EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座培训ppt课件

EGFP在大在大肠肠杆菌杆菌Ecoli中的表达和中的表达和检测检测主主题讲题讲座座EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座1一一二二三三四四五五背景介背景介绍实验流程流程实验步步骤预期期结果果参考文献参考文献contents2EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座一二三四五背景介绍实验流程实验步骤预期结果 参考文献cont2第几章一、背景介绍l1、绿色荧光蛋白（GFP）l2、质粒l3、大肠杆菌表达载体及表达系统l4、SDS-PAGE原理及蛋白分离与检测3EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几章一、背景介绍1、绿色荧光蛋白（GFP）3EGFP31 -绿色色荧光蛋白光蛋白1.1发现下村修马丁-查尔菲钱学健发现GFP发光的遗传标签科研4EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座1 -绿色荧光蛋白1.1发现下村修马丁-查尔菲钱学健发现G41 -绿色色荧光蛋白光蛋白（GFP）1.1发现5EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座1 -绿色荧光蛋白（GFP）1.1发现5EGFP在大肠杆菌5GFP的分子质量为26kDa，晶体结构如左图所示。蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420nm，宽240nm，由11个围绕中心螺旋的反平行折叠组成，荧光基团的形成就是从该螺旋开始，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第6567位的“丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸”自身环化和氧化形成。1 -绿色色荧光蛋白光蛋白（GFP）1.2特性6EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座GFP 的分子质量为26 kDa，晶体结构如左图所示。蛋白质6GFP在紫外光激发下发绿色荧光的最高吸收峰为395nm，另一小吸收峰为470nm，最大发射峰为505nm。1 -绿色色荧光蛋白光蛋白1.2特性7EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座GFP在紫外光激发下发绿色荧光的最高吸收峰为395 nm，另71 -绿色色荧光蛋白光蛋白1.2特性优点：易于检测，荧光稳定，无毒害，通用性，易于构建载体，活细胞观察8EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座1 -绿色荧光蛋白1.2特性优点：易于检测，荧光稳定，无毒81 -绿色色荧光蛋白光蛋白1.3应用9EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座1 -绿色荧光蛋白1.3应用9EGFP在大肠杆菌Ecoli92 -质粒粒2.1pEGFP-N3质粒10EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2 -质粒2.1pEGFP-N3质粒10EGFP在大肠杆菌102 -质粒粒2.1.1 pEGFP-N3质粒描述pEGFP-N3encodesared-shiftedvariantofwild-typeGFP(13)whichhasbeenoptimizedforbrighterfluorescenceandhigherexpressioninmammaliancells.(Excitationmaximum=488nm;emissionmaximum=507nm.)pEGFP-N3encodestheGFPmut1variant(4)whichcontainsthedouble-amino-acidsubstitutionofPhe-64toLeuandSer-65toThr.ThecodingsequenceoftheEGFPgenecontainsmorethan190silentbasechangeswhichcorrespondtohumancodon-usagepreferences(5).SequencesflankingEGFPhavebeenconvertedtoaKozakconsensustranslationinitiationsite(6)tofurtherincreasethetranslationefficiencyineukaryoticcells.TheMCSinpEGFP-N3isbetweentheimmediateearlypromoterofCMV(PCMVIE)andtheEGFPcodingsequences.GenesclonedintotheMCSwillbeexpressedasfusionstotheNterminusofEGFPiftheyareinthesamereadingframeasEGFPandtherearenointerveningstopcodons.SV40polyadenylationsignalsdownstreamoftheEGFPgenedirectproperprocessingofthe3endoftheEGFPmRNA.ThevectorbackbonealsocontainsanSV40originforreplicationinmammaliancellsexpressingtheSV40T-antigen.Aneomycinresistancecassette(Neor),consistingoftheSV40earlypromoter,theneomycin/kanamycinresistancegeneofTn5,andpolyadenylationsignalsfromtheHerpessimplexvirusthymidinekinase(HSVTK)gene,allowsstablytransfectedeukaryoticcellstobeselectedusingG418.AbacterialpromoterupstreamofthiscassetteexpresseskanamycinresistanceinE.coli.ThepEGFP-N3backbonealsoprovidesapUCoriginofreplicationforpropagationinE.coliandanf1originforsingle-strandedDNAproduction.11EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2 -质粒2.1.1pEGFP-N3质粒描述pEGFP-N112 -质粒粒2.1.2pEGFP-N3质粒应用FusionstotheNterminusofEGFPretainthefluorescentpropertiesofthenativeproteinallowingthelocalizationofthefusionproteininvivo.ThetargetgeneshouldbeclonedintopEGFP-N3sothatitisinframewiththeEGFPcodingsequences,withnointerveningin-framestopcodons.TheinsertedgeneshouldincludetheinitiatingATGcodon.TherecombinantEGFPvectorcanbetransfectedintomammaliancellsusinganystandardtransfectionmethod.Ifrequired,stabletransformantscanbeselectedusingG418(7).pEGFP-N3canalsobeusedsimplytoexpressEGFPinacelllineofinterest(e.g.,asatransfectionmarker).12EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2 -质粒2.1.2pEGFP-N3质粒应用Fusions122 -质粒粒2.1.3pEGFP-N3质粒图谱675bp1394bp13EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2 -质粒2.1.3pEGFP-N3质粒图谱675bp113pEGFP-N3质粒是一个用于在哺乳动物细胞系中表达EGFP融合蛋白的质粒，它编码GFPmut1突变体，发生了两个氨基酸的替换。2-质粒粒2.1.4 pEGFP-N3的EGFPLeuPhe-64Ser-65Thr荧光强度增加了35倍14EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座pEGFP-N3质粒是一个用于在哺乳动物细胞系中表达EGFP142 -质粒粒2.1.5 编码EGFP的基因片段 6751394bp 长度720bp651GCGGGCCCGGGATCCATCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTT700701CACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCC750751ACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAG800801CTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCC850851CACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACC900901CCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGC950951TACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGAC10001001CCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGC10501051TGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTG11001101GAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAA11501151GAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCA12001201GCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGC12501251CCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAG13001301CAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGA13501351CCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAAGCGGC14001401CGCGACTCTAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTT145015EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2 -质粒2.1.5编码EGFP的基因片段 675139152 -质粒粒2.2pET28a质粒16EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2 -质粒2.2pET28a质粒16EGFP在大肠杆菌Ec162 -质粒粒2.2.1 