临床分子诊断与个体化治疗课件

临床分子诊断与个体化治疗临床分子诊断与个体化治疗临床分子诊断与个体化治疗临床分子诊断与个体化治疗分子诊断o狭义分子诊断：应用分子生物学方法检测患者体内狭义分子诊断：应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出诊断的技遗传物质的结构或表达水平的变化而做出诊断的技术，称为分子诊断，包括肿瘤分子诊断、传染病分术，称为分子诊断，包括肿瘤分子诊断、传染病分子诊断、产前诊断等。子诊断、产前诊断等。o广义分子诊断：指应用分子生物学方法，对受检者广义分子诊断：指应用分子生物学方法，对受检者体内各类生物分子（包括、蛋白质等）进行定性体内各类生物分子（包括、蛋白质等）进行定性和定量分析，确定其结构或表达水平，从而为个性和定量分析，确定其结构或表达水平，从而为个性化预防、治疗提供依据的一种诊断技术，包括肿瘤化预防、治疗提供依据的一种诊断技术，包括肿瘤分子诊断、传染病分子诊断、产前诊断、单基因诊分子诊断、传染病分子诊断、产前诊断、单基因诊断、易感基因检测以及天赋基因检测等。断、易感基因检测以及天赋基因检测等。分子诊断狭义分子诊断：应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质分子诊断狭义分子诊断：应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质国内回顾o年技术在国内开始用于临床检测o年代中期:假阴性假阳性?,引发思考o年:卫生部科研课题o年月日:临床实验室管理专家咨询会o年月日:卫生部下发国内回顾年技术在国内开始用于临床检测国内回顾年技术在国内开始用于临床检测国内回顾年技术在国内开始国内回顾o年月日:,针对临床开展检验的问题,达成八点意见.o年月日:(在北京卫生部临床检验中心举办.o年月日:卫生部下发(卫医发号)国内回顾年月日:,针对临床 国内回顾年月日:,针对临床年:医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法（卫办医政发【】号）医疗机构临床基因扩增检验室工作导则（卫办医政发【】号）年:年:年:o截止到年月，全国按照所制定的标准通过验收的临床基因扩增检验实验室共余家。采用所编写的培训教材和培训模式共举办了培训班多期，培训实验室技术人员多人。涉及全国个省、直辖市和自治区。截止到年月，全国按照所制定的标准通过验收的临床基因扩增检验实截止到年月，全国按照所制定的标准通过验收的临床基因扩增检验实目前国内临床分子诊断现状o绝大部分用于病原体核酸检测o较少部分用于遗传病的产前诊断o个体化用药的分子诊断正在兴起目前国内临床分子诊断现状绝大部分用于病原体核酸检测目前国内临床分子诊断现状绝大部分用于病原体核酸检测目前国内临一些常见的认识误区o临床实验室检验科o基因（遗传携带、突变等）与病原体核酸检测完全不同o临床检验在病理科、药剂科或肿瘤科做，不属于临床检验管理？o必须达成一点共识：实验不管在哪做，都属于检验管理，必须有严格的质量控制。一些常见的认识误区临床实验室检验科一些常见的认识误区临床实验室检验科一些常见的认识误区临床实验问题与思考o问题：o应用o实验室分区o质量管理：分析前，分析中，分析后o人员：（医生、实验室技术人员）：均需“洗脑”严格的培训o出现问题，即分析问题产生的原因，采取措施加以改进o质理管理的习惯养成需要时间。问题与思考问题：问题与思考问题：问题与思考问题：几个策略比较o家族病史研究与基因研究相比较o说法不一，孰优孰劣？各有所长。o肿瘤早期诊断带来的真正收益有没有我们所希望的那么大？几个策略比较家族病史研究与基因研究相比较几个策略比较家族病史研究与基因研究相比较几个策略比较家族病史 o o 。o 国家自然科学基金委医学部主任、国家肝癌科学中心主任王红阳院士，国家自然科学基金委医 国家自然科学基金委医中国肿瘤治疗现状o治愈率,五年生存率。低于欧美国家、,低于日本和o主要原因：o ）早期诊断低o ）缺乏规范化治疗o ）经济状况差华南肿瘤国家重点实验室，中山大学肿瘤防治中心钱朝南教授中国肿瘤治疗现状治愈率,五年生存率。低于欧美国家、,低于中国肿瘤治疗现状治愈率、,预期治愈率可能大于基因多态性与丙型肝炎治疗及预后基因多态性结果判断邻近基因，基因多态性与丙型肝炎治疗及预后基因多态性结果判断邻近基因，个性化检测的局限性o一些疾病是由一个或多个基因突变引起o基因检测方法确实能对这些疾病的患病风险、确诊和治疗起指导作用o大多数疾病发生、发展及预后可能涉及更多的基因以及这些基因和环境因素相互作用o仅通过基因检测盒基因表达谱的检测有很大局限性个性化检测的局限性一些疾病是由一个或多个基因突变引起个性化检测的局限性一些疾病是由一个或多个基因突变引起个性化检：分子检测有关的主要质控要求o对于每一个检测系统，实验室由此又控制程序的责任监控整个分析过程的准确性和精密度。(（）)控制程序必须是：o检出即时误差由检测系统故障、不利于环境和操作者能力导致(（）（）)o监控检测性能的准确性和精密度检测系统能和环境的改变以及操作者的能力都可能会影响检测性能。o实验室必须确定使用检测物质的数量、类型和频率，如果适用，由实验室验证或建立性能规范(（）)o如果实验室引进了未经认可或批准的检测系统包括自主研制的方法在报告病人检测据结果前，必须建立检测系统的性能规范，如果适用，包括下面的性能特征：准确性，精密度，分析灵敏性，分析特异性，包括干扰物质。检测系统对检测结果的可报告区间，参考区间（正常值），和检测性能要求的其他性能特征。(（）（）)o包括提取过程中的检测系统包括两种质控物质，其中之一可以检出提取过程的错误。(（）（）（）)o每一扩增过程，包括两种质控材料，如果反应的抑制是假阴性结果的重要来源一个质控材料能够检出该抑制作用。