免疫分析技术之ELISA课件

免疫分析技术之ELISA王娟免疫分析技术之ELISA王娟1 1免疫学检测技术免疫学检测技术细胞水平细胞水平分子水平分子水平基因水平基因水平体外（或体内）测定体外（或体内）测定各类细胞及其亚群的各类细胞及其亚群的数量和效应，从而了数量和效应，从而了解机体的细胞免疫水解机体的细胞免疫水平平测测定定各各类类免免疫疫球球蛋蛋白白、补补体体、细细胞胞因因子子及及其其受受体体、黏黏附附分分子子的的表表达达水水平平和和生生物物活活性性，从从而而了了解解机机体体免免疫疫因因子间的相互关系子间的相互关系测定免疫应答相关基测定免疫应答相关基因的表达与调控、免因的表达与调控、免疫分子的遗传多态性疫分子的遗传多态性及基因型别分析及基因型别分析免疫学检测技术细胞水平分子水平基因水平体外（或体内）测定各类2 2ELISA 概念酶联免疫吸附免疫吸附实验（EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay，ELISA），），是在免疫是在免疫酶技技术(immunoenzymatictechniques)上上发展起来的一展起来的一种新型免疫种新型免疫测定技定技术，基，基础是：是：抗原或抗体的抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入。加入酶反反应的的底物后，底物被底物后，底物被酶催化成催化成为有色有色产物，物，产物的物的量与量与标本中受本中受检物物质的量直接相关，由此的量直接相关，由此进行行定性或定量分析。定性或定量分析。ELISA概念酶联免疫吸附实验（EnzymeLinked3 3免疫分析技术之ELISA课件4 4免疫分析技术之ELISA课件5 51.1.21.1.2特异性特异性 抗原抗体的抗原抗体的结合合发生在抗原的决定簇与抗体的生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之合位点之间。化学化学结构和空构和空间构型互构型互补关系，具有高度的特异性。关系，具有高度的特异性。测定某一特定的物定某一特定的物质，而不需先分离待，而不需先分离待检物。物。1.1.2特异性抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与6 61.1.31.1.3敏感性敏感性化学比色法的敏感度化学比色法的敏感度为mg/mlmg/ml水平水平酶反反应测定法的敏感度定法的敏感度约为5-10g/ml5-10g/ml免疫免疫测定中凝胶定中凝胶扩散法和散法和浊度法的敏感度与度法的敏感度与酶反反应法相仿法相仿标记的免疫敏感度可提高数千倍，达的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/mlng/ml水平水平例如，例如，HBsAgHBsAg，其敏感度可达，其敏感度可达0.1ng/ml0.1ng/ml。1.1.3敏感性化学比色法的敏感度为mg/ml水平7 71.21.2免疫测定在临床检验中的应用免疫测定在临床检验中的应用由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特特异性的抗血清或异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可就可检测标本中相本中相应的抗原，因此免疫的抗原，因此免疫测定的定的应用范用范围极广。极广。1.2免疫测定在临床检验中的应用8 8基本原理基本原理使抗原或抗体使抗原或抗体使抗原或抗体使抗原或抗体结结合到某种固相合到某种固相合到某种固相合到某种固相载载体表面，并保持其免疫活性。体表面，并保持其免疫活性。体表面，并保持其免疫活性。体表面，并保持其免疫活性。使使使使抗抗抗抗原原原原或或或或抗抗抗抗体体体体与与与与某某某某种种种种酶酶连连接接接接成成成成酶酶标标抗抗抗抗原原原原或或或或抗抗抗抗体体体体，这这种种种种酶酶标标抗抗抗抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留原或抗体既保留其免疫活性，又保留原或抗体既保留其免疫活性，又保留原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶酶的活性。的活性。的活性。的活性。在在在在测测定定定定时时，把把把把受受受受检检标标本本本本（测测定定定定其其其其中中中中的的的的抗抗抗抗体体体体或或或或抗抗抗抗原原原原）和和和和酶酶标标抗抗抗抗原原原原或或或或抗抗抗抗体体体体按按按按不不不不同同同同的的的的步步步步骤骤与与与与固固固固相相相相载载体体体体表表表表面面面面的的的的抗抗抗抗原原原原或或或或抗抗抗抗体体体体起起起起反反反反应应。用用用用洗洗洗洗涤涤的的的的方方方方法法法法使使使使固固固固相相相相载载体体体体上上上上形形形形成成成成的的的的抗抗抗抗原原原原抗抗抗抗体体体体复复复复合合合合物物物物与与与与其其其其他他他他物物物物质质分分分分开开开开，最最最最后后后后结结合合合合在在在在固固固固相相相相载载体体体体上上上上的的的的酶酶量量量量与与与与标标本本本本中中中中受受受受检检物物物物质质的的的的量量量量成成成成一一一一定定定定的的的的比比比比例例例例。加加加加入入入入酶酶反反反反应应的的的的底底底底物物物物后后后后，底底底底物物物物被被被被酶酶催催催催化化化化变变为为有有有有色色色色产产物物物物，产产物物物物的的的的量量量量与与与与标标本本本本中中中中受受受受检检物物物物质质的的的的量量量量直直直直接接接接相相相相关关关关，故故故故可可可可根据根据根据根据颜颜色反色反色反色反应应的深浅的深浅的深浅的深浅进进行定性或定量分析。行定性或定量分析。行定性或定量分析。行定性或定量分析。由由由由于于于于酶酶的的的的催催催催化化化化频频率率率率很很很很高高高高，故故故故可可可可极极极极大大大大地地地地地地地地放放放放大大大大反反反反应应效效效效果果果果，从从从从而而而而使使使使测测定方法达到很高的敏感度。定方法达到很高的敏感度。定方法达到很高的敏感度。定方法达到很高的敏感度。基本原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活9 92ELISA的类型的类型ELISA可用于可用于测定抗原，也可用于定抗原，也可用于测定抗体。在定抗体。