pET28a质粒描述ThepET-28a-c(+)vectorscarryanN-terminalHisTag/thrombin/T7TagconfigurationplusanoptionalC-terminalHisTagsequence.Uniquesitesareshownonthecirclemap.NotethatthesequenceisnumberedbythepBR322convention,sotheT7expressionregionisreversedonthecircularmap.Thecloning/expressionregionofthecodingstrandtranscribedbyT7RNApolymeraseisshownbelow.Thef1originisorientedsothatinfectionwithhelperphagewillproducevirionscontainingsingle-strandedDNAthatcorrespondstothecodingstrand.Therefore,singlestrandedsequencingshouldbeperformedusingtheT7terminatorprimer(Cat.No.69337-3).17EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2 -质粒2.2.1pET28a质粒描述The pET-2172 -质粒粒2.2.2 pET28a质粒图谱卡那霉素抗性卡那霉素抗性18EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2 -质粒2.2.2pET28a质粒图谱卡那霉素抗性18E182 -质粒粒2.2.2pET28a质粒图谱19EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2 -质粒2.2.2pET28a质粒图谱19EGFP在大肠193-大大肠杆菌表达杆菌表达载体及表达系体及表达系统3.1表达系统常见的大肠杆菌表达系统如下：T7表达系统：T7噬菌体RNA聚合酶能选择性的激活T7噬菌体启动子的转录，其mRNA合成速率相当于大肠杆菌RNA聚合酶的35倍Lac表达系统是-半乳糖甘酶编码基因lacZ的转录的调控序列，该启动子可以被IPTG诱导，所以在培养基中加入该安慰诱导物就可以诱导目的基因的表达。Tac表达系统是一种由Lac和Trp启动子杂合而成的启动子，其强度得到了很大的提高，也可被IPTG诱导PL表达系统是负责DNA分子转录的启动子之一，是一种很强的启动子一个完整的大肠杆菌表达系统至少要由表达载体和宿主菌两部分构成。20EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座3-大肠杆菌表达载体及表达系统3.1表达系统常见的大肠杆菌203-大大肠杆菌表达杆菌表达载体及表达系体及表达系统3.2大肠杆菌表达体系大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。21EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座3-大肠杆菌表达载体及表达系统3.2大肠杆菌表达体系大肠杆21原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：3-大大肠杆菌表达杆菌表达载体及表达系体及表达系统3.3原核表达载体选择标志的编码序列可控转录的启动子转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)一个多限制酶切位点接头宿主体内自主复制的序列22EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：3223-大大肠杆菌表达杆菌表达载体及表达系体及表达系统3.4本实验表达系统宿主菌载体筛选启动子融合标签BL21(DE3)pET28a卡那霉素T7lacHis-TagT7-Tag表达系统表达系统23EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座3-大肠杆菌表达载体及表达系统3.4本实验表达系统宿主菌载233-大大肠杆菌表达杆菌表达载体及表达系体及表达系统3.4本实验表达系统菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型。而BL21（DE3）就是一株由LacUV5启动子控制的T7噬菌体RNA聚合酶基因的溶源菌pET28a是具有His标签，利用T7RNA聚合酶系统在大肠杆菌中诱导型高效表达外源蛋白的表达质粒，外源基因可与N端的His标签或者T7标签融合，以提高外源基因的表达量。24EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座3-大肠杆菌表达载体及表达系统3.4本实验表达系统菌株243-大大肠杆菌表达杆菌表达载体及表达系体及表达系统3.5宿主菌的表达25EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座3-大肠杆菌表达载体及表达系统3.5宿主菌的表达25EGF254-SDS-PAGE分离蛋白原理分离蛋白原理26EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座4-SDS-PAGE分离蛋白原理26EGFP在大肠杆菌Ec264-SDS-PAGE分离蛋白原理分离蛋白原理27EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座4-SDS-PAGE分离蛋白原理27EGFP在大肠杆菌Ec27第几章二、实验流程28EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几章二、实验流程28EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和28第几点第几点实验流程流程大肠杆菌E.coliDH5阳性克隆转化BL21(DE3)IPTG诱导表达SDS-PAGE分离检测29EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点实验流程大肠杆菌E.coli