干细胞培养拷贝优质课件

干细胞培养拷贝干细胞培养拷贝2一、干细胞的概念一、干细胞的概念n干干细细胞胞(stemcells,SC)是是一一类类具具有有无无限限或或长长期期自自我我维维持持和和自自我我更更新新能能力力(self-renewing)的的多多潜潜能能细细胞胞，在在一一定定条条件件下下，它可以分化成多种功能细胞。它可以分化成多种功能细胞。n干干细细胞胞是是一一种种未未充充分分分分化化，尚尚不不成成熟熟的的细细胞胞，具具有有再再生生各各种种组组织织器器官官和和人人体体的的潜潜在在功能，医学界称之为功能，医学界称之为“万用细胞万用细胞”。3干细胞几个主要特征干细胞几个主要特征l具有自我更新能力与自我维持能力，可以无限增具有自我更新能力与自我维持能力，可以无限增殖分裂。干细胞一旦形成，在机体内终生都具有殖分裂。干细胞一旦形成，在机体内终生都具有自我更新能力，以维持自身数目的恒定。自我更新能力，以维持自身数目的恒定。l既具有生理性的更新能力，也具有对损伤或疾病既具有生理性的更新能力，也具有对损伤或疾病导致的反应有修复能力，如骨髓间充质干细胞等。导致的反应有修复能力，如骨髓间充质干细胞等。干细胞维持自稳性的机制：对称分裂和不对称分裂干细胞维持自稳性的机制：对称分裂和不对称分裂4l干细胞本身不是终末分化细胞；具有多向分化的能力干细胞本身不是终末分化细胞；具有多向分化的能力（多能性或全能性），即可以分化发育成各种胚层组（多能性或全能性），即可以分化发育成各种胚层组织的细胞（织的细胞（ES细胞），或可以分化成为本系统各谱系细胞），或可以分化成为本系统各谱系的细胞（特定组织干细胞，如造血干细胞）。的细胞（特定组织干细胞，如造血干细胞）。5l干细胞的自我更新与分化需要特定的微环境，也就是说干细胞的自我更新与分化需要特定的微环境，也就是说干细胞往哪一种方向分化，必须在该细胞生存的特定微干细胞往哪一种方向分化，必须在该细胞生存的特定微环境前提下进行分化。已有诸多的实验表明，如将环境前提下进行分化。已有诸多的实验表明，如将ES细细胞种植入小鼠大脑内，这些干细胞将向神经系统分化。胞种植入小鼠大脑内，这些干细胞将向神经系统分化。在不同生长因子刺在不同生长因子刺激下干细胞可表现激下干细胞可表现出不同分化潜能出不同分化潜能6l干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运保持保持为干细胞或分化为特定细胞。为干细胞或分化为特定细胞。干细干细胞的分化是胞的分化是不不对称对称的分的分离离，当当一一个变两个个变两个的的时时候，其中一候，其中一个个能基本保留母能基本保留母体体的的个个性性，需要的需要的时时候，就可以候，就可以随随时时拿拿来来提供源泉。提供源泉。7二、干细胞的分类二、干细胞的分类1 1、按分化潜能大小来分类、按分化潜能大小来分类:全能干细胞（全能干细胞（TotipotentTotipotent stem cell stem cell ）：能分化成所有组织和器官的干细胞，它具有形成完整个体的分化潜能。如受精卵，胚胎干细胞。多多能干细胞能干细胞（pluripotentpluripotent stem cell stem cell ），具有分化出多种组织细胞的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力。如骨髓多能造血干细胞是典型的例子，它可分化出至少十二种血细胞。专能干细胞（专能干细胞（unipotentunipotent stem cellstem cell ），这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织 基底层干细胞、肌肉中的成肌细胞等。82、根据来源来分、根据来源来分:来源于胚胎来源于胚胎-胚胎干细胞胚胎干细胞 ESC （Embryonic Stem Cell）胚胎性生殖细胞胚胎性生殖细胞 EGC （Embryonic Germ Cell）来源于成体组织来源于成体组织-成体干细胞成体干细胞 ASC （Adult-derived Stem Cell）9胚胎干细胞胚胎干细胞指从着床前的胚胎内细胞团（桑椹胚）或原始指从着床前的胚胎内细胞团（桑椹胚）或原始生殖细胞获得的一种具有多潜能性、可发育成生殖细胞获得的一种具有多潜能性、可发育成为各种细胞、同时可保持不分化状态而持续生为各种细胞、同时可保持不分化状态而持续生长的细胞。长的细胞。它可以无限增殖并分化成为全身它可以无限增殖并分化成为全身200多种细胞类型，多种细胞类型，进一步形成机体的所有组织、器官。为全能干细胞。进一步形成机体的所有组织、器官。为全能干细胞。10胚胎干细胞具有发育成所有细胞、组织和器官的能力。12成体干细胞成体干细胞是成体组织内具有自我更新及分化一种或一种是成体组织内具有自我更新及分化一种或一种是成体组织内具有自我更新及分化一种或一种是成体组织内具有自我更新及分化一种或一种以上子细胞的未成熟细胞。以上子细胞的未成熟细胞。以上子细胞的未成熟细胞。以上子细胞的未成熟细胞。来源于成体组织或器官，一般具有组织特异性，来源于成体组织或器官，一般具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织。为多能干细胞只能分化成特定的细胞或组织。为多能干细胞或单能干细胞，如造血干细胞和上皮干细胞等。或单能干细胞，如造血干细胞和上皮干细胞等。133、根据干细胞组织发生的名称进行分类、根据干细胞组织发生的名称进行分类:胚胎干细胞胚胎干细胞造血干细胞造血干细胞骨髓间质干细胞骨髓间质干细胞肌肉干细胞肌肉干细胞成骨干细胞成骨干细胞内胚层干细胞内胚层干细胞视网膜干细胞视网膜干细胞胰腺干细胞胰腺干细胞14三、干细胞研究的历史情况三、干细胞研究的历史情况 n1959年，美国首次报道了通过体外受精（年，美国首次报道了通过体外受精（IVF）动物。）动物。