在这种种测定方法定方法中有三个必要的中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即）固相的抗原或抗体，即免疫吸附免疫吸附剂（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称的抗原或抗体，称为结合物合物（conjugate）；（3）酶反反应的底物。的底物。可可设计出各种不同出各种不同类型的型的检测方法。方法。2ELISA的类型ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗10102.1双抗体双抗体夹心法心法测抗原抗原A.将抗体吸附于固相表面；将抗体吸附于固相表面；B.加抗原，形成抗原加抗原，形成抗原-抗体复合物；抗体复合物；C.加加酶标抗体；抗体；D.加底物。底物的降解量抗原量。加底物。底物的降解量抗原量。此此法法适适用用于于检测各各种种蛋蛋白白质等等大大分分子子抗抗原原，例例如如HBsAg、HBeAg、AFP等等。只只要要获得得针对受受检抗抗原原的的特特异异性性抗抗体体，就就可用于包被固相可用于包被固相载体和制体和制备酶结合物而建立此法。合物而建立此法。2.1双抗体夹心法测抗原A.将抗体吸附于固相表11112.2双抗原双抗原夹心法心法测抗体抗体用特异性抗原用特异性抗原进行包被和制行包被和制备酶结合物。此法中受合物。此法中受检标本本不需稀不需稀释，可直接用于，可直接用于测定，因此其敏感度相定，因此其敏感度相对高于高于间接法。接法。乙肝乙肝标志物中抗志物中抗HBsAg的的检测常采用本法。本法关常采用本法。本法关键在于在于酶标抗原的制抗原的制备，应根据抗原根据抗原结构的不同，构的不同，寻找合适的找合适的标记方方法。法。2.2双抗原夹心法测抗体用特异性抗原进行包被和制备12122.3间接法接法测抗体抗体 传染病的染病的诊断。断。间接法的接法的优点是只要点是只要变换包被抗原就可利用同一包被抗原就可利用同一酶标抗抗抗体建立抗体建立检测相相应抗体的方法抗体的方法。A.将抗原吸附于固相将抗原吸附于固相载体表面；体表面；B.加抗体加抗体,形成抗原形成抗原-抗体复合物抗体复合物;C.加加酶标抗体；抗体；D.加底物。加底物。测定底物的降解量抗体量定底物的降解量抗体量2.3间接法测抗体传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包13132.4 2.4 竞争法测抗体竞争法测抗体 当抗原材料中的干当抗原材料中的干扰物物质不易除去，或不易得到足不易除去，或不易得到足够的的纯化化抗原抗原时，可用此法，可用此法检测特异性抗体。特异性抗体。2.4竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易14142.5 2.5 竞争法测抗原竞争法测抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体因此不能用双抗体夹心法心法进行行测定，可以采用定，可以采用竞争法模式。争法模式。其原理是其原理是标本中的抗原和一定量的本中的抗原和一定量的酶标抗原抗原竞争与固相抗争与固相抗体体结合。合。标本中抗原量含量愈多，本中抗原量含量愈多，结合在固相上的合在固相上的酶标抗抗原愈少，最后的原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、色也愈浅。小分子激素、药物等物等ELISAELISA测定多用此法。定多用此法。2.5竞争法测抗原小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的15152.6 2.6 捕获包被法测抗体捕获包被法测抗体IgM的的检测常用于常用于传染病的染病的诊断。用抗人断。用抗人IgM抗体包被固抗体包被固相，以捕相，以捕获血清血清标本中的本中的IgM（其中包括（其中包括针对抗原的特异抗原的特异性性IgM抗体和非特异性的抗体和非特异性的IgM）。此法常用于病毒性感染）。此法常用于病毒性感染的早期的早期诊断。断。2.6捕获包被法测抗体IgM的检测常用于传染病的诊断。用抗16162.7 ABS-ELISA2.7 ABS-ELISA法法：固相支持物；：固相支持物；：样品；品；：特异性：特异性IgGIgG；：生物素化抗小鼠：生物素化抗小鼠IgG IgG（BiotinBiotin）；）；：辣根：辣根过氧化物氧化物酶HRP-HRP-酶标链亲和素（和素（AvidinAvidin）；）；：DABDAB显色液；色液；：显色；色；2.7ABS-ELISA法：固相支持物；17173.ELISA的试剂的试剂(A、B、C三部分三部分)ELISA中有三个必要的中有三个必要的试剂：免疫吸附：免疫吸附剂、结合物和合物和酶的底物的底物（1）已包被抗原或抗体的固相）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附体（免疫吸附剂）；）；（2）酶标记的抗原或抗体（的抗原或抗体（结合物）；合物）；（3）酶的底物；的底物；（4）阴性）阴性对照品和阳性照品和阳性对照品，参考照品，参考标准品；准品；（5）结合物及合物及标本的稀本的稀释液；液；（6）洗）洗涤液；液；（7）酶反反应终止液止液3.ELISA的试剂(A、B、C三部分)ELISA中有三1818ELISA的试剂准备的试剂准备A 固相固相载体体聚聚苯苯乙乙烯，具具有有较强的的吸吸附附蛋蛋白白质的的性性能能，抗抗体体或或蛋蛋白白质抗抗原原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。聚聚氯乙乙烯，聚聚氯乙乙烯对蛋蛋白白质的的吸吸附附性性能能比比聚聚苯苯乙乙烯高高，但但空空白白值也略高。也略高。良良好好的的ELISA板板应该是是吸吸附附性性能能好好，空空白白值低低，孔孔底底透透明明度度高高，各板之各板之间、同一板各孔之、同一板各孔之间性能相近。性能相近。ELISA的试剂准备A固相载体19193.1.2包被的方式包被的方式将抗原或抗体固定的将抗原或抗体固定的过程称程称为包被包被(coating)。蛋白蛋白质与聚苯乙与聚苯乙烯固相固相载体是通体是通过物理吸附物理吸附结合的，靠的是合的，靠的是蛋白蛋白质分子分子结构上的疏水基构上的疏水基团与固相与固相载体表面的疏水基体表面的疏水基团间的的作用。