DH5阳性克隆转化BL29第几章三、实验步骤30EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几章三、实验步骤30EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和30第几章扩增菌株提取质粒EGFP基因的PCR扩增和回收EGFP基因和pET28a载体的双酶切pET28a-EGFP重组表达载体的构建EGFP基因的原核表达与检测SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质31EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几章扩增菌株提取质粒 EGFP基因的PCR扩增和回收E31(含pEGFP-N3和pET-28a的大肠杆菌DH5)（1）固-液接种：从LB平板上挑取含有以上质粒的E.coliDH5单菌落，接种于5mLLB培养基中，37振荡培养过夜。（2）液-液转接：以1%接种量将过夜培养的E.coliDH5接种于新鲜LB培养基中，37，220rpm振荡培养22.5h。1-扩增菌株及提取增菌株及提取质粒粒1.1扩增菌株32EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座(含pEGFP-N3和pET-28a的大肠杆菌DH5)1-32（1）取1.05.0mL的菌液，室温下13000rpm离心1min收集细菌。（2）倒弃培养基，加入250LSolution/RNaseA混合液，涡旋振荡使细胞完全悬浮。（3）往重悬混合液中加入250LSolution，轻轻颠倒混匀46次，此操作避免剧烈混匀裂解液且裂解反应不超过5min。（4）加入250LSolution，温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀。（5）室温下，13000rpm离心10min。（6）转移上清液至套有2mL收集管的HiBindDNA结合柱中，室温下，13000rpm离心1min，倒去收集管中的滤液。（7）把柱子重新装回收集管，加入500LHBBuffer，按上述条件离心，弃去滤液。（8）把柱子重新装回收集管，加入700LDNAWashBuffer，按上述条件离心，弃去滤液（注意：浓缩的DNAWashBuffer在使用之前必须按标签的提示用无水乙醇稀释）。（9）弃去滤液，把柱子重新装回收集管，13000rpm离心空柱2min以甩干柱子基质（注意：不要忽略此步这对去除柱子中残留的乙醇至关重要）。（10）把柱子装在干净的1.5mL离心管上，加入50LElutionBuffer到柱子基质中，静置12min，13000rpm离心1min，洗脱出DNA。1-扩增菌株及提取增菌株及提取质粒粒1.2提取质粒（pEGFP-N3、pET28a）33EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座（1）取1.05.0 mL的菌液，室温下13000 rpm332-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR扩增引物引物设计？合适位点直接合适位点直接酶切切还是是PCR？34EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR342-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR扩增35EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR352-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR扩增36EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR362-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR扩增37EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR372-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR扩增EcoR（192）Hind（173）38EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR382-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR扩增39EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR392-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR扩增40EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR40以pEGFP-N3中的EGFP片段作为PCR反应的模板，设计引入Eco RI酶切位点的上游引物(5-GGAGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3)和引入Hind酶切位点的下游引物(5一CCGAAGCTTGGCTGATTATGATCTAGAGTC-3)2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR扩增产物5GGAGAATTCATGGTGTCAGCCAAGCTTCGG33CCTCTTAAGTACCACAGTCGGTTCGAAGCC541EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座以pEGFP-N3中的EGFP片段作为PCR反应的模板，设计413-EGFP基因和pET28a载体的双酶切3.1酶切位点分析选择重组酶切位点的3个原则：1.