(（）（）（）)：分子检测有关的主要质控要求对于每一个检测系统，实验室由此又：分子检测有关的主要质控要求对于每一个检测系统，实验室由此又国际相关机构的计划o 美国病理家协会o 美国疾病预防控制中心（基因检测质量控制物计划）o 分子诊断的质量控制o 欧洲分子遗传实验质控网o 欧洲重要病毒性疾病诊断网o 西班牙室间质评计划o 欧盟质量控制一致行动（现在被称作分子诊断的质量控制）o 意大利肿瘤标志物质量保证网o 英国国家质量保证计划国际相关机构的计划 美国病理家协会国际相关机构的计划 美国病理家协会国际相关机构的计划 美国病临床基因扩增实验室的质量控制（一）o实验室各种常规工作的规章制度o实验室技术人员的生物安全制度和保护措施o防止实验室交叉污染的实验（每月一次）o实验室的清洁和消毒制度（每周次）o实验室的原始数据、报告单的归档和信息保密制度o实验室专业人员的培训和考核制度o实验室结果差错的记录和纠正措施o计算机的系统维护和管理制度临床基因扩增实验室的质量控制（一）实验室各种常规工作的规章制临床基因扩增实验室的质量控制（一）实验室各种常规工作的规章制临床基因扩增实验室的质量控制（二）o样本接收和拒收标准：抗凝剂，采集时间量，病史。o接收标本必须有专用的登记表，并核对样本登记表中的所有信息，人复核和签字。o每批样本核酸提取的过程中加入质控标本以保证标本处理的过程中的正确性，同时建立用于不同技术平台的标准化的浓度范围。o定量检测的操作过程包括个不同浓度的对照物，以及阴性和阳性对照。o样本的保存和存储（和 冰箱）临床基因扩增实验室的质量控制（二）样本接收和拒收标准：抗凝剂临床基因扩增实验室的质量控制（二）样本接收和拒收标准：抗凝剂临床基因扩增实验室质量控制（三）o室内质控标本的来源：包括参加国内和国际质控标本，细胞株和已知实验结果的样本。o在每批实验中和每个技术平台上均加入了质控样本，从样本抽提，基因扩增，杂交和测序已知跟踪到整个实验结果，每次实验结果分析后有专门的质控报告。o实验室的技术人员每一个月，在每一个技术平台上都有一次盲样样本的质控实验，并以此评价技术人员的实验技能。临床基因扩增实验室质量控制（三）室内质控标本的来源：包括参加临床基因扩增实验室质量控制（三）室内质控标本的来源：包括参加分析的有效性p准确性p与参考方法比较p设定值的方法p精密度再现性p重复性：利用分子检测方法和同一个仪器对单个样本进行重复性研究。p再现性：再现性研究评估天与天、操作与操作间的精密度、如果使用多个仪器，要评估仪器与仪器之间的再现性；如果在多个实验室开展检测，也要评估不同实验室间的再现性。p靠近临床和整个分析检测区间内的性能p分析的线性、回收率和高剂量钩子效应p检出限值和定量限值（在高和低的范围内）p分析特异性（交叉反应，干扰）p基质效应p影响分析结果的分析前因素p分析输出（读数区间或阴阳性）p 分析的有效性准确性分析的有效性准确性分析的有效性准确性临床有效性和临床有用性o临床有效性：检测特性（敏感性、特异性、预测值和拟然比）o临床有用性：利用检测结果可以获得有效治疗或其他具体的临床获益o筛选有症状个体的检测：基因突变帕金森症。o用于诊断和监控的检测：由 研制的实验室自制检测。该检测用于确认活动性丙肝病毒（）感染、监控治疗反应和确认感染的消退。o确定预后和指导治疗的检测：利用实时荧光定量检测乳腺癌肿瘤组织样本中个基因的表达水平。o调整用药剂量的检测：指导华法林剂量的基因检测基因（编码细胞色素）和（编码维生素环氧化物还原酶复合物亚单位）的多态性。临床有效性和临床有用性临床有效性：检测特性（敏感性、特异性、临床有效性和临床有用性临床有效性：检测特性（敏感性、特异性、o病理说明：.包括“尸体病理学诊断”、“细胞病理学检查与诊断”、“组织病理学检查与诊断”、“分子病理学技术与诊断”、“特染和免疫组织化学染色与诊断”、“电子显微镜技术与诊断”和“其他”项目七个部分，共计项。o检验说明：.包括“临床血液学检验”、“临床体液检验”、“临床化学检验”、“临床免疫学检验”、“临床微生物与寄生虫学检验”和“临床分子生物学检验”项目六个部分，共计项。.组织器官移植所需的各项检验（如检查等）列入“临床血液学检验”类的“血型、输血及人类组织相关性抗原检验”类中。.”实验室诊断”中的项目不含静脉采血，需单独收费，但微量采血管（指尖采血、耳垂采血）包含在各检验项目中，不得单独收费。病理说明：.包括“尸体病理学诊断”、“细胞病理学检查与诊断”病理说明：.包括“尸体病理学诊断”、“细胞病理学检查与诊断”（四）分子病理学技术与诊断o 组织部细胞原位杂交检查诊断 石蜡包埋组织，新鲜冷冻组织，细胞涂片，组织切片机切片，进行二甲苯脱蜡，系列乙醇水化，微波炉、高压锅及蛋白酶处理，标记探针杂交反应，洗涤，酶或亲和物结合反应，显色，判读结果，含上述过程中所产生的废液、废物的处理。o 组织部细胞荧光原位杂交检查诊断 荧光素标记探针杂交反应（一种探针）。o 组织部细胞多色荧光原位杂交检查诊断 荧光素标记探针杂交反应（二种或以上探针）.o 组织部细胞荧光原位杂交技术计量分析诊断 荧光素标记探针杂交反应（二种或以上探针），图像定量分析。o 组织部细胞原位脱氧核糖核酸（）多聚酶链式反应检查诊断 原位反应，亲和物结合，显色，复染，观察，诊断。o 组织部细胞原位核糖核酸（）多聚酶链式反应检查诊断 原位逆转录反应，亲和物结合，显色，复染，观察，诊断。o 组织部细胞荧光定量脱氧核糖核酸（）多聚酶链式反应检查诊断 甲醛固定组织，石蜡包埋组织，新鲜或冷冻组织，离心收集细胞；组织粉萃机匀浆化，组织裂解，经反复离心及相应化学试剂去除蛋白，回收，于荧光仪进行荧光素反应，分析结果，诊断。o 组织部细胞荧光定量核糖核酸（）多聚酶链式反应检查诊断 回收，于于荧光仪进行荧光素逆转录反应，分析结果，诊断。o 肿瘤组织脱氧核糖核酸（）测序 反应产物琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，产物纯化，测序反应，于测序仪分析，观察结果，诊断。