作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等的分子量、等电点、点、浓度等的影响。大分子蛋白度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白小分子蛋白质通常含有更通常含有更多的疏水基多的疏水基团，故更易吸附到固相，故更易吸附到固相载体表面。体表面。3.1.2包被的方式将抗原或抗体固定的过程称为2020不易吸附的非蛋白不易吸附的非蛋白质抗原抗原可用可用间接包被的抗原接包被的抗原经固相抗体的固相抗体的亲和和层析作用，包被在固相上的抗原析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕多的抗原也可采用捕获包被法。包被法。亲和素生物素和素生物素即用即用亲和素先包被和素先包被载体，加入生物素化的体，加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，已种包被方法均匀、牢固，已扩大大应用于各种抗原物用于各种抗原物质的定量的定量测定。定。脂脂类物物质无法与固相无法与固相载体体结合，可将其在有机溶合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）（例如乙醇）中溶解后加入中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱板孔中，开盖置冰箱过夜或冷夜或冷风吹干，待吹干，待酒精酒精挥发后，后，让脂脂质自然干固在固相表面。自然干固在固相表面。不易吸附的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析2121天然抗原、重天然抗原、重组抗原和合成多抗原和合成多肽抗原三大抗原三大类。合成多合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。片段。一般只含有一个抗原决定簇，一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相物与固相载体的吸附，体的吸附，间接地接地结合到固相合到固相载体表面体表面。3.1.3 3.1.3 包被用抗原包被用抗原天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。3.1.3包被用22223.1.4 3.1.4 包被用抗体包被用抗体IgG对聚苯乙聚苯乙烯有有强吸附力，其吸附力，其联结发生在生在Fc段上，抗体段上，抗体结合点暴露于外。合点暴露于外。取材于抗血清或含取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液，克隆抗体的培养液，须除去除去杂抗体后才抗体后才能用于能用于ELISA，以保，以保证试验的特异性。的特异性。腹水中腹水中单抗的抗的浓度度较高，特异性亦高，特异性亦较强，因此不需要作吸收，因此不需要作吸收层析析处理，直接包被。在某些情况下，用多种理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合包被，抗混合包被，可取得更好的效果。可取得更好的效果。3.1.4包被用抗体IgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发23233.1.5 3.1.5 包被的条件包被的条件pH9.6碳酸碳酸盐缓冲液冲液pH7.2的磷酸的磷酸盐缓冲液冲液pH7-8的的Tris-HCL缓冲液冲液加入包被液后，在加入包被液后，在4-8冰箱中放置冰箱中放置过夜，夜，37中保温中保温2小小时。包被。包被浓度随度随载体和包被物的性体和包被物的性质可有很大的可有很大的变化，化，每批材料需通每批材料需通过实验与与酶结合物的合物的浓度度协调选定。一般定。一般蛋白蛋白质的包被的包被浓度度为10ng/ml-20ug/ml。3.1.5包被的条件pH9.6碳酸盐缓冲液24243.1.6封闭封闭封封闭(blocking)是是继包被之后用高包被之后用高浓度的无关蛋白度的无关蛋白质溶液再溶液再包被的包被的过程。封程。封闭就是就是让大量不相关的蛋白大量不相关的蛋白质充填充填这些空隙，些空隙，从而排斥从而排斥ELISA后的步后的步骤中干中干扰物物质的再吸附。的再吸附。常用封常用封闭剂：0.05%-0.5%的的BSA;10%的小牛血清或的小牛血清或1%明胶；明胶；脱脂奶粉，比脱脂奶粉，比较价廉，可以高价廉，可以高浓度使用（度使用（5%）。）。所有的所有的ELISA固相均需封固相均需封闭？3.1.6封闭封闭(blocking)是继包被之后用高浓2525ELISA的试剂准备的试剂准备B 3.2 3.2 结合物结合物 即即酶标记的抗体（或抗原）是的抗体（或抗原）是ELISAELISA中关中关键的的试剂 1 1 酶的催化活性的催化活性 2 2 抗体（或抗原）的免疫活性抗体（或抗原）的免疫活性 3 3 含有或少含有游离的抗体（或抗原）含有或少含有游离的抗体（或抗原）4 4 结合物尚要有良好的合物尚要有良好的稳定性定性ELISA的试剂准备B3.2结合物即酶标记的抗体26263.2.1结合物用的抗原和抗体结合物用的抗原和抗体制制备结合物合物时所用所用纯度度较高的高的IgG，以免在与，以免在与酶联结时其其他他杂蛋白的干蛋白的干扰。最好用。最好用层析析纯化的抗体，化的抗体，这样全部全部酶结合合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度度进行反行反应，实验结果本底浅淡。在果本底浅淡。在ELISA中用中用酶标抗原的模式不多，抗原的模式不多，总的要的要求是抗原必求是抗原必须是高是高纯度的。度的。3.2.1结合物用的抗原和抗体制备结合物时所用纯27273.2.2酶酶纯度高，催化反度高，催化反应的的转化率高，化率高，专一性一性强，性，性质稳定，来源定，来源丰富，价格不丰富，价格不贵，受，受检标本中不存在相同的本中不存在相同的酶。酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，和保存，价格低廉，有色价格低廉，有色产物易于物易于测定等。定等。在在ELISA中，中，HRP，AP，葡萄糖氧化，葡萄糖氧化酶，-D-半乳糖苷半乳糖苷酶和和脲酶等。等。