读码框正确2.不能破坏载体或目的片段3.两个酶缓冲液相似，从而可以同时酶切Eco R I Hind III42EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座3-EGFP基因和pET28a载体的双酶切3.1酶切位点分析423-EGFP基因和pET28a载体的双酶切3.1读码框分析GAATTCATGGTGTCAGCCAAGCTTCTTAAGTACCACAGTCGGTTCGAA正常表达未发生移码43EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座3-EGFP基因和pET28a载体的双酶切3.1读码框分析G432-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR扩增编号组分加量（L）1dNTPmixture5.0210 xbuffer5.03上游引物(10M/L)2.04下游引物(10M/L)2.05模板4.06Taq酶1.07ddH206.0total25PCRPCR反反反反应应体系体系体系体系44EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR442-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR扩增PCRPCR反反反反应应体系体系体系体系预变性952min变性9530s退火58.730s延伸721min终延伸727min保存445EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR452-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR扩增产物的检验及回收扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检验后，用DNA纯化试剂盒回收后待用。（1）用干净的刀片将需要的DNA条带从凝胶上切下来，称取质量。（2）以0.1g凝胶对应300L的体积加入溶胶液PN。50水浴放置10min，其间不保持水浴温度不变并上下翻动离心管至胶完全融解。（3）将上一步得到的溶液加入到吸附柱中，吸附柱放入收集管，室温静置1min，13000rpm离心30s，弃上清液。（4）加入700L漂洗液Pw，13000rpm离心60s，弃上清液。（5）加入500L漂洗液Pw，13000rpm离心60s，弃上清液。（6）13000rpm离心2min，彻底除去漂洗液Pw。（7）取出吸附柱，置于室温数分钟，彻底晾干，防止残留的漂洗液影响下一步的实验。（8）将吸附柱放人一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置加入适量洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液应先在65水浴预热，体积应大于30L），室温放置2min，13000rpm离心2min。（9）然后将离心的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤（8）。（10）经纯化回收的DNA置于-20保存。46EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座2-EGFP基因的PCR扩增和回收2.1EGFP基因的PCR463-EGFP基因和pET28a载体的双酶切3.2EGFP基因的双酶切双双双双酶酶切反切反切反切反应应体系体系体系体系反应物体积/LEGFP片段1010buffer2EcoR1Hind1ddH206总计201.37保温1h2.65条件下处理20min进行热失活3.经1%的琼脂糖凝胶电泳检验4.DNA纯化试剂盒纯化回收47EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座3-EGFP基因和pET28a载体的双酶切3.2EGFP基因473-EGFP基因和pET28a载体的双酶切3.3pET28a载体的双酶切双双双双酶酶切反切反切反切反应应体系体系体系体系反应物体积/LEGFP片段1010buffer2EcoR1Hind1ddH206总计201.经1%的琼脂糖凝胶电泳检验2.DNA纯化试剂盒纯化回收线性质粒条带48EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座3-EGFP基因和pET28a载体的双酶切3.3pET28a484-pET28a-EGFP重组表达载体的构建4.1连接反应连连接反接反接反接反应应体系体系体系体系1.16保温过夜成分加样量/LddH20310T4ligasebuffer1.0EGFP片段8pET28a210T4连接酶149EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座4-pET28a-EGFP重组表达载体的构建4.1连接反应连494-pET28a-EGFP重组表达载体的构建4.2转化感受态细胞的制备（1）固-液接种：从LB平板上挑取新活化的E.coliDH5单菌落，接种于5mLLB培养基中，37振荡培养过夜。（2）液-液转接：以1%接种量将过夜培养的E.coli DH5接种于新鲜LB培养基中，37，220rpm振荡培养22.5h。（3）菌液冰浴：将菌液置于冰浴中。（4）取两个无菌的1.5mL离心管，各加入1.5mL菌液，4，4000rpm离心5min，弃上清。重复上述操作，使每个1.5mL离心管中收集3mL培养液的菌体。（5）残留液体涡旋细胞，加800L预冷的0.1MCaCl2，冰浴悬浮细胞。4，4000rpm离心5min，弃上清。（6）加入100L预冷的0.1MCaCl2，轻轻悬浮细胞，冰浴20min。