n60年代，几个近亲种系的小鼠睾丸畸胎瘤的研究表明其年代，几个近亲种系的小鼠睾丸畸胎瘤的研究表明其来源于胚胎生殖细胞（来源于胚胎生殖细胞（embryonicgermcells,EG细胞）细胞）,此工作确立了胚胎癌细胞（此工作确立了胚胎癌细胞（embryoniccarcinomacells,EC细胞）是一种干细胞。细胞）是一种干细胞。n1968年，年，Edwards和和Bavister在体外获得了第一个人在体外获得了第一个人卵子。卵子。n70年代，年代，EC细胞注入小鼠胚泡产生杂合小鼠。培养的细胞注入小鼠胚泡产生杂合小鼠。培养的EC细胞作为胚胎发育的模型，虽然其染色体的数目属于异常。细胞作为胚胎发育的模型，虽然其染色体的数目属于异常。n1978年，第一个试管婴儿在英国诞生。年，第一个试管婴儿在英国诞生。15n1981年，从小鼠胚泡内细胞团分离出小鼠年，从小鼠胚泡内细胞团分离出小鼠ES细胞，细胞，并并建立了小鼠建立了小鼠ES细胞体外培养条件。将细胞体外培养条件。将ES细胞注入小鼠，细胞注入小鼠，能诱导形成畸胎瘤。能诱导形成畸胎瘤。n1984-1988年，年，Anderews等人从人睾丸畸胎瘤细胞等人从人睾丸畸胎瘤细胞系系Tera-2中产生出多能的、可鉴定的（克隆化的）细中产生出多能的、可鉴定的（克隆化的）细胞，称之为胚胎癌细胞（胞，称之为胚胎癌细胞（embryoniccarcinomacells,EC细胞）。克隆的人细胞）。克隆的人EC细胞在视黄酸的作用下细胞在视黄酸的作用下分化形成神经元样细胞和其他类型的细胞。分化形成神经元样细胞和其他类型的细胞。n1989年，年，Pera等分离了一个人等分离了一个人EC细胞系，此细胞系细胞系，此细胞系能产生出三个胚层的组织。这些细胞是非整倍体的能产生出三个胚层的组织。这些细胞是非整倍体的（比正常细胞染色体多或少），他们在体外的分化潜（比正常细胞染色体多或少），他们在体外的分化潜能是有限的。能是有限的。16n1998年美国有两个小组分别培养出了人的多能干细胞：年美国有两个小组分别培养出了人的多能干细胞：JamesA.Thomson在在Wisconsin大学领导的研究小组的方大学领导的研究小组的方法是：人卵体外受精后，将胚胎培育到囊胚阶段，提取法是：人卵体外受精后，将胚胎培育到囊胚阶段，提取innercellmass细胞，建立细胞株。细胞，建立细胞株。nJohnD.Gearhart在在JohnsHopkins大学领导的另一个研大学领导的另一个研究小组的方法是：从受精后究小组的方法是：从受精后59周人工流产的胚胎中提取生周人工流产的胚胎中提取生殖母细胞殖母细胞(primordialgermcell)，建立细胞株。，建立细胞株。17n1999年年12月，美国科学家在月，美国科学家在美国科学院院刊美国科学院院刊报告说，报告说，小小鼠肌肉组织的成体干细胞可以鼠肌肉组织的成体干细胞可以“横向分化横向分化”为血液细胞。为血液细胞。随随后，世界各国的科学家相继证实，成体干细胞，包括人类的后，世界各国的科学家相继证实，成体干细胞，包括人类的成体干细胞具有可塑性。成体干细胞具有可塑性。n1999年年12月，干细胞研究进展被月，干细胞研究进展被科学科学杂志评选为该年度杂志评选为该年度世界十大科学进展之首。世界十大科学进展之首。n2007年日本的年日本的Yamanaka研究小组和美国的研究小组和美国的JamesThomson研究小组研究小组分别获得诱导多能性干细胞分别获得诱导多能性干细胞（inducedpluripotentstemcell，iPS细胞）。细胞）。n2013年，加州大学旧金山分校的丁盛团队发现了化学诱导多年，加州大学旧金山分校的丁盛团队发现了化学诱导多能干细胞（能干细胞（CiPSCs）。18诱导多能性干细胞诱导多能性干细胞2006年，日本京都大学山中伸弥（Shinya Yamanaka)发现将四个基因送入已分化完全的小鼠纤维母细胞，即可以把纤维母细胞重新设定变回具全能性的类胚胎干细胞。2007年，山中伸弥研究小组和美国波士顿的 Rudolf Jaenisch的研究团队分别制造了第二代iPS细胞，不但具有和胚胎干细胞几乎一样的基因印痕模式，它们也可顺利地和成鼠形成嵌合体并产生后代。这项结果显示藉由老鼠体细胞”返老还童”的第二代 iPS细胞已经跟胚胎干细胞几乎是具有一模一样的特质了!19诱导多能性干细胞诱导多能性干细胞2007年11、12月山中伸弥研究团队再次成功地利用3-4个基因导入人类皮肤细胞并将其成功地转变成 iPS细胞!同时，美国威斯康新的James Thomson研究团队利用4个基因将人类体细胞重新设定变回干细胞！2007年底，美国波士顿 George Daley实验室利用山中伸弥建立的技术，从病人就诊时取得的皮肤细胞量身订作一个个人的干细胞库，让 iPS细胞用来治疗人类退化性疾病已经迈入真正的临床新纪元了！20 山中伸弥山中伸弥 约翰约翰伯特兰伯特兰格登格登（Shinya Yamanaka）（John Bertrand Gurdon）2012年的诺贝尔生理学或医学奖获得者年的诺贝尔生理学或医学奖获得者 21n1962年出生于日本大阪府，日本医学家，年出生于日本大阪府，日本医学家，京都大学再生医科研究所干细胞生物系教授京都大学再生医科研究所干细胞生物系教授n人人生生万万事事如如塞塞翁翁失失马马：高高中中热热衷衷柔柔道道，受受伤伤了了10多多次次(骨骨折折)，最最后后阶阶段段学学习习，考考入入国国立立神神户户大大学学医医学学部部；毕毕业业后后，蹩蹩脚脚的的整整形形外外科科医医生生；1989年年，进进入入大大阪阪大大学学研研究究生生院院，毕毕业业后后，前前往往美美国国旧旧金金山山的的格格拉拉斯斯顿顿研研究究所所留留学学，开开始始从从事事老老鼠鼠的的胚胚胎胎干干细细胞胞研研究究。1996年年回回国国后后研研究究陷陷入入停停滞滞；1999年年12月月，成成为为奈奈良良先先端端科科学学技技术术大大学学院院大大学学的的副副教教授授；2003年年，日日本本科科学学技技术术振振兴兴机机构构为为他他提提供供了了为为期期5年年、总总额额3亿亿日日元元的的研研究究经费，至此逐步经费，至此逐步走向成功走向成功。