辣根辣根过氧化物氧化物酶HRP是一种糖蛋白，含糖量是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子，分子量量为44000，是一种复合，是一种复合酶，由主，由主酶（酶蛋白）和蛋白）和辅基（基（亚铁血血红素）素）结合而成，是一种合而成，是一种卟啉蛋白啉蛋白质。3.2.2酶纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定2828酶标记抗体的制抗体的制备方法主要有两种，即戊二方法主要有两种，即戊二醛交交联法和法和过碘碘酸酸盐氧化法。氧化法。（1）戊二）戊二醛交交联法：戊二法：戊二醛是一种双功能是一种双功能团试剂，可使，可使酶与与蛋白蛋白质的氨基通的氨基通过它而它而联结。有效（。有效（结合率达合率达60%-70%）和）和重复性好。重复性好。交交联反反应是随机的，是随机的，结合物的大小也不均一，合物的大小也不均一，酶与与酶，抗，抗体与抗体之体与抗体之间也有可能交也有可能交联，影响效果。，影响效果。（2）过碘酸氧化法：适用含糖量碘酸氧化法：适用含糖量较高的高的酶。过碘酸碘酸钠将将HRP分子表面的多糖氧化分子表面的多糖氧化为醛基很活基很活泼，可与蛋白，可与蛋白质上的氨基形上的氨基形成成chiff氏碱而氏碱而结合。合。简便有效便有效.3.2.3 3.2.3 结合物的制备结合物的制备3.2.3结合物的制备2929 结合物中混有的游离合物中混有的游离酶一般不影响一般不影响ELISAELISA中最后的中最后的酶活性活性测定。但游离的抗体定。但游离的抗体则会与会与酶标抗体抗体竞争相争相应的固相抗原，的固相抗原，因此制因此制备的的酶结合物合物应予予纯化，去除游离的化，去除游离的酶和抗体后用于和抗体后用于检测，效果更好。，效果更好。制得制得结合物，最适的工作合物，最适的工作浓度就是指度就是指结合物稀合物稀释至至这一一浓度度时，能，能维护一个低的本底，并一个低的本底，并获得得测定的最佳灵敏度，定的最佳灵敏度，达到最合适的达到最合适的测定条件和定条件和测定定费用的用的节省。省。结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性3030酶和抗体均和抗体均为生物活性物生物活性物质，易失活。高，易失活。高浓度度较为稳定，定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加入等合物溶液中加入等体体积的甘油，加入蛋白保的甘油，加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐大霉素）和防腐剂（HRP结合物加硫柳合物加硫柳泵，AP结合物可加合物可加叠氮叠氮钠）。）。3.2.4结合物的保存结合物的保存酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳定，3131 用于稀用于稀释高高浓度的度的结合物以配成工作液。合物以配成工作液。为避免避免结合物在合物在反反应中直接吸附在固相中直接吸附在固相载体上：体上：0.1%0.1%牛血清白蛋白，牛血清白蛋白，0.05%0.05%吐温吐温20 20。试剂盒均已用合适的盒均已用合适的缓冲液配成工作液，冲液配成工作液，使用使用时不需再行稀不需再行稀释，在，在4-84-8保存期可达保存期可达6 6个月。个月。3.2.5 结合物的稀合物的稀释用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直3232试剂准备试剂准备 C 酶的底物酶的底物试剂准备C酶的底物33333.3 3.3 酶的底物酶的底物3.3.1 3.3.1 HRPHRP的底物的底物OPDOPD氧化后的氧化后的产物呈橙物呈橙红色，用酸色，用酸终止止酶反反应后，在后，在492nm492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRPHRP结合物最常合物最常用的底物。用的底物。DH2+H2O2 D+2H2O 上式中，上式中，DH2为供氧体，供氧体，H2O2为受受氢体。体。DH2一般一般为无色化合物，无色化合物，经酶作用后成作用后成为有色的有色的产物。物。DH2如：如：邻苯二胺苯二胺(OPD)(OPD)、四甲基四甲基联苯胺苯胺(TMB)(TMB)和和ABTS ABTS。3.3酶的底物3.3.1HRP的底物OPD氧化后的产3434TMBTMB经HRPHRP作用后共作用后共产物物显蓝色。色。TMBTMB性性质较稳定，可配成定，可配成溶液溶液试剂，只需与，只需与H H2 2O O2 2溶液混和即成溶液混和即成应用液。用液。酶反反应终止止后，后，TMBTMB产物由物由蓝色呈黄色，可在比色色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸中定量，最适吸收波收波长为450nm450nm。ABTSABTS虽不如不如OPDOPD和和TMBTMB敏感，但空白敏感，但空白值极低，也极低，也为一些一些试剂盒所采用。盒所采用。HRPHRP对氢受体的受体的专一性很高，一性很高，仅作用于作用于H2O2H2O2、小分醇的、小分醇的过氧化物和尿素氧化物和尿素过氧化物氧化物(urea peroxide)(urea peroxide)。TMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定，可配成溶3535APAP的底物的底物为磷酸磷酸酯酶，一般采用，一般采用对硝基苯磷酸硝基苯磷酸酯作作为底物。底物。产物物为黄色的黄色的对硝基酚，在硝基酚，在405nm405nm波波长处有吸收有吸收峰。用峰。用NaOHNaOH终止止酶反反应后，黄色可后，黄色可稳定一定一时间。APAP也也有有发荧光底物（磷酸光底物（磷酸4-4-甲基甲基伞酮），可用于），可用于ELISAELISA作作荧光光测定，敏感度定，敏感度较高于用高于用显色底物的比色法。色底物的比色法。AP的底物为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯作为底物。产物为36364 4 对照设定对照设定 阳性阳性对照品照品(positive control)(positive control)和阴性和阴性对照品照品(negative(negative control)control)是是检验试验有效性的控制品，同有效性的控制品，同时也作也作为判断判断结果的果的对照。照。