（7）分装至50L/管，感受态细胞制备完成（现用或者48h内使用，4保存）50EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座4-pET28a-EGFP重组表达载体的构建4.2转化感504-pET28a-EGFP重组表达载体的构建4.2转化涂布平板1234567实验设组实验设组感受态细胞（L/管）DNA（L）冰浴热击冰浴复苏培养基涂布平板（42）I试验组试验组100连接物5.010min90s5minLB：0.9ml/管，0.5-1hLB+kan50l2100l2150l2200l2II转化转化对照对照50Pbv2201.0LB+kan50l1III细胞细胞对照对照50LB+kan50l1LB50l1预留一个空白+kan平板。51EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座4-pET28a-EGFP重组表达载体的构建4.2转化涂514-pET28a-EGFP重组表达载体的构建4.2转化筛选37平板培养过夜后，挑选35个菌落做PCR验证，进一步进行酶切鉴定，阳性克隆用于DNA测序。对经测序确证的、含pET28a-EGFP重组质粒的菌落进行质粒提纯。52EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座4-pET28a-EGFP重组表达载体的构建4.2转化筛525-EGFP基因的原核表达与检测5.1转化表达宿主取1L“pET28a-EGFP”重组表达质粒，转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞，经37培养过夜。53EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座5-EGFP基因的原核表达与检测5.1转化表达宿主取1 L535-EGFP基因的原核表达与检测5.2诱导表达目的基因（1）随机挑选10个阳性菌落克隆于含卡那霉素(50g/mL)的LB液体培养液中。（2）37摇床培养至OD值为0.41。（3）取出3mL样品作为未诱导对照，4000rpm离心5min，收集细胞冻存于-20。（4）剩下的样品继续加入100mMIPTG储液至终浓度为0.5mM，继续37摇床培养,然后分别在日光灯和紫外灯下照射。54EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座5-EGFP基因的原核表达与检测5.2诱导表达目的基因（1）546-SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质样品的准备制胶电泳染色脱色分析55EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座6-SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质样品的准备制胶电泳染色556-SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质6.1样品的制备（1）将诱导表达后的菌体重悬于100LPBS中，分别进行超声裂解，每个样品超声23s，处理2min。（2）取超声后溶液适量留待制备菌体表达总蛋白质样品。412000rpm离心10min，分别获取超声上清和沉淀，然后超声上清，测蛋白质含量，调整浓度一致。超声离心后沉淀用适量PBS重悬。（3）将菌体表达的总蛋白样品、超声上清、超声沉淀各取20L与5样品缓冲液在EP管中混合，放入100加热5min。（4）常温离心10000rpm，取适量上清准备上样。56EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座6-SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质6.1样品的制备（1）566-SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质6.2分离胶及浓缩胶的制备分离胶和浓缩胶分别按下表中的配方进行制备。先制分离胶，将分离胶注入玻板后，用去离子水封口，约3040min后凝聚。将胶面的水吸干后灌注浓缩胶，并插入梳子，胶凝固后即可。分离胶去离子水3.5mL4分离胶缓冲液（pH=8.8）2.5mL丙烯酰胺储液（30）4mLTEMED10L10AP80L浓缩胶去离子水2.3mL4浓缩胶缓冲液（pH=8.8）1mL丙烯酰胺储液（30）0.67mLTEMED10L10AP50L57EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座6-SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质6.2分离胶及浓缩胶的576-SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质6.3凝胶电泳取80ml电极缓冲液稀释5倍后，分别注入阴极电泳槽和阳极电泳槽中。然后在加样孔中加入已经处理好的蛋白样品。80V恒压20min，120V恒压2h。58EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座6-SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质6.3凝胶电泳取80 586-SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质6.4染色、脱色取电泳完毕，剥胶后，在摇床上染色0.51小时；之后，在脱色液中脱色1h，观察目的蛋白表达情况。59EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座6-SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质6.4染色、脱色取电泳59第几章四、预期结果l1、菌落PCR的结果l2、重组质粒的双酶切结果l3、测序的结果l4、EGFP基因的表达结果l5、分生实验课上的实验结果60EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几章四、预期结果1、菌落PCR的结果 60EGFP在大肠杆60第几点第几点1、菌落、菌落PCR的的结果果PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳后，可发现在靠近750bp处有清晰条带，这便是阳性。61EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点1、菌落PCR的结果PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳后，61EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座培训ppt课件62第几点第几点3、测序序结果果将PCR进行测序，正确结果应该与genebank序列完全一致，由此可以证明目的片段“EGFP”已正确连接到pET28a表达载体，并且核苷酸序列未发生任何碱基突变。63EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点3、测序结果将PCR进行测序，正确结果应该与geneb63第几点第几点4、EGFP基因的表达基因的表达结果果加入IPTG诱导后，可观察到菌体细胞呈现绿色如图所示，说明目的基因在表达菌E.coli BL21中表达。如图所示在紫外光下可以观察到菌体细胞发绿色荧光64EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点4、EGFP基因的表达结果加入IPTG诱导后，可观察到64第几点第几点5、分生、分生实验课上的上的实验结果果在6月5日、10日和12日的分生实验课上，我们进行了“EGFP、DsRed和YFP在E.coli中的诱导表达和检测”的实验，得到了一些实验结果，现进行实验结果分析如下：65EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点5、分生实验课上的实验结果在6月5日、10日和12日的65第几点第几点5、分生、分生实验课上的上的实验结果果在本次实验中，我们向LB固体培养基平板中进行接种的表达菌株分别可以表达GFP基因、RFP基因和YFP基因，从而经过IPTG诱导后可以产生相应的荧光蛋白。6月10日下午我们在平板上进行划线接种，接种工具可以使用灭菌后的牙签、棉棒以及灼烧后的接种环。我对两个平板进行接种。其中一个平板接种后的图案如下图所示。图中可以很明显地看出平板划线的痕迹。接种完成后将平板倒置放在37恒温培养箱中培养。66EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点5、分生实验课上的实验结果在本次实验中，我们向LB固体66第几点第几点5、分生、分生实验课上的上的实验结果果6月12日下午我们从恒温培养箱中取出平板观察实验结果。观察发现，在我做的2个平板中，表达菌株在平板中生长状态良好，在日光下就可以看到平板上的绿色、红色和黄色的菌落颜色（实际上是大肠杆菌产生的荧光蛋白的颜色）。其中一个平板在6月10日接种了可以产生RFP的表达菌株，6月12日观察发现该平板在日光灯下即可见红色菌落组成的图案，如下图所示。67EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点5、分生实验课上的实验结果6月12日下午我们从恒温培养67第几点第几点5、分生、分生实验课上的上的实验结果果不过该平板不小心被捏碎，导致没有在紫外灯下观察和拍照。我只对另一个平板在紫外灯下进行观察和拍照，实验结果如下图所示。68EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点5、分生实验课上的实验结果不过该平板不小心被捏碎，导致68第几点第几点5、分生、分生实验课上的上的实验结果果上图所示的平板中我只接种了可以产生GFP的表达菌株，从而在平板中可以产生绿色菌落。该平板在日光灯下便可见绿色菌落，在紫外灯下观察更加明显。在紫外灯的照射下，平板中的菌落发出绿色荧光，非常明亮，可以清晰地看到平板中的图案。在6月10日的平板划线过程中，我花了很多时间对第一个平板进行划线接种，第二个平板只是简单地划线接种。但是很不巧的是6月12日第一个平板被捏碎导致没有在紫外灯下观察拍照，因此最终的实验结果只能呈现第二个平板图案。第二个平板的图案设计没有什么独特的地方，设计该图案的原因是我们宿舍有一个舍友叫邱伟，外号是伟哥，他的口头禅是“厉害！”。因此我就随手在平板上写下了“伟哥厉害”四个字。69EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点5、分生实验课上的实验结果上图所示的平板中我只接种了可69第几点第几点5、分生、分生实验课上的上的实验结果果6月12日我们同时对GFP、RFP和YFP三种蛋白质进行SDS-PAGE电泳检测。SDS-PAGE电泳的加样顺序如下面两表所示。泳道12345678910样品pET28a-3GFP-0GFP-1MGFP-3GFP-5RFP-5RFP-0RFP-1RFP-3样量20L20L20L10L20L20L20L20L20L20L泳道1112131415161718样品MpET28a-0pET28a-1pET28a-5YFP-1YFP-0YFP-3YFP-5样量20L20L20L20L20L20L20L20L70EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点5、分生实验课上的实验结果6月12日我们同时对GFP、70第几点第几点5、分生、分生实验课上的上的实验结果果12345678910SDS-PAGE电泳图（电泳图（1）SDS-PAGE电泳结果如下所示：71EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点5、分生实验课上的实验结果12345678910SDS71第几点第几点5、分生、分生实验课上的上的实验结果果1112131415161718SDS-PAGE电泳图（电泳图（2）72EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点5、分生实验课上的实验结果1112131415161772第几点第几点5、分生、分生实验课上的上的实验结果果泳道4和泳道11中加的是marker，其SDS-PAGE电泳理论条带如右图所示。