线性范围评估的指南课件

线性范围评估指南线性范围评估指南郑金来线性范围评估指南郑金来前言p线性范围评估资料是评价拟上市产品有效线性范围评估资料是评价拟上市产品有效性的重要依据，也是产品注册所需的重要性的重要依据，也是产品注册所需的重要申报资料之一申报资料之一p依据国家食品药品监督管理局依据国家食品药品监督管理局体外诊断体外诊断试剂注册管理办法（试行）试剂注册管理办法（试行）、中华人中华人民共和国卫生行业标准民共和国卫生行业标准-定量测定方法的定量测定方法的线性评价线性评价的有关要求，参考的有关要求，参考CLSI有关标有关标准准前言线性范围评估资料是评价拟上市产品有效性的重要依据，也是产线性范围评估的基本原则p实验操作人员应熟悉方法原理与操作，能实验操作人员应熟悉方法原理与操作，能对样本进行正确处理，确保仪器工作状态对样本进行正确处理，确保仪器工作状态正常，采用适当的校准品对仪器进行校准。正常，采用适当的校准品对仪器进行校准。p仪器的各项性能指标（如精密度）应与标仪器的各项性能指标（如精密度）应与标称值相符，不存在明显的携带污染等。称值相符，不存在明显的携带污染等。p应使用同批号试剂及校准品。应使用同批号试剂及校准品。线性范围评估的基本原则实验操作人员应熟悉方法原理与操作，能对线性范围的评估及数据处理方法p实验样本的基本要求实验样本的基本要求p样本基质应与临床实验样本相似，但不可采用含有对样本基质应与临床实验样本相似，但不可采用含有对测定方法具有明确干扰作用物质的样本，如溶血、脂测定方法具有明确干扰作用物质的样本，如溶血、脂血、黄疸或含有某些特定药物的样本。进行血清学标血、黄疸或含有某些特定药物的样本。进行血清学标志物检测时，理想的样本为分析物浓度接近预期测定志物检测时，理想的样本为分析物浓度接近预期测定上限的混合人血清。上限的混合人血清。p建立一种定量测定方法的线性范围时，需在预期测定建立一种定量测定方法的线性范围时，需在预期测定范围内选择范围内选择7-11个浓度水平。如将预期测定范围加宽至个浓度水平。如将预期测定范围加宽至130%，在此范围内选择更多的浓度水平，然后依据实，在此范围内选择更多的浓度水平，然后依据实验结果逐渐减少数据点直至表现出线性关系，可发现验结果逐渐减少数据点直至表现出线性关系，可发现最宽的线性范围。最宽的线性范围。线性范围的评估及数据处理方法实验样本的基本要求线性范围的评估及数据处理方法p实验样本的基本要求实验样本的基本要求p对标称线性参数进行验证时，需在已知线性范对标称线性参数进行验证时，需在已知线性范围内选择围内选择5-7个浓度水平。个浓度水平。p无论是建立或验证线性范围，所选用的浓度水无论是建立或验证线性范围，所选用的浓度水平应可覆盖整个预期测定范围并包括与临床有平应可覆盖整个预期测定范围并包括与临床有关的重要评价浓度，如最小测定浓度或线性范关的重要评价浓度，如最小测定浓度或线性范围的最低限、不同的医学决定水平、最大测定围的最低限、不同的医学决定水平、最大测定浓度或线性范围的高限等。浓度或线性范围的高限等。线性范围的评估及数据处理方法实验样本的基本要求线性范围的评估及数据处理方法p实验样本的制备方法实验样本的制备方法p不同浓度水平的样本可通过将高浓度样本与低浓度样不同浓度水平的样本可通过将高浓度样本与低浓度样本进行倍比稀释得到，注意在进行液体吸取时应选择本进行倍比稀释得到，注意在进行液体吸取时应选择精密度与准确性好的移液装置。制备时应将样本完全精密度与准确性好的移液装置。制备时应将样本完全混合并避免蒸发或其他使样本变质的情况。每份样本混合并避免蒸发或其他使样本变质的情况。每份样本的浓度与体积单位应统一。的浓度与体积单位应统一。p如果高如果高/低浓度血清的值未知，可将每种血清编码，用低浓度血清的值未知，可将每种血清编码，用编码代表每个血清的相对浓度。对于等浓度间隔样本，编码代表每个血清的相对浓度。对于等浓度间隔样本，可用连续整数（如可用连续整数（如1、2、3、4、5）代表连续样本。进）代表连续样本。进行数据处理时可用样本号代替行数据处理时可用样本号代替X值。值。