阳性阳性对照品的基本照品的基本组成成应尽量与尽量与检测标本的本的组成相一致，多以含蛋成相一致，多以含蛋白保白保护剂的的缓冲液冲液为基基质。加入的量加入的量应与与试剂的敏感度相称；的敏感度相称；在在测定中得到的吸光定中得到的吸光值与受与受检标本吸光本吸光值比比较，可以估，可以估计标本物本物质的量。的量。4对照设定阳性对照品(positivecontrol3737参考标准品参考标准品定量定量测定（如甲胎蛋白定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原，癌胚抗原测定等）定等）应含有制作含有制作标准曲准曲线用的参考用的参考标准品，准品，应包括覆盖可包括覆盖可检测范范围的的4-5个个浓度，一般均配入含蛋白保度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐及防腐剂的的缓冲液中。冲液中。阴性阴性对照品照品须先行先行检测确定不含待确定不含待测物物质。例如。例如HBsAgHBsAg检测的阴性的阴性对照品中不可含照品中不可含HBsAgHBsAg，最好抗，最好抗HBsHBs也是阴性。也是阴性。参考标准品阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如HBsA38385 5 标本的采取和保存标本的采取和保存 体液、分泌物和排泄物等均可作体液、分泌物和排泄物等均可作标本以本以测定其中某种抗体或定其中某种抗体或抗原成份。抗原成份。以血清以血清标本本为例：血例：血浆中除尚含有中除尚含有纤维蛋白原和抗凝蛋白原和抗凝剂外，外，其他成份同血清。血其他成份同血清。血浆和血清可同等和血清可同等应用。用。血清血清标本本应避免溶血：避免溶血：红细胞溶解胞溶解时会会释放出具有放出具有过氧化物氧化物酶活性的物活性的物质，以，以HRPHRP为标记的的ELISAELISA测定中，可能会增加非定中，可能会增加非特异性特异性显色。色。5标本的采取和保存体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定3939加加样在在ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加次加样步聚，即加步聚，即加标本，加本，加酶结合物，加合物，加底物。加底物。加样时应将所加物加在将所加物加在LEISALEISA板孔的底部，避免加在孔板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可壁上部，并注意不可溅出，不可出，不可产生气泡。生气泡。基本操作注意事项基本操作注意事项加样基本操作注意事项4040保温保温抗原抗体完成反抗原抗体完成反应的保温的保温过程称程称为温育温育(incubation)(incubation)。ELISAELISA属固相免疫属固相免疫测定，抗原、抗体的定，抗原、抗体的结合只在固相表面上合只在固相表面上发生。生。为什么什么ELISAELISA反反应总是需要一定是需要一定时间的温育？的温育？温育常采用的温度有温育常采用的温度有4343、3737、室温和、室温和44（冰箱温度）等。（冰箱温度）等。3737是是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合的合适温度。合适温度。保温4141洗洗涤洗洗涤在在ELISAELISA过程中程中虽不是一个反不是一个反应步步骤，但却也决定着，但却也决定着实验的成的成败。ELSIAELSIA洗洗涤：达到分离游离的和：达到分离游离的和结合的合的酶标记物的目的。物的目的。清除残留在板孔中游离的物清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干，以及非特异性地吸附的干扰物物质。聚苯乙。聚苯乙烯等塑料等塑料对蛋白蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗的吸附是普遍性的，而在洗涤时又又应把把这种非特异性吸附的干种非特异性吸附的干扰物物质洗洗涤下来。下来。可以可以说在在ELISAELISA操作中，洗操作中，洗涤是最主要的关是最主要的关键技技术。洗洗涤的方式除某些的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自器配有特殊的自动洗洗涤仪外，手工外，手工操作有流水冲洗式和浸泡式两种：操作有流水冲洗式和浸泡式两种：洗涤4242（1 1）流水冲洗式）流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠流水冲洗法最初用于小珠载体的洗体的洗涤，洗，洗涤液液为蒸蒸馏水，自来水。洗水，自来水。洗涤效果更效果更为彻底，且也底，且也简便、快速。便、快速。已有已有实验表明，流水冲洗式同表明，流水冲洗式同样适用于微量滴定板的洗适用于微量滴定板的洗涤。让水流冲水流冲击板孔表面，洗板孔表面，洗涤效果更佳。效果更佳。（2 2）浸泡式）浸泡式 微量滴定板多采用。洗微量滴定板多采用。洗涤液液为非离子型洗非离子型洗涤剂的的中性中性缓冲液。聚苯乙冲液。聚苯乙烯载体与蛋白体与蛋白质的的结合是疏水性的，非离合是疏水性的，非离子型洗子型洗涤剂既含疏水基既含疏水基团，也含，也含亲水基水基团，使蛋白，使蛋白质回复到水回复到水溶液状溶液状态，从而脱离固相，从而脱离固相载体。体。（1）流水冲洗式流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液4343显色色显色是色是酶催化无色的底物生成有色催化无色的底物生成有色产物的温育反物的温育反应。反。反应的的温度和温度和时间仍是影响仍是影响显色的因素。在一定色的因素。在一定时间内，阴性孔可内，阴性孔可保持无色，而阳性孔保持无色，而阳性孔则随随时间的延的延长而呈色加而呈色加强。适当提高。适当提高温度有助于加速温度有助于加速显色色进行。行。TMBTMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反反应观察察结果。但果。但为保保证实验结果的果的稳定性，宜在定性，宜在规定的适当定的适当时间阅读结果。果。TMBTMB经HRPHRP作用后，作用后，约4040分分钟显色达色达顶峰，随即逐峰，随即逐渐减弱，至减弱，至2 2小小时后即可完全消退至无色。后即可完全消退至无色。