甲醛固定组织，石蜡包埋组织，新鲜或冷冻组织，血液或体液的处理，提取，反应及最后的测序反应纯化。（四）分子病理学技术与诊断 组织部细胞原位杂交检查诊断 （四）分子病理学技术与诊断 组织部细胞原位杂交检查诊断 临床分子生物学及细胞遗传学检验u 核糖核酸扩增定量检测u 核糖核酸非扩增定性检测u分枝杆菌菌种鉴定u结核非结核分枝杆菌核酸检测u巨细胞病毒脱氧核糖核酸扩增定性检测u巨细胞病毒脱氧核糖核酸扩增定量检测u多瘤病毒脱氧核糖核酸扩增定性检测u多瘤病毒脱氧核糖核酸扩增定量检测u病毒脱氧核糖核酸扩增定性检测u病毒脱氧核糖核酸扩增定量检测u细小病毒脱氧核糖核酸非扩增定性检测u细小病毒脱氧核糖核酸非扩增定量检测u腺病毒脱氧核糖核酸扩增定性检测u腺病毒脱氧核糖核酸扩增定量检测u淋球菌脱氧核糖核酸扩增检测u沙眼衣原体脱氧核糖核酸扩增检测u人乳头瘤病毒脱氧核糖核酸扩增检测u人乳头瘤病毒脱氧核糖核酸非扩增定性检测u人乳头瘤病毒基因分型检测u流感病毒核糖核酸检测 .感染性疾病分子生物学检验感染性疾病分子生物学检验感染性疾病分子生物学检验感染性疾病分子生物学检验病原体脱氧核糖核酸扩增定性检测病原体脱氧核糖核酸扩增定性检测病原体脱氧核糖核酸扩增定性检测病原体脱氧核糖核酸扩增定性检测病原体脱氧核糖核酸扩增定量检测病原体脱氧核糖核酸扩增定量检测病原体脱氧核糖核酸扩增定量检测病原体脱氧核糖核酸扩增定量检测病原体脱氧核糖核酸非扩增定性检病原体脱氧核糖核酸非扩增定性检病原体脱氧核糖核酸非扩增定性检病原体脱氧核糖核酸非扩增定性检测测测测病原体脱氧核糖核酸非扩增定性检病原体脱氧核糖核酸非扩增定性检病原体脱氧核糖核酸非扩增定性检病原体脱氧核糖核酸非扩增定性检测测测测病原体核糖核酸扩增定性检测病原体核糖核酸扩增定性检测病原体核糖核酸扩增定性检测病原体核糖核酸扩增定性检测病原体核糖核酸扩增定量检测病原体核糖核酸扩增定量检测病原体核糖核酸扩增定量检测病原体核糖核酸扩增定量检测病原体核糖核酸非扩增定性检测病原体核糖核酸非扩增定性检测病原体核糖核酸非扩增定性检测病原体核糖核酸非扩增定性检测病原体核糖核酸非扩增定性检测病原体核糖核酸非扩增定性检测病原体核糖核酸非扩增定性检测病原体核糖核酸非扩增定性检测乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸扩增定乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸扩增定乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸扩增定乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸扩增定性检测性检测性检测性检测乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸扩增定乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸扩增定乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸扩增定乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸扩增定量检测量检测量检测量检测乙型肝炎病毒基因分型检测乙型肝炎病毒基因分型检测乙型肝炎病毒基因分型检测乙型肝炎病毒基因分型检测乙型肝炎病毒区变异检测乙型肝炎病毒区变异检测乙型肝炎病毒区变异检测乙型肝炎病毒区变异检测乙型肝炎病毒基因变异检测乙型肝炎病毒基因变异检测乙型肝炎病毒基因变异检测乙型肝炎病毒基因变异检测丙型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检丙型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检丙型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检丙型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检测测测测丙型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检丙型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检丙型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检丙型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检测测测测丙型肝炎病毒基因分型检测丙型肝炎病毒基因分型检测丙型肝炎病毒基因分型检测丙型肝炎病毒基因分型检测丁型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检丁型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检丁型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检丁型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检测测测测丁型肝炎病毒核糖核酸扩增定量检丁型肝炎病毒核糖核酸扩增定量检丁型肝炎病毒核糖核酸扩增定量检丁型肝炎病毒核糖核酸扩增定量检测测测测戊型肝炎病毒核糖核酸扩增定量检戊型肝炎病毒核糖核酸扩增定量检戊型肝炎病毒核糖核酸扩增定量检戊型肝炎病毒核糖核酸扩增定量检测测测测庚型肝炎病毒核糖核酸扩增检测庚型肝炎病毒核糖核酸扩增检测庚型肝炎病毒核糖核酸扩增检测庚型肝炎病毒核糖核酸扩增检测 核糖核酸扩增定性检测核糖核酸扩增定性检测核糖核酸扩增定性检测核糖核酸扩增定性检测临床分子生物学及细胞遗传学检验 核糖核酸扩增定量检测 临床分子生物学及细胞遗传学检验 核糖核酸扩增定量检测 疾病相关分子生物学及细胞遗传检验 染色体核型分析 包括外周血染色体等；标本类型：各种标本；标本采集、签收、处理，经培养、收获、制片、染色等步骤，分析染色体核型，审核结果，录入实验室信息或人工登记，发放报告；按规定处理废弃物；接受临床相关咨询。