线性范围的评估及数据处理方法实验样本的制备方法线性范围的评估及数据处理方法p实验样本的制备方法实验样本的制备方法样本号样本号123456低浓度血清(ml)1.000.900.800.700.600.50高浓度血清(ml)0.000.100.200.300.400.50样本号样本号7891011低浓度血清(ml)0.400.300.200.100.00高浓度血清(ml)0.600.700.800.901.00线性范围的评估及数据处理方法实验样本的制备方法样本号1234线性范围的评估及数据处理方法p实验样本的制备方法实验样本的制备方法样本号样本号12345低浓度血清(ml)1.000.750.500.250.00高浓度血清(ml)0.000.250.500.751.00线性范围的评估及数据处理方法实验样本的制备方法样本号1234线性范围的评估及数据处理方法p实验样本的制备方法实验样本的制备方法p样本的特殊处理：在无法得到适用的人血清时，需对样本的特殊处理：在无法得到适用的人血清时，需对样本进行一些特殊处理以满足实验要求。这些处理过样本进行一些特殊处理以满足实验要求。这些处理过程包括稀释、加入添加物或透析、热处理等，无论进程包括稀释、加入添加物或透析、热处理等，无论进行何种处理均应以保持基质恒定为基本原则。在评价行何种处理均应以保持基质恒定为基本原则。在评价报告中应对所使用的稀释液、添加物、溶剂等的材料报告中应对所使用的稀释液、添加物、溶剂等的材料来源加以注明。来源加以注明。p样本稀释液应选用由厂家推荐或经实验室证明可使用样本稀释液应选用由厂家推荐或经实验室证明可使用的产品，如可采用的产品，如可采用5%牛血清白蛋白或人白蛋白溶液。牛血清白蛋白或人白蛋白溶液。p欲提高样本浓度时可在样本中添加分析物纯品。在添欲提高样本浓度时可在样本中添加分析物纯品。在添加物为溶液状态时，应注意添加液体对样本的稀释作加物为溶液状态时，应注意添加液体对样本的稀释作用（小于用（小于10%）并注明所用溶剂）并注明所用溶剂线性范围的评估及数据处理方法实验样本的制备方法线性范围的评估及数据处理方法p实验过程实验过程p建立线性范围：需测定建立线性范围：需测定9-11个浓度水平，每个个浓度水平，每个浓度水平重复测定浓度水平重复测定3-4次。次。p验证标称线性参数：需测定验证标称线性参数：需测定4-6个浓度水平，每个浓度水平，每个浓度水平重复测定个浓度水平重复测定3-4次。次。p所有样本应在一次运行中或几次间隔很短的运所有样本应在一次运行中或几次间隔很短的运行中随机测定，最好在一天之内完成行中随机测定，最好在一天之内完成线性范围的评估及数据处理方法实验过程线性范围的评估及数据处理方法p数据记录数据记录项目：项目：样品：样品：仪器：仪器：试剂试剂/批号：批号：校准品校准品/批号：批号：操作者：操作者：审核者：审核者：测定日期：测定日期：样本号样本号测定测定1测定测定2测定测定3测定测定4均值均值1234567891011线性范围的评估及数据处理方法数据记录项目：样品：仪器：试剂/线性范围的评估及数据处理方法p数据可用性检查数据可用性检查p可通过绘制散点图对测定数据的可用性进行初步检查。可通过绘制散点图对测定数据的可用性进行初步检查。p以样本号或样本浓度为以样本号或样本浓度为X轴，以测定结果为轴，以测定结果为Y轴做图，轴做图，在图上标出针对每个样本的测定值及每个浓度水平的在图上标出针对每个样本的测定值及每个浓度水平的测定均值，手工或用计算机做图将均值点相连测定均值，手工或用计算机做图将均值点相连p观察数据点与直线间的偏差，如偏差过大，表明数据观察数据点与直线间的偏差，如偏差过大，表明数据组存在明显非线性，需要对测定过程进行检查，排除组存在明显非线性，需要对测定过程进行检查，排除因操作错误所至误差，并对样本进行重新测定。如图因操作错误所至误差，并对样本进行重新测定。如图形与直线接近，表明可对数据组继续进行统计分析。形与直线接近，表明可对数据组继续进行统计分析。线性范围的评估及数据处理方法数据可用性检查线性范围的评估及数据处理方法p剔除离群值剔除离群值p离群值可由散点图初步判断，标准中建议采用格拉布离群值可由散点图初步判断，标准中建议采用格拉布斯（斯（GRUBBS）法进行离群值检验。检验步骤如下）法进行离群值检验。