n荣荣誉誉：2008年年，时时代代杂杂志志“世世界界百百大大影影响响力力人人物物”，罗罗伯伯特特科科赫赫奖奖（德德国国），科科学学技技术术特特别别奖奖（日日本本），邵邵逸逸夫夫生生命命科科学学与与医医学学奖奖；2009年年，拉拉斯斯克克基基础础医医学学奖奖；2011年年，沃沃尔尔夫夫医医学学奖奖；2012年年，芬芬兰兰“千千年年技术奖技术奖”，诺贝尔生理学或医学奖诺贝尔生理学或医学奖。山中伸弥22n1933年年10月月2日出生于英国，发育生物学家。日出生于英国，发育生物学家。n格登主要从事细胞核移植和克隆研究。格登主要从事细胞核移植和克隆研究。n20世纪世纪60年代所做一个划时代实验：把美洲爪蟾的小年代所做一个划时代实验：把美洲爪蟾的小肠上皮细胞核注入去核的卵细胞，结果发现一部分卵肠上皮细胞核注入去核的卵细胞，结果发现一部分卵依然可以发育成蝌蚪，其中的一部分蝌蚪可以继续发依然可以发育成蝌蚪，其中的一部分蝌蚪可以继续发育成为成熟的爪蟾。育成为成熟的爪蟾。n当当1997年多利羊诞生之后，这种技术被广为所知年多利羊诞生之后，这种技术被广为所知“克克隆隆”。n从科学蠢材从科学蠢材英国皇家学会院士英国皇家学会院士剑桥大学教授剑桥大学教授拉拉斯克基础医学研究奖斯克基础医学研究奖诺贝尔尔奖获得者得者约翰约翰伯特兰伯特兰格登格登23至今已分离得到的胚胎干细胞物种有：至今已分离得到的胚胎干细胞物种有：n小鼠的胚胎干细胞（小鼠的胚胎干细胞（1981）n金黄地鼠（金黄地鼠（1988）、貂（）、貂（1993）、猪（）、猪（1994，1997）、鸡（）、鸡（1996）、恒河猴（）、恒河猴（1995）、）、绒猴（绒猴（1996）。）。n分离得到人的胚胎干细胞（分离得到人的胚胎干细胞（1998），胚胎生殖），胚胎生殖细胞（细胞（1998），），目前不断报道成年组织来源的的干细胞及目前不断报道成年组织来源的的干细胞及iPS。刺激触发性多能性获得细胞刺激触发性多能性获得细胞（Stimulus-Triggered Acquisition of Pluripotency cells，STAP细胞）细胞）-2014之学术造假之学术造假n小小保保方方晴晴子子2014年年1月月发发表表于于Nature，通通讯讯作作者者为为查查尔尔斯斯维维坎坎提提，若若山山照照彦彦、笹笹井井芳芳树树和和丹丹羽羽仁仁史为共同作者史为共同作者n第第一一篇篇论论文文主主要要报报道道了了STAP现现象象的的发发现现，即即亚亚致致死死量量的的外外界界刺刺激激，例例如如弱弱酸酸环环境境，可可以以将将哺哺乳乳动动物物的的体体细细胞胞重重编编程程为为多多能能细细胞胞，并并报报道道了了如如何何从从STAP细胞中分离可扩增的多能细胞株。细胞中分离可扩增的多能细胞株。n第第二二篇篇论论文文着着重重报报告告利利用用STAP获获得得的的多多能能细细胞胞可可以以与与胚胚胎胎干干细细胞胞形形成成嵌嵌合合体体，并并且且对对胚胚胎胎和和胎胎盘盘等等组织发育有贡献组织发育有贡献24n1983年出生年出生n20082009年年，在在哈哈佛佛大大学学医医学学部部查查尔尔斯斯维维坎坎提提（CharlesVacanti）教教授授的的研研究究室室中中留留学学工工作作，从事万能细胞相关研究从事万能细胞相关研究n2011年年，早早稻稻田田大大学学博博士士毕毕业业，加加入入日日本本理理化化学学研研究所若山照彦研究团队究所若山照彦研究团队n2013年年升升任任日日本本理理化化学学研研究究所所发发育育与与再再生生医医学学综综合合研究中心学术带头人研究中心学术带头人25小保方晴子小保方晴子造假质疑造假质疑n可重复性质疑可重复性质疑n论文造假质疑论文造假质疑n博士论文造假博士论文造假n公布调查结果：公布调查结果：2014年年4月，确认造假月，确认造假n论文撤回：论文撤回：2014年年7月月n上司自杀：上司自杀：2014年年8月月5日上午，笹井芳树在日本理化学研究日上午，笹井芳树在日本理化学研究的一栋研究楼内上吊自杀的一栋研究楼内上吊自杀n2014年年9月月1日维坎提教授辞去哈佛大学所属布莱根妇女医院日维坎提教授辞去哈佛大学所属布莱根妇女医院“麻醉、术前和疼痛医药科麻醉、术前和疼痛医药科”主任职务，并休假一年主任职务，并休假一年n小保方晴子在监控下重复试验，小保方晴子在监控下重复试验，2014年年12月月19日，日本理日，日本理化学研究所公布化学研究所公布STAP细胞事件细胞事件结论，小保方晴子未能制作出结论，小保方晴子未能制作出这种细胞，实验宣告结束。小保方晴子宣布辞职。这种细胞，实验宣告结束。小保方晴子宣布辞职。n日本早稻田大学于日本早稻田大学于2015年年11月月2日宣布，正式取消小保方晴日宣布，正式取消小保方晴子的博士学位子的博士学位。26第三条泳道与其他部分的颜色深浅不一致 第二篇文章的Fig.1b和Fig.2g有相似之处 左图为博士论文中照片，表示该细胞原本就处于胚胎状态；右图为自然杂志照片，表示在另外一个不同的实验中通过不同的实验刺激而回到胚胎状态 28四、胚胎干细胞的体外培养胚胎干细胞的体外培养（一）技术原理（一）技术原理n基本原则：基本原则：促进促进ES增殖的同时，维持其未增殖的同时，维持其未分化的二倍体状态。分化的二倍体状态。n有饲养层（有饲养层（feederlayer）培养法：）培养法：利用饲利用饲养层细胞分泌的生长因子养层细胞分泌的生长因子FGF和抑制干细胞和抑制干细胞分化因子白血病抑制因子（分化因子白血病抑制因子（LIF）共同作用，）共同作用，保持干细胞在体外克隆而不分化。保持干细胞在体外克隆而不分化。n无饲养层培养法：无饲养层培养法：利用各种能分泌抑制分化利用各种能分泌抑制分化因子的细胞制备条件培养基或在基础培养基因子的细胞制备条件培养基或在基础培养基中加入重组的中加入重组的LIF制备条件培养基。制备条件培养基。