脆性染色体核型分析。姊妹染色体核型分析 肝豆状核变性基因分析 血友病基因分析。脆性综合基因分析 染色体性别基因分析 脱氧核糖核酸倍体分析 血细胞荧光原位杂交分析 包括、和、等染色体。未经处理的羊水细胞荧光原位杂交分析；染色体荧光原位杂交分析 羊水细胞染色体分析 绒毛组织染色体分析 染色体分析 白血病融合基因检测 单基因遗传病基因突变检查 可检测线粒体基因、地中海贫血基因、地中海贫血基因、丙酮酸尿症基因等。标本类型：各种标本；标本采集、签收、处理（根据标本类型的不同进行相应的前处理），提取基因组，与质控品、阴阳性对照和内参同时扩增，分析扩增产物或杂交或测序等，进行基因分析，判断并审核结果，录入实验室信息或人工登记，发放报告；按规定处理废弃物；接受临床相关咨询。遗传性耳聋基因检测 可检测基因、基因、基因、线粒体基因等。标本类型：各种标本；标本采集、签收、处理（根据标本类型的不同进行相应的前处理），提取基因组，与质控品、阴阳性对照和内参同时扩增，分析扩增产物或杂交或测序等，进行基因分析，判断并审核结果，录入实验室信息或人工登记，发放报告；按规定处理废弃物；接受临床相关咨询。疾病相关分子生物学及细胞遗传检验 染色体核型分析 包括外周疾病相关分子生物学及细胞遗传检验 染色体核型分析 包括外周 乙型肝炎耐药基因检测 标本类型：各种标本；标本采集、签收、处理（根据标本类型的不同进行相应的前处理），提取基因组，与质控品、阴阳性对照和内参同时扩增，分析扩增产物或杂交或测序等，进行基因分析，判断并审核结果，录入实验室信息或人工登记，发放报告；按规定处理废弃物；接受临床相关咨询。结核分支杆菌耐药基因检测 标本类型：各种标本；标本采集、签收、处理（根据标本类型的不同进行相应的前处理），提取基因组，与质控品、阴阳性对照和内参同时扩增，分析扩增产物或杂交或测序等，进行基因分析，判断并审核结果，录入实验室信息或人工登记，发放报告；按规定处理废弃物；接受临床相关咨询。万古霉素耐药基因检测 标本类型：各种标本；标本采集、签收、处理（根据标本类型的不同进行相应的前处理），提取基因组，与质控品、阴阳性对照和内参同时扩增，分析扩增产物或杂交或测序等，进行基因分析，判断并审核结果，录入实验室信息或人工登记，发放报告；按规定处理废弃物；接受临床相关咨询。耐甲氧西林葡萄球菌耐药基因检测 标本类型：各种标本；标本采集、签收、处理（根据标本类型的不同进行相应的前处理），提取基因组，与质控品、阴阳性对照和内参同时扩增，分析扩增产物或杂交或测序等，进行基因分析，判断并审核结果，录入实验室信息或人工登记，发放报告；按规定处理废弃物；接受临床相关咨询。用药指导的分子生物学检验 化学药物用药指导的基因检测 可检测、基因等。本采集、签收、处理（根据标本类型的不同进行相应的前处理），提取基因组，与质控品、阴阳性对照和内参同时扩增，分析扩增产物或杂交或测序等，进行基因分析，判断并审核结果，录入实验室信息或人工登记，发放报告；按规定处理废弃物；接受临床相关咨询。病原体用药指导的基因检测 标本类型：各种标本；标本采集、签收、处理（根据标本类型的不同进行相应的前处理），提取基因组，与质控品、阴阳性对照和内参同时扩增，分析扩增产物或杂交或测序等，进行基因分析，判断并审核结果。基因表达水平对肿瘤预后的判断 标本类型：组织；芯片上作为判断标准的全部基因作为一次检测。基因表达水平对肿瘤药物敏感性的判断 标本类型：组织；用芯片扫描仪进行检测。肿瘤细胞化疗药物敏感试验 标本类型：血液、骨髓、分离淋巴细胞；制备肿瘤细胞悬液，调整细胞浓度，接种孔板，分别加抗癌药物，设置空白对照组，孵育、培养，离心，去上清液，加试剂震荡，用酶标仪测吸光度。联合药物敏感试验 样本类型：分离菌株；制备菌悬液，加入包括不同浓度药物定量反应液，孵育，人工判读细菌生长结果。乙型肝炎耐药基因检测 标本类型：各种标本；标本采集、签 乙型肝炎耐药基因检测 标本类型：各种标本；标本采集、签o其他o 载脂蛋白基因分型o 标本类型：各种标本；标本采集、签收、处理（根据标本类型的不同进行相应的前处理），提取基因组，与质控品、阴阳性对照和内参同时扩增，分析扩增产物或杂交或测序等，进行基因分析，判断并审核结果，录入实验室信息或人工登记，发放报告；按规定处理废弃物；接受临床相关咨询。其他其他其他技术平台o技术o测序技术o基因芯片技术技术平台技术技术平台技术技术平台技术疾病诊断与个体化医疗o常见肿瘤的分子诊断与个体化医疗（徐剑锋）o染色体微缺失、微重复综合征的分子诊断（邬玲仟）o肝豆核变性的分子诊断与个体化医疗（崔天盆）o线粒体病的分子诊断与个体化医疗（郑红云）o糖尿病的分子诊断与个体化医疗（包安裕）疾病诊断与个体化医疗常见肿瘤的分子诊断与个体化医疗（徐剑锋）疾病诊断与个体化医疗常见肿瘤的分子诊断与个体化医疗（徐剑锋）疾病诊断与个体化医疗o心血管疾病的分子诊断与个体化医疗（吕永楠）o脑胶质瘤的分子诊断与个体化医疗（童永清）o血液肿瘤的分子诊断与个体化医疗（吴薇）o病毒性肝炎的分子诊断与个体化医疗（汪明）疾病诊断与个体化医疗心血管疾病的分子诊断与个体化医疗（吕永楠疾病诊断与个体化医疗心血管疾病的分子诊断与个体化医疗（吕永楠Thank you for your attention Thank you for your attention Thank you for your attention T个人收集整理，仅供交流学习！个人收集整理，仅供交流学习！