显色显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度4444比色比色拭干板底附着的液体，然后将板正确放入拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色比色仪中。中。以蒸以蒸馏水校零点，水校零点，测读底物孔（未底物孔（未经任何反任何反应仅加底物液的加底物液的孔）和空白孔（以生理孔）和空白孔（以生理盐水或稀水或稀释液代替液代替标本作全本作全过程的孔）程的孔），以，以记录本次本次试验的的试剂状况。其后可用空白孔以蒸状况。其后可用空白孔以蒸馏水校水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行行计算。算。结果以光密度（果以光密度（oplical densityoplical density，ODOD），），现按按规定用吸光度定用吸光度（absorbenceabsorbence，A A），两者含），两者含义相同。通常的表示方法是，将相同。通常的表示方法是，将吸收波吸收波长写于写于A A字母的右下角，如字母的右下角，如OPDOPD的吸收波的吸收波长为492nm492nm，表，表示方法示方法为AA492492nmnm或或ODOD492492nmnm。比色拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。4545酶标比色仪酶标比色仪酶标比色比色仪简称称酶标仪，通常指，通常指测读ELISAELISA光度光度计。针对固相固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的管的设计。酶标仪的主要性能指的主要性能指标有：有：测读速度、速度、读数的准确性、重复性、数的准确性、重复性、精确度和可精确度和可测范范围、线性等等。性等等。优良的良的酶标仪的的读数一般可精数一般可精确到确到0.0010.001，准确性，准确性为1%1%，重复性达，重复性达0.5%0.5%。操作操作时室温宜在室温宜在15-3015-30，使用前先，使用前先预热仪器器15-3015-30分分钟，测读结果更果更稳定。定。测读A A值时，要，要选用用产物的敏感吸收峰，如物的敏感吸收峰，如OPDOPD用用492nm492nm波波长。有的。有的酶标仪可用双波可用双波长式式测读。各种各种酶标仪性能有所不同，使用中性能有所不同，使用中应详细阅读说明明书。酶标比色仪酶标比色仪简称酶标仪，通常指测读ELISA光度计。46466 6 结果判断结果判断 6.1 6.1 定性定性测定定定性定性测定的定的结果判断作出果判断作出“有有”或或“无无”的回答，分的回答，分别用用“阳性阳性”、“阴性阴性”表示。在表示。在这种半定量种半定量测定中，将定中，将标本作一本作一系列稀系列稀释后后进行行试验，呈阳性反，呈阳性反应的最高稀的最高稀释度即度即为滴度。滴度。根据滴度的高低，可以判断根据滴度的高低，可以判断标本反本反应性的性的强弱，弱，这比比观察不察不稀稀释标本呈色的深浅判断本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意阳性、弱阳性更具定量意义。在在间接法和接法和夹心法心法ELSIAELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争争法法ELISAELISA中中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反反应的的结果果判断方法不同，分述于下。判断方法不同，分述于下。6结果判断6.1定性测定4747A.A.阳性判定阳性判定值：（cut-off valuecut-off value）一般一般为阴性阴性对照照A A值加上加上一个特定的常数一个特定的常数(0.05)(0.05)，以此作，以此作为判断判断结果阳性或阴性的果阳性或阴性的标准。准。B.B.标本本/阴性阴性对照比照比值：在：在实验条件（包括条件（包括试剂）较难保保证恒恒定的情况下，定的情况下，这种判断法种判断法较为合适。在得出合适。在得出标本（本（S S）和阴性）和阴性对照（照（N N）的）的A A值后，后，计算算S/NS/N值。间接法和接法和夹心法心法A.阳性判定值：（cut-offvalue）一般为阴性对4848（2 2）竞争法）竞争法因肉眼很因肉眼很难辨辨别弱阳性反弱阳性反应与阴性与阴性对照的照的显色差异，一色差异，一般均用比色般均用比色计测定，定，读出出S S、P P和和N N的吸光的吸光值。a.a.阳性判定阳性判定值法法 阴性判定阴性判定值=0.4NCX+0.6PCX=0.4NCX+0.6PCX 阳性阳性 A A阳性判定阳性判定值 阴性阴性 A A阳性判定阳性判定值 b.b.抑制率法抑制率法 抑制率（抑制率（%）=（阴性（阴性对照照A A值-标本本A A值）100%/100%/阴性阴性对照照 阳性阳性 抑制率抑制率50%50%为 阴性阴性 50%50%（2）竞争法因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异49494.7.2 4.7.2 定量测定定量测定ELSIAELSIA操作步操作步骤复复杂，影响反，影响反应因素因素较多，特多，特别是固相是固相载体的体的包被包被难达到各个体之达到各个体之间的一致，因此在定量的一致，因此在定量测定中，每批定中，每批测试均均须用一系列不同用一系列不同浓度的参考度的参考标准品在相同的条件下制作准品在相同的条件下制作标准曲准曲线。测定大分子量物定大分子量物质的的夹心法心法ELISAELISA，标准曲准曲线的范的范围一般一般较宽，曲曲线的的值逐点逐点连接，所得曲接，所得曲线一般呈一般呈S S形，其形，其头、尾部曲、尾部曲线趋于平坦，中央于平坦，中央较呈直呈直线的部分是最理想的的部分是最理想的检测区域。区域。4.7.2定量测定ELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较50504.ELISA4.ELISA的操作要点的操作要点严谨的的设计，优质的的试剂，正确的操作和良好的，正确的操作和良好的仪器是保器是保证ELISAELISA必要条件。必要条件。严格遵照格遵照规定操作，必能得出准确的定操作，必能得出准确的结果。果。