29（二）基本过程（二）基本过程饲养层细胞制备或饲养层细胞制备或条件培养基制备条件培养基制备胚胎的制备和培养胚胎的制备和培养胚胎干细胞的分离胚胎干细胞的分离胚胎干细胞的培养胚胎干细胞的培养胚胎干细胞的鉴定胚胎干细胞的鉴定冻存与复苏冻存与复苏细胞克细胞克隆形态隆形态碱性磷酸碱性磷酸酶检测酶检测核型的核型的鉴定鉴定分化能力分化能力的观察的观察嵌合能力嵌合能力的测定的测定301、饲养层细胞培养、饲养层细胞培养n小鼠胚胎成纤维细胞（小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）：取孕：取孕12.5-14.5d鼠胚胎躯干，以植块培养法或分散细胞培鼠胚胎躯干，以植块培养法或分散细胞培养法制备，取第三代至第五代细胞作为饲养层细养法制备，取第三代至第五代细胞作为饲养层细胞。胞。n小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系（STO）细胞：）细胞：按照一般已建细胞系培养方法。按照一般已建细胞系培养方法。nDMEM加加10%小牛血清作为培养液。小牛血清作为培养液。n采用胎数多小鼠一次大量培养采用胎数多小鼠一次大量培养MEF冻存，用时复冻存，用时复苏。苏。31MEF和和STO的优缺点：的优缺点：MEF分泌促进胚胎干细胞增殖和抑制分化因子的分泌促进胚胎干细胞增殖和抑制分化因子的能力比能力比STO强，强，STO作饲养细胞时常需在培养基作饲养细胞时常需在培养基中加入中加入LIF。MEF不能长期传代，需经常准备怀孕小鼠制备第不能长期传代，需经常准备怀孕小鼠制备第三代至第五代细胞，三代至第五代细胞，STO则可长期传代培养。则可长期传代培养。MEF不具耐药性，不能作为转染外源性基因的胚不具耐药性，不能作为转染外源性基因的胚胎干细胞筛选用。胎干细胞筛选用。SNL细胞为转染了细胞为转染了neor抗性基因和抗性基因和LIF基因的基因的STO细胞，可分泌足够的抑制分化因子，并因带细胞，可分泌足够的抑制分化因子，并因带有有neor抗性基因可用于转基因胚胎干细胞筛选。抗性基因可用于转基因胚胎干细胞筛选。32胚胎干细胞培养过程中，死亡胚胎干细胞培养过程中，死亡MEF或或STO的染色的染色体可能导致胚胎干细胞的突变及影响正常核型的体可能导致胚胎干细胞的突变及影响正常核型的保持。保持。不易获得纯的胚胎干细胞作为生化和分子生物学不易获得纯的胚胎干细胞作为生化和分子生物学方面的分析。方面的分析。使用前如用丝裂霉素使用前如用丝裂霉素C处理，如清洗不彻底，残处理，如清洗不彻底，残余的丝裂霉素余的丝裂霉素C会影响胚胎干细胞的增殖。会影响胚胎干细胞的增殖。33报道的人源性滋养层细胞：报道的人源性滋养层细胞：n人骨髓来源的间充质干细胞人骨髓来源的间充质干细胞n胎儿肌肉或胎儿皮肤细胞胎儿肌肉或胎儿皮肤细胞n新生儿包皮成纤维细胞新生儿包皮成纤维细胞n成人子宫内膜细胞成人子宫内膜细胞n人胎盘成纤维细胞人胎盘成纤维细胞n人胚胎干细胞经分化获取的间充质干细胞人胚胎干细胞经分化获取的间充质干细胞342、饲养单层制备、饲养单层制备MEF或或STO连连成成一一片片，以以含含10g/ml丝裂裂霉霉素素培培养养液液370C作作用用2-3h（如如细胞胞层较薄薄，也也可可缩短短至至30min-1.5h），或或射射线照射（照射（剂量量为30-100Gy30-100Gy）。）。弃含弃含丝裂霉素培养液，裂霉素培养液，PBS洗洗5次，次，射射线处理者不用清洗。理者不用清洗。消消化化细胞胞，制制备悬液液种种植植至至用用0.1%0.1%明明胶胶处理理过（0.1%0.1%明明胶胶水水溶溶液液覆覆盖盖培培养养瓶瓶表表面面，室室温温2h2h以以上上）的的培培养养瓶瓶，种种植植细胞胞数：数：MEF7.5104-105个个/cm2，STO为为5104个个/cm2。培培养养至至细细胞胞连连成成一一片片没没有有间间隙隙（中中间间可可补补加加处处理理过过的的细细胞胞），制制备备好好的的饲饲养养单单层层置置培培养养箱箱，5天天内内使使用用，使使用用前前换换成成干干细细胞培养液。胞培养液。35观察：观察：好的饲养单层，细胞连成一片，无间隙，死亡好的饲养单层，细胞连成一片，无间隙，死亡细胞和杂细胞极少。细胞和杂细胞极少。MEF和和STO产生的抑制分化因子一部分分泌到产生的抑制分化因子一部分分泌到培养液中，一部分锚定在细胞外基质上。无间培养液中，一部分锚定在细胞外基质上。无间隙的饲养单层保证了胚胎干细胞都能与饲养层隙的饲养单层保证了胚胎干细胞都能与饲养层细胞接触而达到最佳效果。细胞接触而达到最佳效果。363、用于培养胚胎干细胞的条件培养基、用于培养胚胎干细胞的条件培养基直接在胚胎干细胞培养液中加入重组的直接在胚胎干细胞培养液中加入重组的LIF，使，使终浓度为终浓度为1000U/ml。Baffalo大鼠肝细胞株大鼠肝细胞株BRL条件培养基（条件培养基（BRL-CM):能分泌抑制畸胎癌（瘤）和胚胎干细胞分能分泌抑制畸胎癌（瘤）和胚胎干细胞分化的因子化的因子DIF。收集培养。收集培养72h的培养液，过滤除的培养液，过滤除菌，用前菌，用前6-7份份+3-4份胚胎干细胞培养液，再份胚胎干细胞培养液，再添加添加8-10%胎牛血清。胎牛血清。年龄年龄2-3周大鼠心肌细胞条件培养基（周大鼠心肌细胞条件培养基（RH-CM）：分泌抑制胚胎干细胞分化因子。收集）：分泌抑制胚胎干细胞分化因子。收集1-6代细胞培养液，过滤除菌，用前代细胞培养液，过滤除菌，用前6份份+3份胚胎份胚胎干细胞培养液干细胞培养液+1份胎牛血清。份胎牛血清。374、胚胎干细胞的分离和培养、胚胎干细胞的分离和培养（1）培养液）培养液配制培养液要用超纯水或五蒸水，不能有细菌内毒素配制培养液要用超纯水或五蒸水，不能有细菌内毒素污染，水要现用现制。污染，水要现用现制。高糖高糖DMEM作为基础培养基，葡萄糖浓度为作为基础培养基，葡萄糖浓度为（4.5g/L）：有助于囊胚贴壁、内细胞团增殖及胚胎）：有助于囊胚贴壁、内细胞团增殖及胚胎干细胞集落形成。干细胞集落形成。使用前还要添加使用前还要添加-巯基乙醇（基乙醇（0.1mmol/L）或）或单硫甘硫甘油（油（0.15mmol/L）：保）：保护细胞内胞内酶和蛋白和蛋白质中的中的巯基不被氧化，促基不被氧化，促进胚胎干胚胎干细胞的胞的贴壁和克隆形成。壁和克隆形成。使用前要添加使用前要添加15%胎牛血清：必不可少，但也有缺点。胎牛血清：必不可少，但也有缺点。