个人收集整理，仅供交流学习！个人收集整理，仅供交流学习！临床分子诊断与个体化治疗临床分子诊断与个体化治疗临床分子诊断与个体化治疗临床分子诊断与个体化治疗分子诊断o狭义分子诊断：应用分子生物学方法检测患者体内狭义分子诊断：应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出诊断的技遗传物质的结构或表达水平的变化而做出诊断的技术，称为分子诊断，包括肿瘤分子诊断、传染病分术，称为分子诊断，包括肿瘤分子诊断、传染病分子诊断、产前诊断等。子诊断、产前诊断等。o广义分子诊断：指应用分子生物学方法，对受检者广义分子诊断：指应用分子生物学方法，对受检者体内各类生物分子（包括、蛋白质等）进行定性体内各类生物分子（包括、蛋白质等）进行定性和定量分析，确定其结构或表达水平，从而为个性和定量分析，确定其结构或表达水平，从而为个性化预防、治疗提供依据的一种诊断技术，包括肿瘤化预防、治疗提供依据的一种诊断技术，包括肿瘤分子诊断、传染病分子诊断、产前诊断、单基因诊分子诊断、传染病分子诊断、产前诊断、单基因诊断、易感基因检测以及天赋基因检测等。断、易感基因检测以及天赋基因检测等。分子诊断狭义分子诊断：应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质分子诊断狭义分子诊断：应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质国内回顾o年技术在国内开始用于临床检测o年代中期:假阴性假阳性?,引发思考o年:卫生部科研课题o年月日:临床实验室管理专家咨询会o年月日:卫生部下发国内回顾年技术在国内开始用于临床检测国内回顾年技术在国内开始用于临床检测国内回顾年技术在国内开始国内回顾o年月日:,针对临床开展检验的问题,达成八点意见.o年月日:(在北京卫生部临床检验中心举办.o年月日:卫生部下发(卫医发号)国内回顾年月日:,针对临床 国内回顾年月日:,针对临床年:医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法（卫办医政发【】号）医疗机构临床基因扩增检验室工作导则（卫办医政发【】号）年:年:年:o截止到年月，全国按照所制定的标准通过验收的临床基因扩增检验实验室共余家。采用所编写的培训教材和培训模式共举办了培训班多期，培训实验室技术人员多人。涉及全国个省、直辖市和自治区。截止到年月，全国按照所制定的标准通过验收的临床基因扩增检验实截止到年月，全国按照所制定的标准通过验收的临床基因扩增检验实目前国内临床分子诊断现状o绝大部分用于病原体核酸检测o较少部分用于遗传病的产前诊断o个体化用药的分子诊断正在兴起目前国内临床分子诊断现状绝大部分用于病原体核酸检测目前国内临床分子诊断现状绝大部分用于病原体核酸检测目前国内临一些常见的认识误区o临床实验室检验科o基因（遗传携带、突变等）与病原体核酸检测完全不同o临床检验在病理科、药剂科或肿瘤科做，不属于临床检验管理？o必须达成一点共识：实验不管在哪做，都属于检验管理，必须有严格的质量控制。一些常见的认识误区临床实验室检验科一些常见的认识误区临床实验室检验科一些常见的认识误区临床实验问题与思考o问题：o应用o实验室分区o质量管理：分析前，分析中，分析后o人员：（医生、实验室技术人员）：均需“洗脑”严格的培训o出现问题，即分析问题产生的原因，采取措施加以改进o质理管理的习惯养成需要时间。问题与思考问题：问题与思考问题：问题与思考问题：几个策略比较o家族病史研究与基因研究相比较o说法不一，孰优孰劣？各有所长。o肿瘤早期诊断带来的真正收益有没有我们所希望的那么大？几个策略比较家族病史研究与基因研究相比较几个策略比较家族病史研究与基因研究相比较几个策略比较家族病史 o o 。o 国家自然科学基金委医学部主任、国家肝癌科学中心主任王红阳院士，国家自然科学基金委医 国家自然科学基金委医中国肿瘤治疗现状o治愈率,五年生存率。低于欧美国家、,低于日本和o主要原因：o ）早期诊断低o ）缺乏规范化治疗o ）经济状况差华南肿瘤国家重点实验室，中山大学肿瘤防治中心钱朝南教授中国肿瘤治疗现状治愈率,五年生存率。低于欧美国家、,低于中国肿瘤治疗现状治愈率、,预期治愈率可能大于基因多态性与丙型肝炎治疗及预后基因多态性结果判断邻近基因，基因多态性与丙型肝炎治疗及预后基因多态性结果判断邻近基因，个性化检测的局限性o一些疾病是由一个或多个基因突变引起o基因检测方法确实能对这些疾病的患病风险、确诊和治疗起指导作用o大多数疾病发生、发展及预后可能涉及更多的基因以及这些基因和环境因素相互作用o仅通过基因检测盒基因表达谱的检测有很大局限性个性化检测的局限性一些疾病是由一个或多个基因突变引起个性化检测的局限性一些疾病是由一个或多个基因突变引起个性化检：分子检测有关的主要质控要求o对于每一个检测系统，实验室由此又控制程序的责任监控整个分析过程的准确性和精密度。(（）)控制程序必须是：o检出即时误差由检测系统故障、不利于环境和操作者能力导致(（）（）)o监控检测性能的准确性和精密度检测系统能和环境的改变以及操作者的能力都可能会影响检测性能。o实验室必须确定使用检测物质的数量、类型和频率，如果适用，由实验室验证或建立性能规范(（）)o如果实验室引进了未经认可或批准的检测系统包括自主研制的方法在报告病人检测据结果前，必须建立检测系统的性能规范，如果适用，包括下面的性能特征：准确性，精密度，分析灵敏性，分析特异性，包括干扰物质。检测系统对检测结果的可报告区间，参考区间（正常值），和检测性能要求的其他性能特征。(（）（）)o包括提取过程中的检测系统包括两种质控物质，其中之一可以检出提取过程的错误。(（）（）（）)o每一扩增过程，包括两种质控材料，如果反应的抑制是假阴性结果的重要来源一个质控材料能够检出该抑制作用。