检验步骤如下:p每组数据中有每组数据中有4个测定结果，将个测定结果，将4个测定值按大小顺序个测定值按大小顺序排列排列,最大值记为最大值记为max,最小值记为最小值记为 min;p计算均值和标准差计算均值和标准差S，根据可疑值，根据可疑值max或或min分别按下分别按下式计算统计量式计算统计量t:t1=(max-均值均值)/S，t2=(min-均值均值)/Sp根据给定的显著性水平根据给定的显著性水平a和重复测定次数查表得临界值和重复测定次数查表得临界值;如如t值大于临界值，则相应的可疑值为离群值。值大于临界值，则相应的可疑值为离群值。线性范围的评估及数据处理方法剔除离群值线性范围的评估及数据处理方法p剔除离群值：剔除离群值：pGrubbs检验临界值检验临界值(Ta)值表值表样本数显著性水平样本数显著性水平30.050.0250.010.00540.050.0250.010.0051.1531.1551.1551.1551.4631.4811.4921.496线性范围的评估及数据处理方法剔除离群值：样本数显著性水平样本线性范围的评估及数据处理方法p对回归方程进行线性检验对回归方程进行线性检验p多元回归方程中以多元回归方程中以bi表示的系数为回归系数。表示的系数为回归系数。p在二级与三级方程中，在二级与三级方程中，b2与与b3为非线性系数。为非线性系数。p对回归方程进行线性检验就是对每个非线性系数作对回归方程进行线性检验就是对每个非线性系数作t检检验，判断回归系数与零是否有显著性差异。验，判断回归系数与零是否有显著性差异。pb0与与b1不反映非线性，故不需对其进行检验不反映非线性，故不需对其进行检验线性范围的评估及数据处理方法对回归方程进行线性检验线性范围的评估及数据处理方法p对回归方程进行线性检验对回归方程进行线性检验p计算统计量计算统计量t，计算公式为：，计算公式为：t=bi/SEip其中，其中，SEi 为每个非线性系数的斜率标准误为每个非线性系数的斜率标准误pY为回归方程预测值，与为回归方程预测值，与 为测定均值为测定均值 p由公式由公式df=L*R-Rdf 计算自由度，计算自由度，L为样本数，为样本数，R为每为每个样本的测定次数，个样本的测定次数，Rdf为回归自由度，即回归方程中为回归自由度，即回归方程中系数（包括系数（包括b0）的个数）的个数线性范围的评估及数据处理方法对回归方程进行线性检验线性范围的评估及数据处理方法p对回归方程进行线性检验对回归方程进行线性检验p在在t值表中寻找值表中寻找t界值（双边检验，界值（双边检验，=0.05），将计算出），将计算出的的t值与界值比较值与界值比较p如如p0.05，表示非线性系数与零无显著性差异，数据组，表示非线性系数与零无显著性差异，数据组被认为具线性，此时可对数据组进行精密度检验，具被认为具线性，此时可对数据组进行精密度检验，具体方法见后。当精密度符合线性判断要求时，数据分体方法见后。当精密度符合线性判断要求时，数据分析可结束。析可结束。p如如p0.05，表示此非线性系数具有统计学显著性，数据，表示此非线性系数具有统计学显著性，数据组为非线性，此时应进行临床标准的线性与非线性检组为非线性，此时应进行临床标准的线性与非线性检验验线性范围的评估及数据处理方法对回归方程进行线性检验线性范围的评估及数据处理方法p临床标准的线性与非线性检验临床标准的线性与非线性检验p上述多项式回归分析主要是利用统计学方法进行线性上述多项式回归分析主要是利用统计学方法进行线性判断，统计学标准的线性可称为一阶线性，对数据组判断，统计学标准的线性可称为一阶线性，对数据组的要求很高。的要求很高。p对于在临床实验室中使用的测定方法，在其临床应用对于在临床实验室中使用的测定方法，在其临床应用实践中允许有一定的非线性误差，此时通过对统计学实践中允许有一定的非线性误差，此时通过对统计学标准的非线性作程度判断，可得到临床标准的线性，标准的非线性作程度判断，可得到临床标准的线性，即二阶线性即二阶线性p临床标准的线性检验中使用了两个统计量，临床标准的线性检验中使用了两个统计量，ADL（偏（偏离直线平均差异离直线平均差异average deviation from linearity）与）与PctBnd（百分区界（百分区界 percent bound）线性范围的评估及数据处理方法临床标准的线性与非线性检验线性范围的评估及数据处理方法p临床标准的线性与非线性检验临床标准的线性与非线性检验p对于大多数分析物对于大多数分析物PctBnd取取5%。