38血清缺点：血清缺点：成分复杂，不利于整合到胚胎干细胞基因组中外源性基因功能的测定；可能含有一些未知的促进胚胎干细胞分化的因子；含有微量的血红蛋白和内毒素，干扰胚胎干细胞生长。无血清胚胎干细胞培养液无上述缺点，但细胞贴附力不如有血清培养基。血清应用之前要进行质量和效率（细胞克隆形成血清应用之前要进行质量和效率（细胞克隆形成率）检测、血清灭活。率）检测、血清灭活。39（2）胚胎干细胞的分离胚胎干细胞的分离小鼠：小鼠：母小鼠超数排卵交配（注射孕马血清促性腺激素和人绒毛母小鼠超数排卵交配（注射孕马血清促性腺激素和人绒毛膜促性腺激素）（远交小鼠制备胚胎）膜促性腺激素）（远交小鼠制备胚胎）胚胎采集：取孕胚胎采集：取孕3.5d（囊胚期或桑椹期）的母小鼠胚胎（囊胚期或桑椹期）的母小鼠胚胎胚胎培养：培养皿内制备直径胚胎培养：培养皿内制备直径0.5cm左右露滴状培养液液左右露滴状培养液液滴，并覆盖透明石蜡油，胚胎置于液滴中培养至囊腔充滴，并覆盖透明石蜡油，胚胎置于液滴中培养至囊腔充分扩展（也可直接置饲养层培养）分扩展（也可直接置饲养层培养）胚胎干细胞普通分离法：胚胎置饲养层继续培养胚胎干细胞普通分离法：胚胎置饲养层继续培养2-4d，消，消化分离内细胞团（化分离内细胞团（innercellmass，ICM），分散为），分散为3-4个细胞在一起的细胞团个细胞在一起的细胞团40胚胎早期发生：囊胚形成胚胎早期发生：囊胚形成（囊胚内细胞团）（囊胚内细胞团）41人胚胎干细胞来源人胚胎干细胞来源a.自终止妊娠（自终止妊娠（5-9周人工流产）的胎儿周人工流产）的胎儿中提取生中提取生殖母细胞殖母细胞(primordialgermcell)。42b.b.b.b.取自体外受精胚胎囊胚期内层细胞。取自体外受精胚胎囊胚期内层细胞。取自体外受精胚胎囊胚期内层细胞。取自体外受精胚胎囊胚期内层细胞。用这种用这种方法，每个胚胎可取得方法，每个胚胎可取得1520个细胞用于培个细胞用于培养。养。43c.c.通过体细胞核转移技术通过体细胞核转移技术（SCNT技术）技术）获取获取4446（3）胚胎干细胞培养）胚胎干细胞培养有饲养层细胞培养：有饲养层细胞培养：将内细胞团吸置处理过的饲养层上，一个内细将内细胞团吸置处理过的饲养层上，一个内细胞团放置一个孔，胞团放置一个孔，370C、5%CO2、饱和湿度、饱和湿度培养培养2d后出现小集落，并逐步增大，后出现小集落，并逐步增大，6-10d可消化可消化传代，消化时，消化传代，消化时，消化30s后弃消化液，残余消后弃消化液，残余消化液继续作用，当饲养单层出现裂隙（或显微化液继续作用，当饲养单层出现裂隙（或显微镜下细胞之间分开），终止消化，一般为镜下细胞之间分开），终止消化，一般为2-3min加适量培养液，轻轻吹打成单细胞悬液，接种加适量培养液，轻轻吹打成单细胞悬液，接种新饲养层扩大培养。新饲养层扩大培养。无饲养层培养：无饲养层培养：明胶包被培养板，条件培养基。明胶包被培养板，条件培养基。47胚胎干细胞建系及常规培养：胚胎干细胞建系及常规培养：分散克隆培养建系，第一次分散原代克分散克隆培养建系，第一次分散原代克隆后，为避免非干细胞污染，可再进行隆后，为避免非干细胞污染，可再进行克隆。克隆。常规培养：生长至常规培养：生长至80%汇合（生长旺盛汇合（生长旺盛2-3d）时传代，消化成单细胞悬液，添）时传代，消化成单细胞悬液，添加新的培养液，按照加新的培养液，按照1：3或或1：6比例转比例转种。种。48注意事项：注意事项：最初分离的内细胞团以最初分离的内细胞团以3-4个细胞团为宜，但个细胞团为宜，但集落形成后，传代过程中一定要消化成单细胞，集落形成后，传代过程中一定要消化成单细胞，否则胚胎干细胞会互相诱导，易于分化。否则胚胎干细胞会互相诱导，易于分化。培养条件要始终如一。培养条件要始终如一。为了增强胚胎干细胞粘附力，除明胶包被外，为了增强胚胎干细胞粘附力，除明胶包被外，还可以用纤维连接蛋白和多聚赖氨酸等促进粘还可以用纤维连接蛋白和多聚赖氨酸等促进粘附。附。细胞系建成后，应尽快做核型分析，以检测染细胞系建成后，应尽快做核型分析，以检测染色体和性染色体组成。色体和性染色体组成。对已建立的永久性和长期培养的细胞系，需不对已建立的永久性和长期培养的细胞系，需不断筛选，去除异常细胞。断筛选，去除异常细胞。49（4）培养结果）培养结果hES细胞集落（10）胚胎干细胞呈集落状（岛屿状）生长，边缘整齐，表胚胎干细胞呈集落状（岛屿状）生长，边缘整齐，表面平滑，结构致密，隆起生长，细胞之间界限不清。面平滑，结构致密，隆起生长，细胞之间界限不清。消化成单细胞后细胞小而圆，核大，胞浆小。消化成单细胞后细胞小而圆，核大，胞浆小。505、胚胎干细胞的冻存和复苏、胚胎干细胞的冻存和复苏n冻存液：胚胎干细胞培养液冻存液：胚胎干细胞培养液+10%-15%DMSO。n冻存细胞密度：冻存细胞密度：106-107个个/mln冻存与复苏方法同普通细胞。冻存与复苏方法同普通细胞。nLIF条件培养基培养的细胞，仍然用不含条件培养基培养的细胞，仍然用不含LIF的的胚胎干细胞培养液冻存。胚胎干细胞培养液冻存。51（三）胚胎干细胞的鉴定（三）胚胎干细胞的鉴定1、ES细胞生物学特性细胞生物学特性（1）ES细胞形态结构及核型细胞形态结构及核型nES细胞具有与早期胚胎细胞细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，胞体体积相似的形态结构，胞体体积小，核大，有一个或几个核小，核大，有一个或几个核仁。仁。n细胞中多为常染色质，胞质细胞中多为常染色质，胞质结构简单，散布着大量核糖结构简单，散布着大量核糖体和线粒体，体和线粒体，核型正常，保核型正常，保留了二倍体性质留了二倍体性质。正常。正常ES细细胞染色体正常，如发生异常胞染色体正常，如发生异常则其很难发育分化形成动物则其很难发育分化形成动物个体。个体。