(（）（）（）)：分子检测有关的主要质控要求对于每一个检测系统，实验室由此又：分子检测有关的主要质控要求对于每一个检测系统，实验室由此又国际相关机构的计划o 美国病理家协会o 美国疾病预防控制中心（基因检测质量控制物计划）o 分子诊断的质量控制o 欧洲分子遗传实验质控网o 欧洲重要病毒性疾病诊断网o 西班牙室间质评计划o 欧盟质量控制一致行动（现在被称作分子诊断的质量控制）o 意大利肿瘤标志物质量保证网o 英国国家质量保证计划国际相关机构的计划 美国病理家协会国际相关机构的计划 美国病理家协会国际相关机构的计划 美国病临床基因扩增实验室的质量控制（一）o实验室各种常规工作的规章制度o实验室技术人员的生物安全制度和保护措施o防止实验室交叉污染的实验（每月一次）o实验室的清洁和消毒制度（每周次）o实验室的原始数据、报告单的归档和信息保密制度o实验室专业人员的培训和考核制度o实验室结果差错的记录和纠正措施o计算机的系统维护和管理制度临床基因扩增实验室的质量控制（一）实验室各种常规工作的规章制临床基因扩增实验室的质量控制（一）实验室各种常规工作的规章制临床基因扩增实验室的质量控制（二）o样本接收和拒收标准：抗凝剂，采集时间量，病史。o接收标本必须有专用的登记表，并核对样本登记表中的所有信息，人复核和签字。o每批样本核酸提取的过程中加入质控标本以保证标本处理的过程中的正确性，同时建立用于不同技术平台的标准化的浓度范围。o定量检测的操作过程包括个不同浓度的对照物，以及阴性和阳性对照。o样本的保存和存储（和 冰箱）临床基因扩增实验室的质量控制（二）样本接收和拒收标准：抗凝剂临床基因扩增实验室的质量控制（二）样本接收和拒收标准：抗凝剂临床基因扩增实验室质量控制（三）o室内质控标本的来源：包括参加国内和国际质控标本，细胞株和已知实验结果的样本。o在每批实验中和每个技术平台上均加入了质控样本，从样本抽提，基因扩增，杂交和测序已知跟踪到整个实验结果，每次实验结果分析后有专门的质控报告。o实验室的技术人员每一个月，在每一个技术平台上都有一次盲样样本的质控实验，并以此评价技术人员的实验技能。临床基因扩增实验室质量控制（三）室内质控标本的来源：包括参加临床基因扩增实验室质量控制（三）室内质控标本的来源：包括参加分析的有效性p准确性p与参考方法比较p设定值的方法p精密度再现性p重复性：利用分子检测方法和同一个仪器对单个样本进行重复性研究。p再现性：再现性研究评估天与天、操作与操作间的精密度、如果使用多个仪器，要评估仪器与仪器之间的再现性；如果在多个实验室开展检测，也要评估不同实验室间的再现性。p靠近临床和整个分析检测区间内的性能p分析的线性、回收率和高剂量钩子效应p检出限值和定量限值（在高和低的范围内）p分析特异性（交叉反应，干扰）p基质效应p影响分析结果的分析前因素p分析输出（读数区间或阴阳性）p 分析的有效性准确性分析的有效性准确性分析的有效性准确性临床有效性和临床有用性o临床有效性：检测特性（敏感性、特异性、预测值和拟然比）o临床有用性：利用检测结果可以获得有效治疗或其他具体的临床获益o筛选有症状个体的检测：基因突变帕金森症。o用于诊断和监控的检测：由 研制的实验室自制检测。该检测用于确认活动性丙肝病毒（）感染、监控治疗反应和确认感染的消退。o确定预后和指导治疗的检测：利用实时荧光定量检测乳腺癌肿瘤组织样本中个基因的表达水平。o调整用药剂量的检测：指导华法林剂量的基因检测基因（编码细胞色素）和（编码维生素环氧化物还原酶复合物亚单位）的多态性。临床有效性和临床有用性临床有效性：检测特性（敏感性、特异性、临床有效性和临床有用性临床有效性：检测特性（敏感性、特异性、o病理说明：.包括“尸体病理学诊断”、“细胞病理学检查与诊断”、“组织病理学检查与诊断”、“分子病理学技术与诊断”、“特染和免疫组织化学染色与诊断”、“电子显微镜技术与诊断”和“其他”项目七个部分，共计项。o检验说明：.包括“临床血液学检验”、“临床体液检验”、“临床化学检验”、“临床免疫学检验”、“临床微生物与寄生虫学检验”和“临床分子生物学检验”项目六个部分，共计项。.组织器官移植所需的各项检验（如检查等）列入“临床血液学检验”类的“血型、输血及人类组织相关性抗原检验”类中。.”实验室诊断”中的项目不含静脉采血，需单独收费，但微量采血管（指尖采血、耳垂采血）包含在各检验项目中，不得单独收费。病理说明：.包括“尸体病理学诊断”、“细胞病理学检查与诊断”病理说明：.包括“尸体病理学诊断”、“细胞病理学检查与诊断”（四）分子病理学技术与诊断o 组织部细胞原位杂交检查诊断 石蜡包埋组织，新鲜冷冻组织，细胞涂片，组织切片机切片，进行二甲苯脱蜡，系列乙醇水化，微波炉、高压锅及蛋白酶处理，标记探针杂交反应，洗涤，酶或亲和物结合反应，显色，判读结果，含上述过程中所产生的废液、废物的处理。o 组织部细胞荧光原位杂交检查诊断 荧光素标记探针杂交反应（一种探针）。o 组织部细胞多色荧光原位杂交检查诊断 荧光素标记探针杂交反应（二种或以上探针）.o 组织部细胞荧光原位杂交技术计量分析诊断 荧光素标记探针杂交反应（二种或以上探针），图像定量分析。o 组织部细胞原位脱氧核糖核酸（）多聚酶链式反应检查诊断 原位反应，亲和物结合，显色，复染，观察，诊断。o 组织部细胞原位核糖核酸（）多聚酶链式反应检查诊断 原位逆转录反应，亲和物结合，显色，复染，观察，诊断。o 组织部细胞荧光定量脱氧核糖核酸（）多聚酶链式反应检查诊断 甲醛固定组织，石蜡包埋组织，新鲜或冷冻组织，离心收集细胞；组织粉萃机匀浆化，组织裂解，经反复离心及相应化学试剂去除蛋白，回收，于荧光仪进行荧光素反应，分析结果，诊断。o 组织部细胞荧光定量核糖核酸（）多聚酶链式反应检查诊断 回收，于于荧光仪进行荧光素逆转录反应，分析结果，诊断。o 肿瘤组织脱氧核糖核酸（）测序 反应产物琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，产物纯化，测序反应，于测序仪分析，观察结果，诊断。