50l 弃掉。（稀释后各孔加样量都为50l，浓度分别为（1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L）。（稀释后各孔加样量都为50l，浓度分别为（1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L）。抗体待测抗原酶标记抗体加底物四甲基联苯胺(TMB)加底物四甲基联苯胺(TMB)混匀后从第五、第六中各取50l 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50，混匀后从第七、第八孔中分别取50l 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50l，混匀后从第九第十孔中各取50l 弃掉。液后15 分钟以内进行。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40l，然后再加待测样品10l（样品最终稀释度为5 倍）。加底物四甲基联苯胺(TMB)全自动酶标仪、全自动酶标洗板机然后在第三孔和第四孔中先各取50l 弃掉，再各取50l 分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。（稀释后各孔加样量都为50l，浓度分别为（1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。表面残留的蛋白结合位点加底物四甲基联苯胺(TMB)酶联免疫吸附双抗体夹心法2 熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10 孔，在第一、第二孔中分别加标准品100l，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50l，混匀；显色：每孔先加入显色剂A50l，再加入显色剂B50l，轻轻震荡混匀，37避光显色15 分钟.结合在固相载体表面的抗原（或抗体）仍保持其免疫学活性。液后15 分钟以内进行。结合在固相载体表面的抗原（或抗体）仍保持其免疫学活性。2 熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法然后在第三孔和第四孔中先各取50l 弃掉，再各取50l 分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；显色：每孔先加入显色剂A50l，再加入显色剂B50l，轻轻震荡混匀，37避光显色15 分钟.结合在固相载体表面的抗原（或抗体）仍保持其免疫学活性。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40l，然后再加待测样品10l（样品最终稀释度为5 倍）。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40l，然后再加待测样品10l（样品最终稀释度为5 倍）。酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，最适吸收波长为 450nm。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。待测血清、抗AFPL3 抗体、封闭蛋白溶液、辣根过氧化物酶（HRP）、底物四甲基联苯胺（TMB)、显色液、终止液抗体待测抗原酶标记抗体(五）洗涤剂与稀释剂加底物四甲基联苯胺(TMB)标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10 孔，在第一、第二孔中分别加标准品100l，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50l，混匀；（稀释后各孔加样量都为50l，浓度分别为（1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L）。一种含4%碳水化合物的单链糖蛋白，分子量70KD，半衰期 5天，由592 个氨基酸残基的单肽链组成。然后在第三孔和第四孔中先各取50l 弃掉，再各取50l 分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六中各取50l 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50，混匀后从第七、第八孔中分别取50l 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50l，混匀后从第九第十孔中各取50l 弃掉。混匀后从第五、第六中各取50l 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50，混匀后从第七、第八孔中分别取50l 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50l，混匀后从第九第十孔中各取50l 弃掉。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40l，然后再加待测样品10l（样品最终稀释度为5 倍）。（稀释后各孔加样量都为50l，浓度分别为（1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L）。(五）洗涤剂与稀释剂显色：每孔先加入显色剂A50l，再加入显色剂B50l，轻轻震荡混匀，37避光显色15 分钟.自1963年发现以来，作为一种肿瘤特异性抗原已广泛应用于临床。测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。载体连接形成固相抗体表面残留的蛋白结合位点(1)邻苯二胺(OPD)：反应显橙黄色，应避光，致癌性。加底物四甲基联苯胺(TMB)六、思考题六、思考题试验试验中哪些因素可能会中哪些因素可能会中哪些因素可能会中哪些因素可能会对实验结对实验结果造成影响？果造成影响？果造成影响？果造成影响？（一）固相载体（二）抗原（三）试验样品（四）结合物 (五）洗涤剂与稀释剂（六）底物（七）作用时间 (八)试验的重复性（精确度）（九）对使用仪器要求（稀释后各孔加样量都为50l，浓度分别为（1800ng/L