如。如ADL小于所要求的小于所要求的临界判断值，则可认为数据组具有临床可接受的线性，临界判断值，则可认为数据组具有临床可接受的线性，所拟合出的最适非线性多项式无临床意义所拟合出的最适非线性多项式无临床意义pADL表示最优拟合曲线与直线的平均差异表示最优拟合曲线与直线的平均差异 线性范围的评估及数据处理方法临床标准的线性与非线性检验线性范围的评估及数据处理方法p临床标准的线性与非线性检验临床标准的线性与非线性检验p对于大多数分析物对于大多数分析物PctBnd取取5%。如。如ADL小于所要求的小于所要求的临界判断值，则可认为数据组具有临床可接受的线性，临界判断值，则可认为数据组具有临床可接受的线性，所拟合出的最适非线性多项式无临床意义所拟合出的最适非线性多项式无临床意义pADL表示最优拟合曲线与直线的平均差异表示最优拟合曲线与直线的平均差异 线性范围的评估及数据处理方法临床标准的线性与非线性检验线性范围的评估及数据处理方法p临床标准的线性与非线性检验临床标准的线性与非线性检验p一般设定一般设定ADL小于小于5%为临床允许误差，即取为临床允许误差，即取PctBnd为为5%，通过查表（附录，通过查表（附录A和和B）得到）得到ADL临界值。临界值。p如如ADL小于临界值，可认为多项式具有临床可接受的小于临界值，可认为多项式具有临床可接受的非线性，为二阶线性。如非线性，为二阶线性。如ADL大于临界值，则为临床大于临界值，则为临床不可接受的非线性不可接受的非线性 线性范围的评估及数据处理方法临床标准的线性与非线性检验线性范围的评估及数据处理方法p临床标准的线临床标准的线性与非线性检性与非线性检验验线性范围的评估及数据处理方法临床标准的线性与非线性检验线性范围的评估及数据处理方法p临床标准的线临床标准的线性与非线性检性与非线性检验验线性范围的评估及数据处理方法临床标准的线性与非线性检验线性范围的评估及数据处理方法p对数据组进行精密度检验对数据组进行精密度检验p测量数据的精密度可直接影响多项式回归分析的结果，测量数据的精密度可直接影响多项式回归分析的结果，为提高统计功效，需对数据组进行精密度检验为提高统计功效，需对数据组进行精密度检验p计算最优拟合方程的回归标准误（计算最优拟合方程的回归标准误（）线性范围的评估及数据处理方法对数据组进行精密度检验线性范围的评估及数据处理方法p对数据组进行精密度检验对数据组进行精密度检验p用最优拟合方程的回归标准误（用最优拟合方程的回归标准误（）与总平均浓度）与总平均浓度()的的百分比代表不精密度百分比代表不精密度p跟据以下公式进行判断跟据以下公式进行判断线性范围的评估及数据处理方法对数据组进行精密度检验线性范围的评估及数据处理方法p对数据组进行精密度检验对数据组进行精密度检验p不精密度满足判断式时不精密度满足判断式时,说明数据的精密度好可作线性说明数据的精密度好可作线性评价。评价。p反之则表示数据的精密度差，不能作线性评价。反之则表示数据的精密度差，不能作线性评价。p当当PctBnd取取5%时时,尚可通过查不精密度和临界值表判尚可通过查不精密度和临界值表判断数据是否精密断数据是否精密(附表附表A和和B),如此时不精密度对应的临如此时不精密度对应的临界值显示界值显示P,表明测量数据的精密度不符合作线性判断表明测量数据的精密度不符合作线性判断的要求的要求线性范围的评估及数据处理方法对数据组进行精密度检验线性范围的评估及数据处理方法p结果报告结果报告p线性范围报告的具体格式不要求，但至少应包括以下线性范围报告的具体格式不要求，但至少应包括以下几方面：几方面：p进行线性评价的实验室或生产厂家名称。进行线性评价的实验室或生产厂家名称。p被评价的方法或试剂名称，批号。被评价的方法或试剂名称，批号。p测定项目。测定项目。p线性范围（如为二阶线性应包括临床允许误差）。线性范围（如为二阶线性应包括临床允许误差）。p如可能应标出测定项目的医学决定水平及在此水平处如可能应标出测定项目的医学决定水平及在此水平处的临床允许误差。的临床允许误差。线性范围的评估及数据处理方法结果报告知识回顾知识回顾Knowledge Knowledge ReviewReview知识回顾Knowledge Review