甲醛固定组织，石蜡包埋组织，新鲜或冷冻组织，血液或体液的处理，提取，反应及最后的测序反应纯化。（四）分子病理学技术与诊断 组织部细胞原位杂交检查诊断 （四）分子病理学技术与诊断 组织部细胞原位杂交检查诊断 临床分子生物学及细胞遗传学检验u 核糖核酸扩增定量检测u 核糖核酸非扩增定性检测u分枝杆菌菌种鉴定u结核非结核分枝杆菌核酸检测u巨细胞病毒脱氧核糖核酸扩增定性检测u巨细胞病毒脱氧核糖核酸扩增定量检测u多瘤病毒脱氧核糖核酸扩增定性检测u多瘤病毒脱氧核糖核酸扩增定量检测u病毒脱氧核糖核酸扩增定性检测u病毒脱氧核糖核酸扩增定量检测u细小病毒脱氧核糖核酸非扩增定性检测u细小病毒脱氧核糖核酸非扩增定量检测u腺病毒脱氧核糖核酸扩增定性检测u腺病毒脱氧核糖核酸扩增定量检测u淋球菌脱氧核糖核酸扩增检测u沙眼衣原体脱氧核糖核酸扩增检测u人乳头瘤病毒脱氧核糖核酸扩增检测u人乳头瘤病毒脱氧核糖核酸非扩增定性检测u人乳头瘤病毒基因分型检测u流感病毒核糖核酸检测 .感染性疾病分子生物学检验感染性疾病分子生物学检验感染性疾病分子生物学检验感染性疾病分子生物学检验病原体脱氧核糖核酸扩增定性检测病原体脱氧核糖核酸扩增定性检测病原体脱氧核糖核酸扩增定性检测病原体脱氧核糖核酸扩增定性检测病原体脱氧核糖核酸扩增定量检测病原体脱氧核糖核酸扩增定量检测病原体脱氧核糖核酸扩增定量检测病原体脱氧核糖核酸扩增定量检测病原体脱氧核糖核酸非扩增定性检病原体脱氧核糖核酸非扩增定性检病原体脱氧核糖核酸非扩增定性检病原体脱氧核糖核酸非扩增定性检测测测测病原体脱氧核糖核酸非扩增定性检病原体脱氧核糖核酸非扩增定性检病原体脱氧核糖核酸非扩增定性检病原体脱氧核糖核酸非扩增定性检测测测测病原体核糖核酸扩增定性检测病原体核糖核酸扩增定性检测病原体核糖核酸扩增定性检测病原体核糖核酸扩增定性检测病原体核糖核酸扩增定量检测病原体核糖核酸扩增定量检测病原体核糖核酸扩增定量检测病原体核糖核酸扩增定量检测病原体核糖核酸非扩增定性检测病原体核糖核酸非扩增定性检测病原体核糖核酸非扩增定性检测病原体核糖核酸非扩增定性检测病原体核糖核酸非扩增定性检测病原体核糖核酸非扩增定性检测病原体核糖核酸非扩增定性检测病原体核糖核酸非扩增定性检测乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸扩增定乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸扩增定乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸扩增定乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸扩增定性检测性检测性检测性检测乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸扩增定乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸扩增定乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸扩增定乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸扩增定量检测量检测量检测量检测乙型肝炎病毒基因分型检测乙型肝炎病毒基因分型检测乙型肝炎病毒基因分型检测乙型肝炎病毒基因分型检测乙型肝炎病毒区变异检测乙型肝炎病毒区变异检测乙型肝炎病毒区变异检测乙型肝炎病毒区变异检测乙型肝炎病毒基因变异检测乙型肝炎病毒基因变异检测乙型肝炎病毒基因变异检测乙型肝炎病毒基因变异检测丙型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检丙型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检丙型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检丙型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检测测测测丙型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检丙型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检丙型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检丙型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检测测测测丙型肝炎病毒基因分型检测丙型肝炎病毒基因分型检测丙型肝炎病毒基因分型检测丙型肝炎病毒基因分型检测丁型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检丁型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检丁型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检丁型肝炎病毒核糖核酸扩增定性检测测测测丁型肝炎病毒核糖核酸扩增定量检丁型肝炎病毒核糖核酸扩增定量检丁型肝炎病毒核糖核酸扩增定量检丁型肝炎病毒核糖核酸扩增定量检测测测测戊型肝炎病毒核糖核酸扩增定量检戊型肝炎病毒核糖核酸扩增定量检戊型肝炎病毒核糖核酸扩增定量检戊型肝炎病毒核糖核酸扩增定量检测测测测庚型肝炎病毒核糖核酸扩增检测庚型肝炎病毒核糖核酸扩增检测庚型肝炎病毒核糖核酸扩增检测庚型肝炎病毒核糖核酸扩增检测 核糖核酸扩增定性检测核糖核酸扩增定性检测核糖核酸扩增定性检测核糖核酸扩增定性检测临床分子生物学及细胞遗传学检验 核糖核酸扩增定量检测 临床分子生物学及细胞遗传学检验 核糖核酸扩增定量检测 疾病相关分子生物学及细胞遗传检验 染色体核型分析 包括外周血染色体等；标本类型：各种标本；标本采集、签收、处理，经培养、收获、制片、染色等步骤，分析染色体核型，审核结果，录入实验室信息或人工登记，发放报告；按规定处理废弃物；接受临床相关咨询。