52（2）ES细胞生长特性细胞生长特性nES细胞在体外分化抑制培养中，呈克隆状生长，细胞在体外分化抑制培养中，呈克隆状生长，细胞紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞界限细胞紧密地聚集在一起，形似鸟巢，细胞界限不清，克隆周围有时可见单个不清，克隆周围有时可见单个ES细胞和分化的细胞和分化的扁平状上皮细胞。扁平状上皮细胞。nES细胞增殖迅速，每细胞增殖迅速，每1824h分裂增殖分裂增殖1次。次。n此外，其还可以在体外进行选择、操作、冻存。此外，其还可以在体外进行选择、操作、冻存。冻存的细胞可在需要时随时解冻，继续培养不冻存的细胞可在需要时随时解冻，继续培养不失其原有特性，并且来自一个克隆的细胞具有失其原有特性，并且来自一个克隆的细胞具有同样的特征。同样的特征。53人胚胎干细胞人胚胎干细胞(hES)(hES)的特点的特点 形态形态：圆形或椭圆形或椭圆，体积较小，圆，体积较小，核质比较大，体核质比较大，体外抑制分化培养外抑制分化培养时呈鸟巢状，集时呈鸟巢状，集落生长并紧密堆落生长并紧密堆积，细胞界限不积，细胞界限不明显。明显。54 （3）ES细胞的高度分化潜能细胞的高度分化潜能 ES细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未分细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未分 化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。化状态，一旦脱离饲养层就自发地进行分化。在单层培养时细胞自发分化成多种细胞，在单层培养时细胞自发分化成多种细胞，悬浮培养中：悬浮培养中：“简单类胚体简单类胚体”“囊状胚体囊状胚体”细胞分化物。细胞分化物。ES细胞可进行诱导分化细胞可进行诱导分化 *用用RA（维（维A酸或视黄酸）作诱导酸或视黄酸）作诱导90以上的以上的ES细胞细胞 分化为神经胶质细胞，分化为神经胶质细胞，*聚集培养的聚集培养的ES细胞诱导分化则可分化为有节律性收缩细胞诱导分化则可分化为有节律性收缩 的心肌细胞。的心肌细胞。*将将ES细胞注射到同源动物皮下，可形成组织瘤，其细胞细胞注射到同源动物皮下，可形成组织瘤，其细胞 组成可代表组成可代表3个胚层细胞。个胚层细胞。*用用ES细胞作核供体进行细胞核移植，可以得到可发育重细胞作核供体进行细胞核移植，可以得到可发育重 构胚和动物个体。构胚和动物个体。55胚胎干细胞体外诱导分化胚胎干细胞体外诱导分化n外源诱导因子诱导外源诱导因子诱导ES细胞分化细胞分化 诱导因子：维甲酸诱导因子：维甲酸(RA)、骨形成蛋白、骨形成蛋白BMPs)、成纤维、成纤维细胞生长因子细胞生长因子(FGFs)等等n转基因诱导转基因诱导ES细胞分化细胞分化 用转基因技术使某种促分化基因在用转基因技术使某种促分化基因在ES细胞中表达、调细胞中表达、调节其分化节其分化n与其他细胞共培养诱导与其他细胞共培养诱导ES细胞分化细胞分化 创造细胞分化的微环境创造细胞分化的微环境56 胎牛血清，骨髓基质细胞共培养胎牛血清，骨髓基质细胞共培养胚胎干细胞胚胎干细胞造血细胞造血细胞 RA胚胎干细胞胚胎干细胞神经细胞神经细胞 DMSO胚胎干细胞胚胎干细胞肌肉细胞肌肉细胞 TGF-1,VEGF,bFGF胚胎干细胞胚胎干细胞血管和内皮细胞血管和内皮细胞 RA+胰岛素胰岛素+T3胚胎干细胞胚胎干细胞脂肪细胞脂肪细胞 BMP-2,BMP-4胚胎干细胞胚胎干细胞软骨细胞软骨细胞 地塞米松，磷酸甘油地塞米松，磷酸甘油胚胎干细胞胚胎干细胞骨细胞骨细胞 基因转染基因转染胚胎干细胞胚胎干细胞胰岛素分泌细胞胰岛素分泌细胞57（4 4）碱性磷酸酶和端粒酶活性高碱性磷酸酶和端粒酶活性高 许许多多资资料料表表明明，小小鼠鼠、大大鼠鼠的的桑桑椹椹胚胚细细胞胞和和囊囊胚胚细细胞胞均均有有碱碱性性磷磷酸酸酶酶（AKP）表表达达，小小鼠鼠的的EC细细胞胞和和ES细细胞胞中中均均含含有有丰丰富富的的AKP。而而在在已已分分化化的的EC细细胞胞和和ES细细胞胞中中AKP呈呈弱弱阳阳性性或或阴阴性性。猪猪、兔兔的的桑桑椹椹胚胚和和早早期期囊囊胚胚AKP呈呈阳阳性性。因因此此，AKP常常用用来来作作为为鉴鉴定定EC细细胞胞或或ES细细胞胞分分化化与与否否的的标标志志之之一。一。58（5 5）胚胎阶段特异性细胞表面抗原及标志基因的表达）胚胎阶段特异性细胞表面抗原及标志基因的表达 早早期期胚胚胎胎细细胞胞表表面面均均表表达达胚胚胎胎阶阶段段特特异异性性表表面面抗抗原原（SSEA-1）。在在胚胚胎胎的的原原始始外外胚胚层层细细胞胞、ES细细胞胞、EC细细胞胞和和原原始始生生殖殖细细胞胞的的表表面面均均可可检检测测到到SSEA-1的的表表达达。小小鼠鼠SSEA-1的的表表达达自自8细细胞胞期期开开始始，直直到到原原始始外外胚胚层层形形成成期期。早早期期囊囊胚胚ICM细细胞胞全全部部呈呈强强阳阳性性，晚晚期期囊囊胚胚中中部部分分ICM呈呈强强阳阳性性，部部分分呈呈弱弱阳阳性性，少少部部分分为为阴阴性性。因因此此，SSEA也也常常作作为为ES细胞鉴定的一个标志。细胞鉴定的一个标志。标志基因不断被发现：标志基因不断被发现：OCT3/4、SOX2+、E-RAS、FGF,等等59 2、ES细胞的全能性细胞的全能性主要体现在以下几方面：主要体现在以下几方面：形形成成畸畸胎胎瘤瘤。将将ES细细胞胞注注人人同同源源动动物物皮皮下下可可形形成成畸胎瘤，包括三个胚层细胞；畸胎瘤，包括三个胚层细胞；形形成成类类胚胚体体。培培养养ES细细胞胞在在非非粘粘附附底底物物中中悬悬浮浮生生长长，或或控控制制增增殖殖细细胞胞数数目目，能能够够使使之之生生成成类类胚胚体体，它它是是一一个个与与畸畸胎胎瘤瘤相相似似的的多多种种细细胞胞系系混混杂杂的的集集合合体体、具有三个胚层组织；具有三个胚层组织；60 直系分化。通过控制直系分化。通过控制ES细胞生长环境，或遗传操细胞生长环境，或遗传操纵特定基因表达，纵特定基因表达，ES细胞可直接分化成某特定种系细胞可直接分化成某特定种系细胞，例如将神经决定基因细胞，例如将神经决定基因NeuroD2和和NeuroD3转人转人ES细胞，可使之分化为神经细胞；细胞，可使之分化为神经细胞；形成嵌合体。