电泳后的marker中有7条带，指示的蛋白质大小分别是14.4kDa、18.4kDa、25.0kDa、35.0kDa、45.0kDa、66.2kDa和116.0kDa。在电泳图（1）和（2）中两个marker跑出的条带都较清晰，可以看到marker中7条指示条带，电泳效果较好。泳道12、泳道13、泳道1、泳道14加的是空载体pET28a分别培养0小时、1小时、3小时和5小时后的样品，从SDS-PAGE电泳图（1）和（2）中可以看到，这4个泳道中有若干条条带，这些条带的位置和亮度相近，都是表达载体自身的蛋白质电泳结果。在这三种荧光蛋白对应的条带位置处没有观察到相应的条带，说明不含荧光蛋白基因的表达载体无法产生荧光蛋白。73EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点5、分生实验课上的实验结果泳道4和泳道11中加的是ma73第几点第几点5、分生、分生实验课上的上的实验结果果泳道2、泳道3、泳道5和泳道6加的是可以产生GFP的表达菌株分别经IPTG诱导0小时、1小时、3小时和5小时后的样品。GFP的分子质量为26kDa，处于marker25.0kDa和35.0kDa两条条带之间，即marker从下往上数第3、4条带之间。理论上可以产生GFP的表达菌株经IPTG诱导的时间越长，产生的GFP越多，电泳后得到的GFP对应的条带越亮越宽。从图中可以很明显地看出，泳道2中的电泳条带与泳道1等导入空载体pET28a表达菌株的电泳条带相同，没有观察到GFP对应的条带，说明没有经IPTG诱导表达的表达菌株不能产生GFP。泳道3、泳道5、泳道6中均有符合GFP对应条带位置的又宽又明亮的条带，而且条带宽度增加亮度增加，这说明经IPTG诱导表达时间越长，表达菌株产生的GFP越多。74EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点5、分生实验课上的实验结果泳道2、泳道3、泳道5和泳道74第几点第几点5、分生、分生实验课上的上的实验结果果泳道8、泳道9、泳道10和泳道7加的是可以产生RFP的表达菌株分别经IPTG诱导0小时、1小时、3小时和5小时后的样品。RFP的分子质量处于marker25.0kDa和35.0kDa两条条带之间，即marker从下往上数第3、4条带之间。泳道8中的电泳条带与泳道1等导入空载体pET28a表达菌株的电泳条带相同，没有观察到RFP对应的条带，说明没有经IPTG诱导的表达菌株不能产生RFP。理论上可以产生RFP的表达菌株经IPTG诱导的时间越长，产生的RFP越多，电泳后得到的RFP对应的条带越亮越宽。泳道9、泳道10和泳道7中均含有符合RFP对应条带位置的又宽又明亮的条带。泳道10中的样品是表达菌株经IPTG诱导3小时后得到的，比泳道9中样品对应的表达菌株诱导时间长，实际实验结果可以看出，泳道10比泳道9中的条带宽度增加亮度增加，说明GFP含量增加，符合理论情况。不过，泳道7中跑出的条带较窄，RFP对应的条带没有明显地变宽变亮，该实验现象不明显。75EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点5、分生实验课上的实验结果泳道8、泳道9、泳道10和泳75第几点第几点5、分生、分生实验课上的上的实验结果果泳道16、泳道15、泳道17和泳道18加的是可以产生YFP的表达菌株分别经IPTG诱导表达0小时、1小时、3小时和5小时后的样品。YFP的分子质量处于marker25.0kDa和35.0kDa两条条带之间，即marker从下往上数第3、4条带之间。泳道16中的电泳条带与泳道1等导入空载体pET28a表达菌株的电泳条带相同，没有观察到YFP对应的条带，说明没有经IPTG诱导的表达菌株不能产生YFP。理论上表达菌株经IPTG诱导的时间越长，产生的YFP越多，电泳后得到的YFP对应的条带越亮越宽。从此次实验结果看出，泳道15中没有观察到YFP对应的条带，说明此表达菌株经IPTG诱导表达1小时后产生的YFP含量很少。泳道17和泳道18中均有符合YFP位置的条带，较宽较明亮，但是泳道18中的条带不如泳道17中的条带宽和明亮。泳道18中的表达菌株经IPTG诱导的时间比泳道17中的样品长，理论上条带应该更宽更明亮。这出现了实际情况与理论情况不相符的情况，具体原因需要进一步的实验探究。76EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点5、分生实验课上的实验结果泳道16、泳道15、泳道1776第几点第几点5、分生、分生实验课上的上的实验结果果综观实验结果，我发现可以产生GFP的表达菌株的实验结果最好。探究其原因我发现在此次实验中，表达菌株产生的荧光蛋白其实分别是EGFP、DsRed和YFP。EGFP是增强型绿色荧光蛋白，表达菌株产生EGFP蛋白，会使实验现象要好于另外二者。不过，实际情况是否如此仍需要进一步的实验探究。77EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几点5、分生实验课上的实验结果综观实验结果，我发现可以产生77第几章五、参考文献l1ShimomuraO.ThediscoveryofaequorinandgreenfluorescentproteinJ.JMicrosc.2005Jan;217(Pt1):1-15.l2 张新生，刘小裕，任双义.绿色荧光蛋白的发现及其应用J.大连医科大学学报，2009,31(4).l3 崔志芳，邹玉红，季爱云.绿色荧光蛋白研究的三个里程碑2008年诺贝尔化学奖简介J.自然杂志，2008,30(6).l4 季爱加，宁喜斌.原核表达载体的构建与表达J.微生物学杂志，2011,31(4).78EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座第几章五、参考文献1 Shimomura O.78Thank you！79EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达和检测主题讲座Thank you！79EGFP在大肠杆菌Ecoli中的表达79