脆性染色体核型分析。姊妹染色体核型分析 肝豆状核变性基因分析 血友病基因分析。脆性综合基因分析 染色体性别基因分析 脱氧核糖核酸倍体分析 血细胞荧光原位杂交分析 包括、和、等染色体。未经处理的羊水细胞荧光原位杂交分析；染色体荧光原位杂交分析 羊水细胞染色体分析 绒毛组织染色体分析 染色体分析 白血病融合基因检测 单基因遗传病基因突变检查 可检测线粒体基因、地中海贫血基因、地中海贫血基因、丙酮酸尿症基因等。标本类型：各种标本；标本采集、签收、处理（根据标本类型的不同进行相应的前处理），提取基因组，与质控品、阴阳性对照和内参同时扩增，分析扩增产物或杂交或测序等，进行基因分析，判断并审核结果，录入实验室信息或人工登记，发放报告；按规定处理废弃物；接受临床相关咨询。遗传性耳聋基因检测 可检测基因、基因、基因、线粒体基因等。标本类型：各种标本；标本采集、签收、处理（根据标本类型的不同进行相应的前处理），提取基因组，与质控品、阴阳性对照和内参同时扩增，分析扩增产物或杂交或测序等，进行基因分析，判断并审核结果，录入实验室信息或人工登记，发放报告；按规定处理废弃物；接受临床相关咨询。疾病相关分子生物学及细胞遗传检验 染色体核型分析 包括外周疾病相关分子生物学及细胞遗传检验 染色体核型分析 包括外周 乙型肝炎耐药基因检测 标本类型：各种标本；标本采集、签收、处理（根据标本类型的不同进行相应的前处理），提取基因组，与质控品、阴阳性对照和内参同时扩增，分析扩增产物或杂交或测序等，进行基因分析，判断并审核结果，录入实验室信息或人工登记，发放报告；按规定处理废弃物；接受临床相关咨询。结核分支杆菌耐药基因检测 标本类型：各种标本；标本采集、签收、处理（根据标本类型的不同进行相应的前处理），提取基因组，与质控品、阴阳性对照和内参同时扩增，分析扩增产物或杂交或测序等，进行基因分析，判断并审核结果，录入实验室信息或人工登记，发放报告；按规定处理废弃物；接受临床相关咨询。万古霉素耐药基因检测 标本类型：各种标本；标本采集、签收、处理（根据标本类型的不同进行相应的前处理），提取基因组，与质控品、阴阳性对照和内参同时扩增，分析扩增产物或杂交或测序等，进行基因分析，判断并审核结果，录入实验室信息或人工登记，发放报告；按规定处理废弃物；接受临床相关咨询。耐甲氧西林葡萄球菌耐药基因检测 标本类型：各种标本；标本采集、签收、处理（根据标本类型的不同进行相应的前处理），提取基因组，与质控品、阴阳性对照和内参同时扩增，分析扩增产物或杂交或测序等，进行基因分析，判断并审核结果，录入实验室信息或人工登记，发放报告；按规定处理废弃物；接受临床相关咨询。用药指导的分子生物学检验 化学药物用药指导的基因检测 可检测、基因等。本采集、签收、处理（根据标本类型的不同进行相应的前处理），提取基因组，与质控品、阴阳性对照和内参同时扩增，分析扩增产物或杂交或测序等，进行基因分析，判断并审核结果，录入实验室信息或人工登记，发放报告；按规定处理废弃物；接受临床相关咨询。病原体用药指导的基因检测 标本类型：各种标本；标本采集、签收、处理（根据标本类型的不同进行相应的前处理），提取基因组，与质控品、阴阳性对照和内参同时扩增，分析扩增产物或杂交或测序等，进行基因分析，判断并审核结果。基因表达水平对肿瘤预后的判断 标本类型：组织；芯片上作为判断标准的全部基因作为一次检测。基因表达水平对肿瘤药物敏感性的判断 标本类型：组织；用芯片扫描仪进行检测。肿瘤细胞化疗药物敏感试验 标本类型：血液、骨髓、分离淋巴细胞；制备肿瘤细胞悬液，调整细胞浓度，接种孔板，分别加抗癌药物，设置空白对照组，孵育、培养，离心，去上清液，加试剂震荡，用酶标仪测吸光度。联合药物敏感试验 样本类型：分离菌株；制备菌悬液，加入包括不同浓度药物定量反应液，孵育，人工判读细菌生长结果。乙型肝炎耐药基因检测 标本类型：各种标本；标本采集、签 乙型肝炎耐药基因检测 标本类型：各种标本；标本采集、签o其他o 载脂蛋白基因分型o 标本类型：各种标本；标本采集、签收、处理（根据标本类型的不同进行相应的前处理），提取基因组，与质控品、阴阳性对照和内参同时扩增，分析扩增产物或杂交或测序等，进行基因分析，判断并审核结果，录入实验室信息或人工登记，发放报告；按规定处理废弃物；接受临床相关咨询。其他其他其他技术平台o技术o测序技术o基因芯片技术技术平台技术技术平台技术技术平台技术疾病诊断与个体化医疗o常见肿瘤的分子诊断与个体化医疗（徐剑锋）o染色体微缺失、微重复综合征的分子诊断（邬玲仟）o肝豆核变性的分子诊断与个体化医疗（崔天盆）o线粒体病的分子诊断与个体化医疗（郑红云）o糖尿病的分子诊断与个体化医疗（包安裕）疾病诊断与个体化医疗常见肿瘤的分子诊断与个体化医疗（徐剑锋）疾病诊断与个体化医疗常见肿瘤的分子诊断与个体化医疗（徐剑锋）疾病诊断与个体化医疗o心血管疾病的分子诊断与个体化医疗（吕永楠）o脑胶质瘤的分子诊断与个体化医疗（童永清）o血液肿瘤的分子诊断与个体化医疗（吴薇）o病毒性肝炎的分子诊断与个体化医疗（汪明）疾病诊断与个体化医疗心血管疾病的分子诊断与个体化医疗（吕永楠疾病诊断与个体化医疗心血管疾病的分子诊断与个体化医疗（吕永楠Thank you for your attention Thank you for your attention Thank you for your attention T个人收集整理，仅供交流学习！个人收集整理，仅供交流学习！个人收集整理，仅供交流学习！个人收集整理，仅供交流学习！