将形成嵌合体。将ES细胞注射到同种动物囊胚腔中细胞注射到同种动物囊胚腔中后，可以形成嵌合体（后，可以形成嵌合体（chimera），），ES细胞可以参与细胞可以参与嵌合体各个器官包括生殖腺的发育。这是嵌合体各个器官包括生殖腺的发育。这是检验一个细检验一个细胞系是否为胞系是否为ES细胞的标准细胞的标准。613 3、ESES细胞的鉴定细胞的鉴定-细胞的形态结构细胞的形态结构-核型分析核型分析-碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（AKPAKP）染色）染色-特异表面抗原及标志物检测特异表面抗原及标志物检测-分化能力检测分化能力检测 体外分化试验体外分化试验 体内分化试验体内分化试验 嵌合体形成试验嵌合体形成试验 核移植试验核移植试验62 （1）ES细胞形态学鉴定细胞形态学鉴定 依依ES细胞的形态结构（胞体体积小，细胞的形态结构（胞体体积小，核大、有一个或几个核仁）和生长特性核大、有一个或几个核仁）和生长特性（呈克隆状生长，细胞紧密聚集，形似（呈克隆状生长，细胞紧密聚集，形似鸟巢，界限不清）对鸟巢，界限不清）对ES细胞进行初步鉴细胞进行初步鉴定。定。63 （2）核型分析）核型分析 ES细胞具有正常二倍体核型，可用核型细胞具有正常二倍体核型，可用核型分析进行检验分析进行检验64 （3 3）碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（AKPAKP）染色）染色原理：原理：AKP在碱性条件（在碱性条件（pH9.0-9.6）下能使孵育液中的）下能使孵育液中的-磷磷酸奈酚钠水解，产生酸奈酚钠水解，产生-奈酚，然后再与偶氮盐偶联，形成不奈酚，然后再与偶氮盐偶联，形成不溶性染料而呈现颜色。溶性染料而呈现颜色。步骤：步骤：生长胚胎干细胞克隆的盖片以无水乙醇或冷丙酮固定生长胚胎干细胞克隆的盖片以无水乙醇或冷丙酮固定10-15min水洗水洗滴加孵育液室温滴加孵育液室温5-10min水洗水洗10min复复染（甲基绿等）染（甲基绿等）10min。结果：结果：未分化胚胎干细胞颜色以所用偶氮盐品种而异，分化未分化胚胎干细胞颜色以所用偶氮盐品种而异，分化者则为复染液颜色。者则为复染液颜色。对照：对照：以已建系以已建系ES细胞（或小鼠的桑椹胚或囊胚）作为阳性细胞（或小鼠的桑椹胚或囊胚）作为阳性对照，作用液中不含对照，作用液中不含-萘酚磷酸钠为阴性对照。萘酚磷酸钠为阴性对照。65（4）胚胎干细胞特异表面抗原及标志物的检测）胚胎干细胞特异表面抗原及标志物的检测n免疫荧光、免疫组化、免疫荧光、免疫组化、Western-blot、RT-PCR、流式细胞仪、流式细胞仪胚胎阶段特异性抗原胚胎阶段特异性抗原:SSEA-1SSEA-3SSEA-4Thmoson分离的分离的hES阴性阴性弱阳性弱阳性强阳性强阳性Gearhart分离的分离的hES阳性阳性弱阳性弱阳性阳性阳性小鼠小鼠ES阳性阳性阴性阴性阴性阴性鼠和人胚胎干细胞表达的表面抗原有种属差异。鼠和人胚胎干细胞表达的表面抗原有种属差异。66（5）分化能力检测）分化能力检测n体外分化能力观察体外分化能力观察:无饲养层和无抑制分无饲养层和无抑制分化因子的条件下培养，胚胎干细胞会分化因子的条件下培养，胚胎干细胞会分化成各种细胞或发育成胚胎体：化成各种细胞或发育成胚胎体：3d“简简单类胚体单类胚体”5-10d“囊状胚体囊状胚体”贴贴壁细胞为壁细胞为细胞分化物。细胞分化物。67n体内分化能力观察：体内分化能力观察：ES细胞接种同一品系小鼠腹股沟或腹腔（细胞接种同一品系小鼠腹股沟或腹腔（107个个细胞）或裸鼠、细胞）或裸鼠、SCID小鼠（小鼠（106个细胞）个细胞）约约2 2周后出现肿块，周后出现肿块，4-54-5周进一步增大，摘除肿块周进一步增大，摘除肿块固定切片染色：见三个胚层组织，为畸胎瘤固定切片染色：见三个胚层组织，为畸胎瘤结构结构68n嵌合能力测定：嵌合能力测定：野灰色小鼠品系（如野灰色小鼠品系（如129鼠）鼠）ES白化体小鼠（白化体小鼠（BALB/c小鼠）或纯合非野灰色小小鼠）或纯合非野灰色小鼠（鼠（C57BL/6小鼠）着床前胚胎内小鼠）着床前胚胎内假孕母鼠子宫内，使之发育成个体假孕母鼠子宫内，使之发育成个体嵌合体小鼠：毛色是嵌合体小鼠：毛色是ES细胞来源品系小鼠和胚胎细胞来源品系小鼠和胚胎供体小鼠毛色的杂合，即有白色皮毛也有野灰供体小鼠毛色的杂合，即有白色皮毛也有野灰色或黑色皮毛。色或黑色皮毛。除毛色观察，也可检测同工酶遗传标记，除毛色观察，也可检测同工酶遗传标记，或采用或采用PCR和小卫星和小卫星DNA方法等鉴定嵌合体。方法等鉴定嵌合体。注射注射移植移植发育发育69（四）胚胎干细胞研究的意义及面临的问题（四）胚胎干细胞研究的意义及面临的问题意义：意义：ES细胞在哺乳动物个体发生发育规律的研究中极有细胞在哺乳动物个体发生发育规律的研究中极有价值的工具；价值的工具；ES细胞是研究细胞是研究细胞分化细胞分化的理想手段；的理想手段；ES细胞是研究基因功能的首选细胞；细胞是研究基因功能的首选细胞；ES细胞作为生产转基因动物的主要途径之一；细胞作为生产转基因动物的主要途径之一；ES细胞有可能成为今后细胞替代疗法和组织器官移细胞有可能成为今后细胞替代疗法和组织器官移植的最佳来源；植的最佳来源；ES细胞可用于研究细胞癌变机理和新药物的筛选。细胞可用于研究细胞癌变机理和新药物的筛选。70ES研究面临的难题：研究面临的难题：（1 1）体外培养）体外培养ESES细胞应当是既能快速无限增殖，又呈未分化细胞应当是既能快速无限增殖，又呈未分化状态，目前在状态，目前在ESES细胞研究中存在着细胞研究中存在着建系成功率不高等建系成功率不高等问题。问题。（2 2）ES ES 细胞具有细胞具有形成畸胎瘤形成畸胎瘤的可能性的可能性,因此在使用因此在使用ESES细胞细胞进行治疗前必须首先体外诱导进行治疗前必须首先体外诱导ESES细胞分化产生某种特异的组细胞分化产生某种特异的组织细胞或设计自杀基因织细胞或设计自杀基因,当移植的细胞向肿瘤发展时当移植的细胞向肿瘤发展时,自杀基自杀基因能启动自毁机制使其凋亡。