4.ELISA的操作要点严谨的设计，优质的试剂，正确的5151免疫分析技术之ELISA课件5252免疫分析技术之免疫分析技术之液相芯片技术及应用液相芯片技术及应用广东省功能蛋白质组重点实验室广东省功能蛋白质组重点实验室王王 娟娟免疫分析技术之广东省功能蛋白质组重点实验室53liquichip 液相芯片系统_ 液相芯片系统有机地整和了有色微球（color-coded microsphere or bead）、激光技术、流体学、最新的高速数字信号处理器和计算机运算法则，造就了Luminex 100无与伦比的检测特异性和灵敏度。liquichip液相芯片系统_液相芯片系统有54BenefitsApplicationsFutureTechnologyBenefitsApplicationsFutureTech55PrincipleMostbioassaysconsistoftwoormorebiomoleculesinteractingPrincipleMostbioassaysconsis56PrincipleUsingLiquiChip-Technologythesebiologicalinteractionstakeplaceonsmall,microscopicalbeadsthesebeadsarefluorescent(red)PrincipleUsingLiquiChip-Techn57PrincipleDetection and Quantitation of these biological interactions is made by fluorescent detection reagentsBeads球形基质球形基质Capturemolecule探针分子探针分子Analyte待检测物待检测物Reportermolecule报告分子报告分子PrincipleDetectionandQuantit58AssaysonUniformPolystyrene(聚苯乙烯)BeadsDiameter 5.6 mAssaysonUniformPolystyrene59Two internal Dyes for Bead ClassificationDefined Mixture Dying in Shrinking in of both Dyes Organic Solvent Aqueous SolventTwointernalDyesforBeadCla60Two-Color Bead-CodingBasedonxMAPtechnologyByusing10differentlevelsofeachoftwofluorescentdyes,anarrayof100beads,eachwithauniquecolorsignature,iscreatedTwo-ColorBead-CodingBasedon61 为了便于探针分子的固定，在球形基质的表面进行了一系列的修饰，可适合各种蛋白，肽，核酸等生物分子的固定 为了便于探针分子的固定，在球形基质的表面进行了一系列62“LiquidArray”TechnologyDifferentbeadcodes(colors)areusedtoallowtheidentificationofmultiplereactionsinasinglewell“LiquidArray”TechnologyDiffe63“LiquidArray”TechnologyDifferentbeadcodes(colors)areusedtoallowtheidentificationofmultiplereactionsinasinglewell“LiquidArray”TechnologyDiffe64“LiquidArray”TechnologyDifferentbeadcodes(colors)areusedtoallowtheidentificationofmultiplereactionsinasinglewell“LiquidArray”TechnologyDif65反应主要包括3个步骤探针分子的固定将这种标记好探针的球形基质与样品反应。探针可以与相应的目的分子特异性的结合，带有绿色报告荧光的报告分子与目的分子特异性的结合，对反应进行定量反应结果的检测反应主要包括3个步骤探针分子的固定66LiquiChipWorkstationuFlowcytometer-basedtechnologyuMeasuresfluorescenceuComponents:lReaderlMicroplateHandlerlFluidModuleLiquiChipWorkstationFlowcyto67FlowCytometerbasedAnalysisBeadsarealignedinasinglefilestreambyhydrodynamicfocusingTwolasersareusedforexcitationoffluorescenceFlowCytometerbasedAnalysisB68PrincipleofDetectionnTheredlaserisusedtoidentifythebeadcodenThegreenlaserisusedtoidentifythereportersignalPrincipleofDetectionThered69利用这100种球形基质，可以标记上100种不同的探针分子，同时对一个样本中的100种不同的目的分子进行检测。利用这100种球形基质，可以标记上100种不同的探针70AFHEBGCDAFHEBGCD71BenefitsBenefits72系统的优点灵活性好，可适用于各种蛋白质分析，可以接受实验室已有的实验方案，使用者可以自行设计分析方案，也可使用成套试剂盒通量大，可对同一样本中的多种不同目的分子同时进行分析；在35-60分钟内可对96个不同样本进行检测液相环境更有利于保持蛋白质的天然构象，也更有利于探针和被检测物的反应灵敏度高，信噪比好，只需要微量的样品即可进行检测操作简便，耗时短，成本低系统的优点灵活性好，可适用于各种蛋白质分析，可以接受实验室已73免疫分析技术之ELISA课件74免疫分析技术之ELISA课件754%CV4%CV76Liquichip和和ELISA灵敏度的比较灵敏度的比较分别用ELISA和liquichip 对硫氧还蛋白进行定量测定得到的标准曲线I：使用liquichip测定得到的标准曲线II、III：使用ELISA测定得到的标准曲线Liquichip和ELISA灵敏度的比较分别用ELISA77Compared to ELISA:样本本需需求求量量小小:ELISA每每次次实验均均至至少少需需要要100200l外外周周血血，而而采采用用液液相相芯芯片片只只需需50l血血液液即即可可在在一一支支试管管中中完完成成所所有有检测项目目,总体体可可节约80%以以上上的的样本本，这对外外周周血血极极难提提取取的的早早产新新生生儿儿尤尤有有意意义;操操作作流流程程简化化:由由于于ELISA工工作作曲曲线的的置置信信区区间仅23对数数级，因因而而对于于较高高浓度度的的细胞胞因因子子的的检测,其其样本本必必须经不不同同程程度度的的稀稀释以以满足足实验精精确确度度，而而液液相相芯芯片片采采用用荧光光分分析析，其其置置信信区区间可可达达45对数数级，活活性性范范围可可10倍倍于于ELISA,从从而而省省略略了了繁繁琐的的稀稀释和和洗洗涤步步骤;高高效效性性:液液相相悬浮浮状状态下下更更有有利利于于蛋蛋白白质间的的空空间结合合，其其结合合效效率率大大高于大大高于ELISA固相沉底。固相沉底。ComparedtoELISA:样本需求量小:ELI78MeasuringthelevelofmanyhumanormousecytokinesinasinglesampleMeasuringthelevelofmanyhu79免疫分析技术之ELISA课件80Ready-to-use Broad-Range Kinase kits for measuring kinase activity Ser/Thr Kinase,Tyr Kinase Kit Kinase/Phosphorylated ProteinReady-to-useBroad-RangeKinas81unowashingstepsufasteruhigherthroughputuquantitativeassayresultsunohazardousgels/radioactivityuSensitivity:higherthanECL/colorimetricassays,comparabletoorbetterthanradioactiveassaysAdvantagescomparedtoWesternblotproceduresnowashingstepsAdvantagesco82ApplicationsApplications83When to use the LiquiChip System?TheLiquiChipSystemisusedforalargevarietyofproteinassays:ImmunoassaysEnzymeAssaysProtein-proteininteractionAssaysReceptorligandAssaysProteinnucleicacidassaysWhentousetheLiquiChipSyst84AssayTypesImmunoassaysEnzymeassays(kinase,protease)DNA-hybridizationassaysInteractionassaysAssayTypesImmunoassaysEnzyme85Realize the Power of Suspension ArraysAssaysystemthatoffers:multiplexingofassaysuptoafactorof100amix-and-measureprocedures(nowashing)suspensionenzymeassays(kinase,phosphataseandproteaseassays)RealizethePowerofSuspensio86AutoimmuneASCAHumanbeta-2MicroglobulinHumanMouseCentromereBHumanChromatinHumanENAProfile4(SSA,SSB,Sm,RNP)HumanENAProfile5(SSA,SSB,Sm,RNP,Scl-70)HumanENAProfile6(SSA,SSB,Sm,RNP,Scl-70,Jo-1)HumanHistoneHumanHistoneH1HumanHistoneH2AHumanHistoneH2BHumanHistoneH3HumanHistoneH4HumanHSP-27pS82GeneralHSP-27TotalGeneralHSP-32HumanHSP-65HumanHSP-71HumanHSP-90aHumanHSP-90bHumanJo-1HumanPCNAHumanMousePR3HumanPR3(cANCA)MouseRibosomalPHumanMouseRNPHumanMouseRNP-AHumanRNP-CHumanSCFHumanMouseScl-70HumanMouseSerumAmyloidPHumanSLEProfile8(SSA,SSB,Sm,RNP,Scl-70,Jo-1,Ribosome-P,chromatin)HumanSmGeneralHumanSmithMouseHumanSSAHumanMouseSSBHumanMouseStreptolysinOHumanTPOHumanMouseAutoimmuneASCAHumanbeta87Allergy TestingAlternaria(Mold)HumanBermudaGrassHumanCatDanderHumanEggWhiteHumanMilkHumanMitePternoyssinusHumanMountainCedarHumanShortRagweedHumanTimothyGrassHumanWheat(food)HumanAllergyTestingAlternaria(Mol88Cancer MarkersalphaFetoproteinHumanCancerAntigen125HumanCarcinoembryonicAntigenHumanPSA,FreeHumanCancerMarkersalphaFetoprotei89Cardiac MarkersCreatineKinase-MBHumanEndothelin-1MousePAPHumanSGOTHumanMouseTIMP-1HumanMouseCardiacMarkersCr