因能启动自毁机制使其凋亡。但如何诱导但如何诱导ESES细胞定向分化成单一类型的分化细胞细胞定向分化成单一类型的分化细胞,尚尚未完全解决。未完全解决。必须必须寻找各种细胞定向诱导分化的条件和方法寻找各种细胞定向诱导分化的条件和方法，以及不，以及不同干细胞的表面标志和分选技术，从而得到所需要的细胞或同干细胞的表面标志和分选技术，从而得到所需要的细胞或组织。组织。71（3）ES细胞真正用于器官克隆与移植仍需要技术上细胞真正用于器官克隆与移植仍需要技术上的突破，因为器官的形成是一个非常复杂的三维过的突破，因为器官的形成是一个非常复杂的三维过程程,很多器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成很多器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的。即便是发育完整的来自自然机体的器官的。即便是发育完整的来自自然机体的器官,要离体要离体培养并维持其正常的生理功能目前还无法做到培养并维持其正常的生理功能目前还无法做到,器官器官的体外保存和维持仍是器官移植中的难题。的体外保存和维持仍是器官移植中的难题。（4）最大的障碍来自于伦理学问题最大的障碍来自于伦理学问题，特别是，特别是ES细胞细胞应用受到伦理、法律、宗教以及社会因素的强烈反应用受到伦理、法律、宗教以及社会因素的强烈反对，有些国家甚至明令禁止进行人类对，有些国家甚至明令禁止进行人类ES细胞研究。细胞研究。72五、五、成体干细胞成体干细胞n自然条件下成体干细胞倾向于分化成所自然条件下成体干细胞倾向于分化成所在组织的细胞，参与组织更新和损伤修在组织的细胞，参与组织更新和损伤修复；复；n外界条件诱导下成体干细胞也可横向分外界条件诱导下成体干细胞也可横向分化成其他组织的细胞，参与这些组织的化成其他组织的细胞，参与这些组织的损伤修复。损伤修复。73优点优点n源于患者自身的成体干细胞在应用时不存源于患者自身的成体干细胞在应用时不存在组织相容性的问题，避免了移植排斥反在组织相容性的问题，避免了移植排斥反应和使用免疫抑制剂应和使用免疫抑制剂n理论上，成体干细胞致瘤风险很低，而且理论上，成体干细胞致瘤风险很低，而且所受伦理学争议较少所受伦理学争议较少n成体干细胞还具有多向分化潜能成体干细胞还具有多向分化潜能 74但胚胎干细胞也存在自身的优势：但胚胎干细胞也存在自身的优势：n胚胎干细胞能永生化，可以传代建系，且增殖能力强，胚胎干细胞能永生化，可以传代建系，且增殖能力强，来源充沛。来源充沛。n虽然成体干细胞具有向多系分化的能力，但这种分化虽然成体干细胞具有向多系分化的能力，但这种分化的的“效率效率”尚不理想。通过体外的扩增培养能提高转尚不理想。通过体外的扩增培养能提高转化效率，但是体外的转化是否会引起成体干细胞遗传化效率，但是体外的转化是否会引起成体干细胞遗传变化还有待证实，而且这种分化是否是成体干细胞多变化还有待证实，而且这种分化是否是成体干细胞多系分化的结果尚无法肯定。系分化的结果尚无法肯定。n成体干细胞和胚胎干细胞各有自身的优势和缺陷。成体干细胞和胚胎干细胞各有自身的优势和缺陷。75 成体干细胞分离纯化成体干细胞分离纯化 -利用细胞表面标志分离利用细胞表面标志分离单克隆抗体的特异性和多样性是利用不同抗体的单克隆抗体的特异性和多样性是利用不同抗体的合理组合分离不同类型的细胞成为可能。合理组合分离不同类型的细胞成为可能。阳性细胞分选法：阳性细胞分选法：从混杂细胞群体中获得表达与从混杂细胞群体中获得表达与抗体相应膜抗原的细胞群；抗体相应膜抗原的细胞群；阴性细胞分选法：阴性细胞分选法：除去表达与抗体相应膜抗原的除去表达与抗体相应膜抗原的细胞，而收集其余的细胞群体，称为阴性细胞分细胞，而收集其余的细胞群体，称为阴性细胞分选法。选法。76 技术：技术：抗体抗体/补体介导细胞溶解法：阴性细胞分选法补体介导细胞溶解法：阴性细胞分选法流式细胞仪分选法流式细胞仪分选法平面粘附分离法平面粘附分离法免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法阳性、阴性细胞分选法阳性、阴性细胞分选法77免疫溶解法免疫溶解法将待消除细胞的特异性表面标志的抗体和补将待消除细胞的特异性表面标志的抗体和补体加入细胞培养物中，使抗体及补体作用于体加入细胞培养物中，使抗体及补体作用于具有相应抗原的细胞并溶解之，而对该抗原具有相应抗原的细胞并溶解之，而对该抗原阴性的细胞进行富集。阴性的细胞进行富集。细胞溶解法适用于细胞悬液或细胞培养物中细胞溶解法适用于细胞悬液或细胞培养物中待消除细胞数量不是很大的情况。待消除细胞数量不是很大的情况。78流式细胞分选术流式细胞分选术流式细胞术（流式细胞术（Flow Flow Cytometry,FCMCytometry,FCM）是一）是一项综合应用光学、机械项综合应用光学、机械学、流体力学、电子计学、流体力学、电子计算机、细胞生物学、分算机、细胞生物学、分子免疫学等学科技术，子免疫学等学科技术，对高速流动的细胞或亚对高速流动的细胞或亚细胞进行快速定量测定细胞进行快速定量测定和分析的方法。已从基和分析的方法。已从基础研究发展到临床医学础研究发展到临床医学研究及疾病的诊断和治研究及疾病的诊断和治疗监测。疗监测。79免疫磁珠分选技术免疫磁珠分选技术用免疫磁珠做细胞分选用免疫磁珠做细胞分选(MACS)(MACS)是高效简捷的免疫是高效简捷的免疫细胞及其它细胞的分离纯化方法。细胞及其它细胞的分离纯化方法。原理是已包原理是已包被一抗的磁珠与细胞表面相应分子特异性结合，被一抗的磁珠与细胞表面相应分子特异性结合，或者已包被二抗的磁珠与预先已与细胞表面分子或者已包被二抗的磁珠与预先已与细胞表面分子特异结合的一抗结合。磁珠携带与之结合的细胞特异结合的一抗结合。磁珠携带与之结合的细胞吸附于分离柱吸附于分离柱/试管上，实现阳性细胞分离或阴试管上，实现阳性细胞分离或阴